Name: Plaquierung von Herpes-simplex-Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Lernen Sie die Plaquierung von Herpes-simplex-Viren zur Quantifizierung viraler Titer. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifikation einzelner Infektionen und die Bewertung antiviraler Behandlungen.

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Wir danken unzähligen Studenten in unseren Laboren (PJD und BJM), die im Laufe der Jahre mit uns zusammengearbeitet haben, um diese Methoden zu verfeinern. Ein besonderer Dank geht an Stan Person, unter dessen Anleitung diese Methodik zuerst entwickelt wurde. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund und NIGMS Bridges to the Baccalaureate Grant 5R25GM058264 unterstützt. Dieser Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health dar.

Alle Verfahren mit den Vero-Zellen und lebenden Herpesviren wurden vom Towson University Institutional Biosafety Committee genehmigt. Ein verallgemeinertes Schema dieser Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Aussaat der Vero-Zellen
<ol><li>Trypsinisieren Sie am Tag vor Beginn des Plaque-Assays Vero-Zellen und resuspendieren Sie sie in Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) und ergänzen Sie sie gemäß der Standard-Zellkulturmethodik19. Resuspendieren Sie die trypsinisierten Zellen in 10 ml DMEM pro T-75-Kolben der konfluenten Vero-Zellen (~ 107 Zellen). HINWEIS: DMEM wird für Plaque-Assays anstelle von Alpha-MEM verwendet, da es die Zellwachstumsrate leicht verlangsamt und bessere Plaque-Assay-Ergebnisse begünstigt.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen nach der bevorzugten Methode (z. B. ein Standard-Hämozytometer mit Trypan Blue-Ausschluss)19.</li>
	<li>Samen Sie die Zellen bei 4 x 106 Zellen / Platte; Verwenden Sie für HSV-2 6-Well-Platten mit 2,5 ml DMEM (mit Nahrungsergänzungsmitteln) pro Well; und für HSV-1 verwenden Sie 12-Well-Platten mit 1,25 ml DMEM (mit Ergänzungen) pro Well. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte unabhängig von der verwendeten Platte konstant sein, obwohl die Größe der Vertiefungen für die Genauigkeit des Plaque-Assays von Bedeutung ist. Es ist wichtig, die Zellen gleichmäßig zu verteilen, was am effektivsten erreicht werden kann, indem die Platte hin und her bewegt wird, nicht kreisförmig.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C/5% CO2 in einem befeuchteten Inkubator wachsen. HINWEIS: Die Luftfeuchtigkeit wird mit einer Pfanne mit destilliertem Wasser, das ein Algizid enthält, im Boden des Inkubators aufrechterhalten.</li>
</ol>2. Verdünnung der Probe
<ol><li>Schließen Sie die Probenverdünnung und die Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab. ACHTUNG: HSV-1 und -2 sind für den Menschen infektiös und müssen unter ordnungsgemäßer Eindämmung der biologischen Sicherheit (BSL-2) gehandhabt werden. Bewahren Sie alle Materialien, die mit dem Virus in Berührung kommen, getrennt auf und desinfizieren Sie sie mit einem quartären Mittel bei einer Verdünnung von 1/256 (siehe Materialtabelle), Iodophor, Bleichmittel oder starkem ionischem Reinigungsmittel (z. B. SDB), bevor Sie sie aus der Biosicherheitskabine entfernen.</li>
	<li>Am Tag nach der Aussaat der Vero-Zellen verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, um sie in 1x PBS zu beflecken; Verwenden Sie typischerweise 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.</li>
	<li>Machen Sie diese Verdünnungen durch 10-4 (für niedrige Konzentrationen von Viren) oder durch 10-9 (für Erwartungen von Proben mit höherem Titer), wobei mindestens 1 ml jeder Probe für den Plaque-Assay selbst verbleiben.</li>
	<li>Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis (nicht länger als 1 h), bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen.</li>
</ol>3. Zugabe von Viren zu den Zellen
<ol><li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus einer oder zwei Vertiefungen mit der Pipette. HINWEIS: Verwenden Sie keinen Aspirator, da er zu viel Flüssigkeit aus der Zellmonoschicht entfernt und die Zellen austrocknet. Eine entscheidende Überlegung ist, sicherzustellen, dass die Zellmonoschicht während des gesamten Verlaufs des Experiments hydratisiert bleibt. Wenn die Zellen austrocknen, waschen sie im letzten Schritt die Platte ab und erzeugen unbrauchbare Daten. Verarbeiten Sie daher nur ein oder zwei Vertiefungen gleichzeitig, um diese Möglichkeit zu verringern.</li>
	<li>Fügen Sie die verdünnte Virusprobe (100-400 μL und 50-200 μL Virusprobe werden für 6-Well- bzw. 12-Well-Platten verwendet) vorsichtig zu jeder Monoschicht hinzu und fügen Sie die Tropfen an der Seite jedes Wells hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind. HINWEIS: Das Hinzufügen der Tropfen in die Mitte des Brunnens kann versehentlich Zellen vom Substrat abspalten.</li>
	<li>Schaukeln Sie die gesamte Platte vorsichtig von Hand, um sicherzustellen, dass das PBS, das das Virus enthält, die gesamte Monoschicht von Zellen in jedem Brunnen bedeckt, und legen Sie die Platte dann bei 37 ° C in einen CO2-Inkubator, damit das Virus adsorbieren kann.</li>
