Name: Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborenen Mäusen für primäre Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung phagozytärer Aktivität und neuroinflammatorischer Prozesse in vitro.

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Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Die Forschung wird von Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco und einem zusätzlichen Zuschuss von Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS und Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. finanziert.

Das Protokoll wurde genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den institutionellen Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankreich) behandelt. Die magnetische Isolierung von Mikroglia aus den Gehirnen von 24 OF1-Mauswelpen (sowohl männlich als auch weiblich) bei P8, unterteilt in 6-Well-, 12-Well- oder 96-Well-Platten, wird vorgestellt. Die experimentelle Arbeit wurde unter einer Haube durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.
1. Herstellung steriler Lösungen für Isolierung und Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie 50 ml 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca 2+ und Mg2+ (HBSS-/-) aus der handelsüblichen 10x-Lösung her (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Dissoziationsgemisch gemäß der in Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung unter Verwendung eines handelsüblichen Gewebedissoziationskits herzustellen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>200 ml 1x HBSS mit Ca 2+ und Mg2+ (HBSS+/+) aus der handelsüblichen 10x Lösung herstellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (als Zellsortierpuffer bezeichnet) vor.</li>
	<li>CD11b-Mikroperlen gemäß Tabelle 2 herstellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml Makrophagen-serumfreies Kulturmedium (SFM) + 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) vor. Machen Sie Aliquots von 50-ml-Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C. Dies wird später im Text als Mikroglia-Medium bezeichnet. HINWEIS: Alle Isolierlösungen müssen am Versuchstag unter sterilen Bedingungen frisch zubereitet und auf Eis gehalten werden. Mikroglia-Zellkulturmedium kann hergestellt, in 50-ml-Röhrchen aliquotiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Filtration ist nicht erforderlich.</li>
</ol>2. Dissektion des Gehirns
<ol><li>Enthaupten Sie den Kopf des Welpen mit einer großen Schere ohne vorherige Vollnarkose.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut vom Hals bis zur Nase nach der sagittalen Naht (15-20 mm) mit einer kleinen Schere ab (Abbildung 1A-C).</li>
	<li>Führen Sie eine kleine Scherenspitze in das Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite vorsichtig zu den Augen schneiden (Abbildung 1D,E).</li>
	<li>Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen (Abbildung 1F).</li>
	<li>Fassen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in die Nähe der Riechkolben und reißen Sie den Schädel vorsichtig auf, wobei Sie darauf achten, das darunter liegende Gehirn nicht zu beschädigen (Abbildung 1G-I).</li>
	<li>Entfernen Sie Kleinhirn und Geruchskolben mit einer Rasierklinge und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke (Abbildung 1J).</li>
	<li>Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 30-40 ml HBSS-/- (Abbildung 1K).</li>
</ol>3. Hirndissoziation und magnetische Mikrogliaisolation
HINWEIS: Alle Zellmanipulationen und Resuspensionen müssen mit einer 1.000 μL Pipette mit großer Vorsicht durchgeführt werden. Die Anwendung einer hohen mechanischen Wirkung kann Mikrogliazellen aktivieren oder abtöten.