	<li>Entfernen Sie alle 10 Minuten innerhalb von 1 Stunde die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig erneut, um das Virus gleichmäßiger über jeden Brunnen zu verteilen, und legen Sie sie dann wieder in den Inkubator. HINWEIS: Jedes Experiment bestimmt die Anzahl der Replikate und welche Verdünnungen verwendet werden. Die Präferenz des Lesers diktiert diese Entscheidung.</li>
	<li>Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe aus den Vertiefungen mit 1000 μL Pipettenspitzen und legen Sie sie in ein Abfallbecherglas. HINWEIS: Auch dieses Verfahren wird mit nur einem oder zwei Vertiefungen gleichzeitig durchgeführt, um die Hydratation der Zellmonoschicht aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>2,5 ml eines Methylcellulose-Overlays platzieren (5% Methylcellulose w/w in 100 ml PBS auflösen, 15 min bei 121 °C und 15 psi in einem Flüssigkeitszyklus autoklavieren, dann 375 ml DMEM plus 25 mL FBS hinzufügen).</li>
	<li>Sobald eine ganze Platte eine Überlagerung enthält, legen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um das Wachstum für zwei Tage zu ermöglichen. HINWEIS: Wenn das Virus und die Zellen drei Tage lang wachsen dürfen, selbst in DMEM plus Nahrungsergänzungsmitteln, kann dies zu einem erheblichen Verlust von Zellen in der Monoschicht führen, wodurch die endgültigen Daten beeinträchtigt werden.</li>
	<li>Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen.</li>
</ol>4. Färbung für Plaketten
<ol><li>Nach der zweitägigen Inkubation entfernen Sie das Methylcellulose-Overlay durch eine Pipette, wieder ein oder zwei Vertiefungen auf einmal, und legen Sie es in ein Abfallbecherglas.</li>
	<li>Fügen Sie ~ 2 ml 1% Kristallviolett (siehe Materialtabelle) in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu, um die Plaques zu färben. HINWEIS: Es ist nicht unbedingt erforderlich, jeden letzten Tropfen des Overlays zu entfernen.</li>
	<li>Bebrüten Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 min bei 37 ° C. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas wie oben in Schritt 3.8.</li>
	<li>Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist. HINWEIS: Ein sanfter Wasserstrahl ist nicht kräftig genug; Der volle Druck einer Laborspüle ist erforderlich.</li>
	<li>Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt.</li>
	<li>Lassen Sie die Platten über Nacht kopfüber trocknen, danach können die einzelnen Plaques gezählt werden.</li>
</ol>5. Plaques zählen und Virustiter bestimmen
<ol><li>Unabhängig vom Ansatz (siehe HINWEIS unten) multiplizieren Sie die Anzahl der Plaques mit dem Verdünnungsfaktor (z. B. wenn die Plaques in der 10-4-Vertiefung gezählt würden, dann würde die Anzahl der Plaques mit 104 multipliziert werden). HINWEIS: Obwohl das Zählen innerhalb eines Bereichs von 10-100 Plaques nützlich ist5, ist das Zählen von Bohrlöchern mit 30-300 Plaques etwas zuverlässiger und berücksichtigt ungefähr 1/2-Log-Verdünnungen anstelle von Full-Log-Verdünnungen.</li>
	<li>Teilen Sie diese Zahl durch das Inokulumvolumen (wie oben in Schritt 3.2) und durchschnittlichen Sie alle Vertiefungen, die Plaques innerhalb des angegebenen Bereichs aufweisen, um den genauesten Titer von HSV in der ursprünglichen Probe zu erhalten.</li>
	<li>Führen Sie die Berechnungen in den Schritten 5.3.1 bis 5.3.5 unter Berücksichtigung der Verwendung von Scheindaten in Tabelle 1 durch.<ol>
<li>Betrachten Sie nur Vertiefungen mit 30-300 Plaketten (Schritt 5.1). Verwenden Sie daher in Tabelle 1 nur die Spalte 10 bis 5 für die Replikate 1, 2 und 3.</li>
		<li>Nehmen Sie die Anzahl der Plaques bei der gegebenen Verdünnung und multiplizieren Sie sie mit dem Kehrwert des Verdünnungsfaktors. Daher geht die 10-5-Säule von Probe 1 von 81 Plaques bei der 10-5-Verdünnung auf 81 Plaques mal 105.</li>
		<li>Dann teilen Sie diese Zahl durch das Volumen (in ml) der Virusverdünnung, die den Zellen in diesem Brunnen hinzugefügt wird. Unter der Annahme, dass die Daten zu HSV-1 in Tabelle 1 von einer 12-Well-Platte stammen, wären 0,2 ml die am besten geeignete Messung. Daher ergibt die Berechnung aus Schritt 5.3.2 81 x 105 geteilt durch 0,2 ml oder 4,0 x 107 PFU/ml von HSV-1.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle nützlichen Daten und den Durchschnitt. Daher ist die Berechnung in 5.3.2-5.3.3 an allen Proben in der Spalte 10-5 durchzuführen, vorausgesetzt, sie stammen aus derselben Virusprobe und die biologischen Replikate wurden durchgeführt, um die genaueste Titermessung zu erhalten. Im Falle von Tabelle 1 ergeben sich durchschnittlich 4,0 x 107, 2,1 x 107 und 2,6 x 107 PFU/ml, um einen endgültigen durchschnittlichen Titer von 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/ml für diese Probe zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Während Plaque-Assays fast so alt sind wie die Zellkultur von Säugetieren selbst, scheint es, dass jedes Labor seine eigenen Protokolle hat, um diesen grundlegenden Assay auszuführen5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 <...

Die Anfänge der Virus-Plaque-Assays gehen auf die ersten Entdeckungen von Viren in den 1890er Jahren zurück1. Das Tabakmosaikvirus wurde zunächst isoliert und auf Tabakblättern weitergegeben, wo einzelne Infektionsflecken erkannt und quantifiziert werden konnten, die von einer einzigen, lebenden Virusentität stammten2, die später als Virion identifiziert wurde2. Spätere bahnbrechende Studien mit Bakterien und Bakteriophagen perfektionierten die Techniken, die verwendet wurden, um diese Viren zu beflecken, einschließlich Bakterien in der Mid-Log-Phase des Wachstums, serielle Verdünnung von Bakteriophagenproben und Top-Agar mit anschließender Visualisierung von buchstäblichen Löchern (benannte Plaques) im Bakterienrasen3.
Das Plaquieren von Tierviren hinkte der spannenden Forschung mit Bakteriophagen hinterher, vor allem, weil die Methoden, die für die Züchtung von Säugetierzellen in Kultur erforderlich sind, erst in den 1940er Jahren entwickelt wurden4. Das Aufkommen von wachsenden murinen Zellen in Abwesenheit des gesamten Wirtsorganismus4 brachte jedoch eine neue Ära in der Fähigkeit hervor, Viren zu kultivieren und zu zählen. Diese Arbeiten wurden für die Vermehrung und Quantifizierung des Western Equine Encephalomyelitis-Virus in Hühnerzellen und des Poliovirus in menschlichen Zellen erweitert5,6. Als sich der Bereich der kultivierbaren Säugetierzellen ausdehnte, gab die Schar verschiedener Wirtszellen für verschiedene Virusinfektionen der Welt ein Füllhorn von Möglichkeiten, alle Arten von Viren zu untersuchen7. Dazu gehörte die Vermehrung und Quantifizierung von humanen Herpesviren, insbesondere Herpes-simplex-Viren-1 (HSV-1) und -2 (HSV-2), die mukokutane Läsionen verursachen8. Wichtig ist, dass alle Plaque-Assays von der Existenz lebender Virionen abhängig sind, die in einer Probe rezeptorvermittelt in Wirtszellen eindringen können9. Unabhängig von der Allgegenwart und Vielzahl von Publikationen zur Durchführung von Plaque-Assays5,10,11,12,13,14,15,16 sind diese Methoden für HSV-1/-2 eine Mischung aus Kunst und Wissenschaft; Man kann den Assay nicht ohne angemessene Aufmerksamkeit für jedes Detail im Protokoll durchführen, noch kann man einen erfolgreichen Assay ohne ein kritisches Auge für Subtilität im Prozess durchführen. Dieses Manuskript zeigt eine der konsistentesten reproduzierbaren Methoden für HSV-1/-2-Plaque-Assays, mit präzisen Details zur Kunst des Assays, die selten diskutiert werden.
Dieses aktuelle Protokoll erhält zuverlässig lebende plaquebildende Einheiten (PFU) für HSV-1 und -2. Die besten Ergebnisse werden unter Verwendung von Vero-Zellen (transformierte Nierenepithelzellen des afrikanischen grünen Affen) bei niedriger Passage (unter Passage Nummer 155) erzielt und routinemäßig in alpha-MEM17 gezüchtet, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), L-Alanyl-L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen Mischung18. Vero-Zellen werden in diesem Medium standardmäßig zwei- bis dreimal pro Woche mit einer 1/5-Verdünnung jedes Mal vermehrt.