<ol><li>Transfer 12 Hirnstücke (~1,2 g) pro Dissoziationsröhrchen mit Dissoziationsgemisch gemäß Tabelle 1. Für 24 Welpen wurden vier C-Tubes benötigt (Abbildung 2A-B).</li>
	<li>Platzieren Sie C-Tubes auf dem Dissoziator (mit dem Heizmodus). Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2D).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 20 s (bei 4 °C), um alle Zellen zu sammeln. Schließen Sie die mechanische Dissoziation ab, indem Sie mit einer 1.000-μl-Pipette dreimal nach oben und unten pipettieren (Abbildung 2E).</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in vier 15-ml-Röhrchen + Siebe. Spülen Sie die Siebe mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2F).</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml HBSS+/+ (Abbildung 2G).</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Schritt 1.4) (Abbildung 2H).</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. 200 μL CD11b-Mikroperlenlösung (Schritt 1.5) pro Röhrchen zugeben und vorsichtig resuspendieren (Abbildung 2I).</li>
	<li>Die Röhrchen 15-20 min bei 4 °C inkubieren. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 6 ml Sortierpuffer (Abbildung 2I-J).</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 8 ml Sortierpuffer (Abbildung 2K).</li>
	<li>Folgen Sie dem POSSEL-Programm auf dem Separator (siehe Materialtabelle), um acht Spalten vorzubereiten. Transferzellen 1 ml x 1 ml auf der Säule. Warten Sie, bis alle Zellen durchgegangen sind, bevor Sie eine weitere ml hinzufügen. Elue CD11b+ Zellen auf steriler Elutionsplatte mit 1 mL Sortierpuffer (Abbildung 2L).</li>
	<li>Pool CD11b+-Zellen in einem neuen 50-ml-Röhrchen (Abbildung 2M).</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) zentrifugieren und den Überstand entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit 10 ml kaltem Mikrogliamedium (Schritt 1.6) (Abbildung 2N).</li>
	<li>Zählen Sie die CD11b+-Zellen. Bei P8 sollte man ~650.000 Zellen pro Gehirn erhalten. HINWEIS: Im vorliegenden Protokoll wurden die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler gezählt (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium auf eine Endkonzentration von 650.000-700.000 Zellen/ml und dosieren Sie sie in Zellkulturplatten. HINWEIS: Die 6-Well-Platten sind für Western Blot (2 ml pro Well); die 12-Well-Platten sind für die RT-qPCR-Analyse (1 ml pro Well) und die 96-Well-Platten für den phagozytischen Assay (250 μL pro Well); Alle drei wurden für diese Arbeit verwendet. In diesem Manuskript sind die Ergebnisse der Western-Blot-Analyse jedoch nicht dargestellt, aber es ist möglich, mit diesem Protokoll durchzuführen.</li>
	<li>Stellen Sie die Platten über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2. Wechseln Sie das Medium vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette mit vorgewärmtem Mikrogliamedium.</li>
	<li>Stellen Sie die Platten vor der Stimulation über Nacht bei 37 °C mit 5% CO2 auf. HINWEIS: Die Isolierung von Mikroglia von mehr als 36 Welpen und nach P9 wird nicht empfohlen. Dies erhöht das Risiko einer Kontamination und Ansammlung von Zelltrümmern, um Mikroglia zu aktivieren.</li>
</ol>4. Zellstimulationen
<ol><li>Herstellung von Stimulationsreagenzien gemäß Tabelle 3 unter Verwendung der handelsüblichen Reagenzien (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Fügen Sie das entsprechende Volumen in jedem stimulierten Brunnen hinzu. HINWEIS: Das geeignete Volumen hängt von der Konzentration des Stimulus und der Größe des Brunnens ab.</li>
	<li>Die Platten werden bei 37 °C mit 5%CO2bis zum Ende der Stimulation um 6 h, 24 h oder 48 h platziert.</li>
	<li>Für die Western-Blot-Analyse aspirieren Sie den Überstand und fügen 50 μL Proteinlysepuffer (siehe Materialtabelle) mit einer Pipette hinzu. Kratzen Sie mit Spitzen den Boden der Platte, um die lysierten Zellen zu lösen, und übertragen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Bei -80 °C lagern. HINWEIS: Die Kulturplatten können jahrelang bei -80 °C gelagert werden, wenn der Überstand korrekt angesaugt ist.</li>