<table><tbody><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Lonza</td><td>12169F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum/Antimykotikum</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Kristallviolett</td><td>Alfa Aesar</td><td>B2193214</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS (kein Mg++ oder Ca++)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Millipore-Sigma</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanyl-L-Glutamin (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>GS07F161BA</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>27-441-0</td><td></td></tr><tr><td>Quartärer Wirkstoff (Lysol I.C.)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9645698</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Vero Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr></tbody></table>

plaquierung von herpes-simplex-viren

Plaquing of Herpes Simplex Viruses

Es gibt zahlreiche veröffentlichte Protokolle für das Plaquieren von Viren, einschließlich Referenzen in der Primärliteratur für die Methodik. Das Plaquieren von Viren kann jedoch schwierig durchzuführen sein, da es erforderlich ist, sich auf seine Spezifikationen und Verfeinerung zu konzentrieren. Es ist eine unglaublich herausfordernde Methode für neue Schüler, vor allem, weil sie akribische Aufmerksamkeit für die kleinsten Details erfordert. Diese Demonstration des Plaquing von Herpes-simplex-Viren sollte denjenigen helfen, die im Laufe der Jahre mit der Visualisierung der Methode, insbesondere ihrer Nuancen, zu kämpfen hatten. Während dieses Manuskript auf den gleichen Prinzipien der Standard-Plaquing-Methodik basiert, unterscheidet es sich dadurch, dass es eine detaillierte Beschreibung enthält, (1) wie Wirtszellen am besten gehandhabt werden, um Störungen während des Prozesses zu vermeiden, (2) ein nützlicheres viskoses Medium als Agarose, um die Diffusion von Virionen zu begrenzen, und (3) ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässig reproduzierbare Ergebnisse liefert. Darüber hinaus hilft das begleitende Video, die feineren Unterscheidungen im Prozess zu demonstrieren, die häufig übersehen werden, wenn andere in die Durchführung von Plaque-Assays eingewiesen werden.

Tabelle 1 zeigt ein Experiment mit optimalen Ergebnissen. Alle 10-fachen Verdünnungen folgen einer etwa 10-fachen Abnahme der Plaquezahl. Diese Art von Daten ist auch in Abbildung 2 zu sehen, einem tatsächlichen Plaque-Assay, bei dem die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate im Bereich von 10-4 lag. Dasselbe ist in Abbildung 3, der obersten Reihe, zu sehen, wo die abzählbare Anzahl von Plaques in der 10-3-Verdünnung war.<strong class="xf...

Plaquing ist eine Routinemethode zur Quantifizierung lebender Viren in einer Population. Obwohl Plaquing häufig in verschiedenen mikrobiologischen Lehrplänen mit Bakterien und Bakteriophagen gelehrt wird, ist das Plaquieren von Säugetierviren komplexer und zeitaufwendiger. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren, die für die regelmäßige Arbeit mit Herpes-simplex-Viren zuverlässig funktionieren.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

There are numerous published protocols for plaquing viruses, including references within primary literature for methodology. However, plaquing viruses can ...

Das Protokoll hilft den Schülern, einzelne Infektionen klar zu identifizieren und den Assay einfach durchzuführen, wodurch es effizienter wird, den viralen Titer zu quantifizieren. Dieses Protokoll beinhaltet ein einfaches Fixierungs- und Färbeverfahren, das zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Diese Methode kann einen Einblick in die Genauigkeit und Wirksamkeit antiviraler Behandlungen gegen Krankheiten geben.Die schwierigeren Hürden dieses Plaquing-Protokolls sind die Zellzahlen für die Aussaatplatten, um sicherzustellen, dass die Zellen während des gesamten Prozesses nicht überfüllt, austrocknen oder zerkratzt werden. Man kann auch Schwierigkeiten in der insgesamt akribischen Natur dieses Protokolls haben. Die Praxis trägt jedoch wesentlich zum Erfolg dieses Experiments bei.Schließen Sie zunächst die Probenverdünnung unter Zugabe von Viren zu Zellen in einer Laborsitzung ab. Verdünnen Sie seriell jede Virusprobe, die in PBS plaquet wird. Verwenden Sie in der Regel 10-fache Verdünnungen für die präziseste Nachverfolgung.Halten Sie alle viralen Verdünnungen auf Eis, bis Sie bereit sind, diese verdünnten Virusproben zu den Zellen hinzuzufügen. Entfernen Sie das Zellkulturmedium mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen. Fügen Sie die verdünnte Virusprobe tropfenweise zu jeder Monoschicht von Zellen tropfenweise durch die Seite jedes Brunnens hinzu.Wiederholen Sie den Vorgang für alle ein oder zwei Vertiefungen, bis die gesamte Platte mit den Virusproben gefüllt ist, die mit Plaque behaftet sind. Den gesamten Teller vorsichtig von Hand schaukeln. Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um die Virusadsorption zu ermöglichen.Entfernen Sie alle 10 Minuten die Platte aus dem Inkubator, schaukeln Sie sie vorsichtig wieder, um das Virus gleichmäßiger über jedes Bohrloch zu verteilen, und legen Sie es dann wieder in den Inkubator. Um die Möglichkeit zu verringern, versehentlich nicht absorbiertes Inokulum zu zählen, entfernen Sie die Virusprobe mit einer 1000-Mikroliter-Pipettenspitze aus den Vertiefungen und entsorgen Sie die Probe in einem Abfallbecherglas. Legen Sie 2,5 Milliliter eines Methylcellulose-Overlays auf die Platte und legen Sie es wieder in den Inkubator.Desinfizieren Sie das Abfallbecherglas, typischerweise unter Zusatz von Bleichmittel, einem Iodophor oder einem ähnlichen Viruzid, bevor Sie es aus der Biosicherheitskabine entfernen. Entfernen Sie nach der zweitägigen Inkubation das Methylcellulose-Overlay mit einer Pipette aus einer oder zwei Vertiefungen gleichzeitig und legen Sie es in ein Abfallbecherglas. Fügen Sie etwa zwei Milliliter 1% Kristallviolett in 50% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu.Inkubieren Sie die Platte mit allen mit dem Fleck gefüllten Vertiefungen für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Desinfizieren Sie an dieser Stelle das Abfallbecherglas, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie die Teller kräftig mit Leitungswasser, bis der Abfluss klar ist.Stellen Sie sicher, dass es ungefähr 10-fache Unterschiede in der Anzahl der Plaques über jede Verdünnungsreihe hinweg gibt. Die Abbildung zeigt eine 10-fache Abnahme der Plaque-Anzahl, wobei die abzählbare Anzahl von Plaques für alle drei Replikate in den Bereich von 10 bis minus vier fiel. Die ersten drei Bilder in der Abbildung zeigen Tafeln in der 10 bis minus drei Verdünnung.Die untere Reihe zeigt jedoch Ergebnisse, wenn ein Plaque-Assay nicht gut durchgeführt wird. Es gibt nur sehr wenige Plaques, die von einer Verdünnung in den sichtbaren Bereichen um die Oberseite sichtbar sind, wo die Vero-Zellen vollständig vom Substrat abgehoben wurden. In ähnlicher Weise zeigt diese Abbildung Probleme mit dem Austrocknen von Zellen oder der falschen Handhabung während des Plaque-Assays.Diese Zahl zeigt jedoch kritisch eine schlechte Vero-Zellaussaat. Jeder Brunnen zeigt dunklere violette Flecken, die auf Zellen hinweisen, die sich nicht gut über den Brunnen ausbreiten und in Clustern übereinander gestapelt sind. Für beste Ergebnisse stellen Sie sicher, dass das Virus gleichmäßig über die Platte verteilt wird, um verklumpte Plaque-Assays zu vermeiden. Plaque-Assays sind effektiver als andere quantitative Methoden, da sie nur lebende Viren zählen.Auf diese Weise kann eine echte antivirale Wirksamkeit festgestellt werden. Darüber hinaus hat uns diese Technik ermöglicht, die virale Präsenz auf Fomiten zu quantifizieren und die Wirksamkeit der Arzneimittelabgabe von neuartigen Medizinprodukten in unserem Bereich der Herpesvirusforschung zu untersuchen.