	<li>Für die RT-qPCR-Analyse 6,31 aspirieren Sie den Überstand und lagern die Kulturplatten direkt bei -80 °C bis zur mRNA-Extraktion (Schritt 5).</li>
	<li>Für den phagozytischen Assay siehe Schritt 6.</li>
</ol>5. mRNA-Extraktion und RT-qPCR-Analyse
<ol><li>Führen Sie RNA-Extraktion, RT-PCR und RT-qPCR gemäß dem Protokoll des Herstellers durch (siehe Materialtabelle). Die Primersequenzen 5,6,31 finden Sie in Tabelle 4.</li>
	<li>Führen Sie eine RT-qPCR-Analyse durch, indem Sie dem zuvor veröffentlichten Bericht5 folgen.</li>
</ol>6. Phagozytärer Assay
<ol><li>Stimulieren Sie die Zellen und führen Sie während der letzten 3 Stunden der Stimulation einen phagozytischen Test durch. Zum Beispiel, für Stimulation von 6 h, starten Sie den phagozytischen Assay nach 3 h Stimulation; und für eine Stimulation von 12 h beginnen Sie den phagozytischen Assay 9 h nach Beginn der Stimulation.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der Perlen, die für die Vorbereitung benötigt werden, unter Berücksichtigung des Verhältnisses (1 Zelle: 50 Perlen). Für eine Vertiefung der 96-Well-Platte werden 8,1 x 106 Perlen benötigt. Bereiten Sie die Perlenmischung gemäß Tabelle 5 vor. HINWEIS: Wirbeln Sie die Durchstechflasche mit den Perlen vorsichtig durch, bevor Sie sie der PBS / FBS-Mischung hinzufügen.</li>
	<li>1 h in einem Wasserbad bei 37 °C inkubieren. Wirbel alle 10 min.</li>
	<li>Berechnen Sie das Lösungsvolumen, das jeder Vertiefung hinzugefügt werden soll. Fügen Sie die Lösung hinzu und inkubieren Sie für 3 h.</li>
	<li>Spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS aus. Lesen Sie die Fluoreszenzemission bei 550 nm (Cy3-Emissionswellenlänge).</li>
</ol>7. Qualitätskontrolle der Reinheit
<ol><li>Bewerten Sie die Reinheit der magnetischen CD11b-Isolierung durch Durchflusszytometrie (FACS) (vor und nach der Zellsortierung) und führen Sie dann die RT-qPCR durch.<ol><li>Die Zellen werden gezählt und im FACS-Puffer (PBS + 2 mM EDTA + 0,5 % Rinderserumalbumin) resuspendiert, um nach Schritt 3.5 und Schritt 3.14 eine Verdünnung von 10 x 106 Zellen/ml zu erhalten.</li>
		<li>Nach 15 min der konventionellen Fc-Blockierung 32,33 werden die Zellen für 15 min mit einer Lebensfähigkeitssonde (FVS780) und fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen Maus-CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 oder die entsprechenden Kontrollisotypen 32,33 in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration inkubiert (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer, fixieren und permeabilisieren Sie sie mit einem handelsüblichen Permeabilisierungskit (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Führen Sie eine erneute Fc-Blockierung an den permeabilisierten Zellen durch und inkubieren Sie dann 15 min lang mit fluorophorkonjugierten Antikörpern gegen NeuN (siehe Materialtabelle) oder dessen Kontrollisotyp.</li>
		<li>Führen Sie die FACS-Analyse nach dem Waschen mit dem FACS-Puffer durch.</li>
		<li>Nach dem Ausschluss der Dubletten und der toten Zellen basierend auf morphologischen Parametern bzw. FVS780-Färbung wählen Sie die Gating-Strategie für die Oberflächenexpression von CX3CR1 (Mikroglia), ACSA-2 (Astrozyten), O4 (Oligodendrozyten) und intrazelluläres Vorhandensein von NeuN (Neuronen) für die Analyse des Prozentsatzes positiver Zellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach Schritt 5 extrahieren Sie mRNA und führen RT-qPCR durch, um Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Synaptophysin und Gfap mRNA zu quantifizieren. Normalisieren Sie Cq mit Rpl13a mRNA als Reporter und führen Sie eine relative Expression zu Itgam mRNA durch.</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die aktuelle Arbeit präsentiert eine primäre Mikrogliazellkultur mit magnetisch sortierten CD11b+-Zellen. Neben der mikroglialen Funktionsbewertung (RT-qPCR und phagozytäre Assays) wurde auch die Reinheit der Mikrogliakultur bestimmt.