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video Artikel beschreiben wir die Verwendung eines...

Ex Vivo Organotypische Corneal Modell der akuten Epithelial Herpes Simplex Virus Typ I Infection

Das Protokoll beschreibt eine effiziente und reproduzierbare Modellsystem zur Untersuchung Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) Latenz und Reaktivierung. Der Test verwendet homogene sympathischen Neuronen Kulturen und ermöglicht die molekulare Analyse der Virus-Neuron-Wechselwirkungen unter Verwendung einer Vielzahl von Anwendungen, wie RNA-Interferenz und Expression von rekombinanten Proteinen.

Eine primäre Neuron Culture System zur Erforschung des Herpes Simplex Virus Latenz und Reaktivierung

Die meisten Studien über Herpes Hornhauterkrankung verwenden Primärinfektion Modell. Allerdings bedeutet primäre Infektion mit HSV-1 in der Regel nicht für die menschliche Erkrankung führen. Hier beschreiben wir ein wiederkehrendes Muster von herpetischer korneale Erkrankung, die näher Verhalten menschlicher Erkrankung.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Dieses Video beschreibt den Virus-Plaque-Assay des infektiösen Herpes-simplex-Virus oder HSV. Die verdünnten Viruspartikel werden in die Monoschicht der Epithelzellen geimpft. Bei der Inkubation bildet das Virus Plaques und wird visuell gezählt, um den infektiösen Virustiter zu bestimmen.

Virus Plaque Assay: Eine Technik zur Messung des infektiösen Herpes-simplex-Virus durch Quantifizierung von Plaques, die in Monolayern von virusinfizierten Zellen gebildet werden

Dieses Video zeigt die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit einem Virus, das aus infizierter Schweinehornhaut gewonnen wurde. Die Schweinehornhaut wird verwendet, um die antivirale Wirksamkeit von experimentellen Medikamenten zu testen.

Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit experimenteller Arzneimittel durch einen Plaque-Assay

Wir haben eine Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungsprotokoll für den Nachweis eines persistenten DNA-Virus-Genom in Gewebeschnitten von Tiermodellen. Dieses Protokoll ermöglicht das Studium Infektionsprozess von codetection des viralen Genoms, dessen RNA-Produkte, und viralen oder zellulären Proteinen in einzelnen Zellen.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Die Haut ist ein Zielgewebe des humanpathogenen Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1). Um den Invasionsweg von HSV-1 in das Gewebe zu untersuchen, haben wir ein ex vivo Infektionsmodell von murinen Epidermisschichten etabliert, die die äußerste Hautschicht darstellen.

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

Wir beschreiben die Verwendung einer Schweinehornhaut, um die antivirale Wirksamkeit experimenteller Medikamente zu testen.

Porcine Hornhautgewebe Explant, um die Wirksamkeit von Herpes Simplex Virus-1 Antiviralen zu untersuchen

In diesem Manuskript beschreiben wir eine einfache Methode des Wachstums, der Reinigung und der Titration des onkolytischen Herpes-simplex-Virus für die präklinische Anwendung.

Wachstum, Reinigung und Titration des onkolytischen Herpes-Simplex-Virus

Der vorliegende Artikel beschreibt die notwendigen Schritte zu isolieren und zu charakterisieren RNA-Polymerase Treue Varianten von RNA-Viren und wie man Mutationsfrequenz Daten verwenden, um Treue Veränderungen in der Gewebekultur zu bestätigen.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

Lernen Sie die Plaquierung von Herpes-simplex-Viren zur Quantifizierung viraler Titer. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifikation einzelner Infektionen und die Bewertung antiviraler Behandlungen.

Plaquierung von Herpes-simplex-Viren

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