Klassische Mikroglia-Zellkulturen werden üblicherweise aus P1- oder P2-Nagetier-Neugeborenengehirn und Co-Kultur mit Astrozyten für mindestens 10 Tage erzeugt. Mikroglia werden dann mechanisch mit einem Orbitalschüttler getrennt. Die Methode zur Isolierung und Ku...

Mikroglia sind die im zentralen Nervensystem ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen, die von erythropoetischen Vorläufern des Dottersacks abstammen, die während der frühen Embryonalentwicklung in das Neuroepithel wandern1. Neben ihren Immunitätsfunktionen spielen sie auch eine wichtige Rolle während der Neuroentwicklung, insbesondere bei der Synaptogenese, neuronalen Homöostase und Myelinisierung2. Im Erwachsenenalter entwickeln Mikroglia lange zelluläre Prozesse, um die Umgebung kontinuierlich zu scannen. Im Falle von Homöostaserupturen wie Hirnverletzungen oder Gehirnerkrankungen können Mikroglia ihr morphologisches Aussehen verändern, um eine amöboide Form anzunehmen, in den verletzten Bereich zu wandern, viele zytoprotektive oder zytotoxische Faktoren zu erhöhen und freizusetzen. Mikroglia haben heterogene Aktivierungszustände, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium und der Art der erlittenen Verletzung 3,4,5. In dieser Studie werden diese Aktivierungszustände grob in drei verschiedene Phänotypen eingeteilt: entzündungsfördernd/phagozytisch, entzündungshemmend und immunregulatorisch, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Situation in Wirklichkeit wahrscheinlich komplexer ist6.
Die Untersuchung der In-vivo-Mikrogliaaktivierung und das Screening auf neuroprotektive Strategien in frühen Stadien der Gehirnentwicklung kann aufgrund (1) der Zerbrechlichkeit der Tiere vor dem Absetzen und (2) der geringen Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung darstellen. Daher werden In-vitro-Studien an Mikroglia häufig für Toxizität 7,8,9, neuroprotektive Strategien5,10,11,12,13,14 und Kokulturen 15,16,17,18,19,20,21 verwendet. . In-vitro-Studien können entweder Mikroglia-Zelllinien, Stammzell-abgeleitete Mikroglia oder primäre Mikroglia-Kultur verwenden. Alle diese Ansätze haben Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der anfänglichen biologischen Frage ab. Die Vorteile der Verwendung primärer Mikrogliakulturen sind der homogene genetische Hintergrund, die pathogenfreie Geschichte und die Kontrolle des Zeitpunkts, zu dem die Mikroglia nach dem Tiertod stimuliert werden22.
Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden (Durchflusszytometrie, Schütteln oder magnetische Markierung) entwickelt, um primäre Mikroglia von Nagetieren zu kultivieren, sowohl Neugeborenen als auch Erwachsenen 23,24,25,26,27,28,29. In der vorliegenden Arbeit wird die Mikroglia-Isolierung von Maus-Neugeborenen-Welpen unter Verwendung der zuvor beschriebenen magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie unter Verwendung von mikroperlenbeschichtetem Anti-Maus-CD11b25,27,29 durchgeführt. CD11b ist ein Integrinrezeptor, der an der Oberfläche myeloischer Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimiert wird. Wenn es keine entzündliche Herausforderung im Gehirn gibt, sind fast alle CD11b + -Zellen Mikroglia30. Im Vergleich zu anderen zuvor veröffentlichten Methoden 23,24,25,26,27,28,29 gleicht das vorliegende Protokoll sofortige Ex-vivo-Mikroglia-Aktivierungsanalysen und gängige primäre In-vitro-Mikrogliakulturen aus. So werden Mikroglia (1) am postnatalen Tag (P)8 ohne Myelinentfernung isoliert, (2) ohne Serum kultiviert und (3) erst 48 h nach der Gehirnisolierung entweder siRNA, miRNA, pharmakologischen Verbindungen und/oder entzündlichen Reizen ausgesetzt. Jeder dieser drei Aspekte macht das aktuelle Protokoll relevant und schnell. Erstens ermöglicht die Verwendung von pädiatrischen Mikroglia die Gewinnung dynamischer und reaktiver lebensfähiger Zellen in Kultur, ohne dass ein zusätzlicher Demyelinisierungsschritt erforderlich ist, der möglicherweise die Mikroglia-Reaktivität in vitro verändern könnte. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, der physiologischen Umgebung von Mikroglia so nahe wie möglich zu kommen. Tatsächlich treffen Mikroglia nie auf Serum, und dieses Protokoll erfordert auch nicht die Verwendung von Serum. Darüber hinaus verhindert die Freilegung von Mikroglia bereits 48 Stunden nach der Kultur, dass sie ihre physiologischen Fähigkeiten verlieren.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus ACSA-2 PE Vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b BV421</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1106255</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1115690</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CX3CR1 PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1345075</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus NeuN PE</td><td>Milli-Mark</td><td>FCMAB317PE</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus O4 Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-016</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Permeabilisierungskit</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Mikroglia) MikroKügelchen, h, m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zellkultur 12-Well-Platte, flacher Boden + Deckel</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Kultur 96-Well-Platte, flacher Boden + Deckel</td><td>Dutscher</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen 50 mL</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Blockierungsreagenz (Maus CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon ECLIPSE TE300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Röhren (4 x 25 Röhren)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissoziator mit Heizern</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14065049</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185045</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1725006CUST</td><td></td></tr><tr><td>Iscript c-DNA-Synthese</td><td>Bio-rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Latexkügelchen, aminmodifiziertes Polystyrol, fluoreszierend rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2776-1mL</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS) aus&nbsp; Escherichia coli&nbsp; O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Makrophagen-SFM serumfreies Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>12065074</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Stammlösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; m), 4 x 25 Stück</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG1 PE</td><td>Millipore</td><td>MABC002H</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG2a PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2601265</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL1 beta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-684</td><td></td></tr><tr><td>Multi-24 Säulenblöcke</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-691</td><td></td></tr><tr><td>MultiMACS Cell24 Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationskit für neurales Gewebe - Papain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Nukleozähler NC-200</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA Plus XS</td><td>Macherey Nagel</td><td>740990.5</td><td></td></tr><tr><td>Nun EZFlip Top Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>OPTILUX Petrischale - 100 x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>P&eacute; Nizillin-Streptomycin (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Ratten-IgG2b, k BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Ratte IgG2b, k BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2603230 REA-Steuerung</td><td></td></tr><tr><td>(S) PE vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-616</td><td></td></tr><tr><td>REA-Steuerung (S) Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-445</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IFN-gamma Protein</td><td>R& D System</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-10 Protein</td><td>F& T & D System</td><td>417-ML</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-4 Protein</td><td>F& Technik D System</td><td>404-ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Viabilitätssonde (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr></tbody></table>

magnetische isolierung von mikrogliazellen aus neugeborener maus für primäre zellkulturen

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Mikroglia, als hirnresidente Makrophagen, sind grundlegend für mehrere Funktionen, einschließlich der Reaktion auf Umweltstress und Gehirnhomöostase. Mikroglia können ein großes Spektrum von Aktivierungsphänotypen annehmen. Darüber hinaus sind Mikroglia, die den proinflammatorischen Phänotyp unterstützen, sowohl mit neurologischen Entwicklungsstörungen als auch mit neurodegenerativen Störungen assoziiert. In-vitro-Studien werden häufig in der Forschung eingesetzt, um mögliche therapeutische Strategien in bestimmten Zelltypen zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Mikrogliaaktivierung und Neuroinflammation in vitro unter Verwendung primärer Mikrogliakulturen relevanter als Mikrogliazelllinien oder Stammzell-abgeleitete Mikroglia. Die Verwendung einiger Primärkulturen könnte jedoch unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden. Dieses Protokoll schlägt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen vor. Mikroglia-Aktivierung mit mehreren Stimuli nach 4 h und 24 h durch mRNA-Expressionsquantifizierung und einen Cy3-Bead Phagozyten-Assay wird hier demonstriert. Die aktuellen Arbeiten sollen eine leicht reproduzierbare Technik zur Isolierung physiologisch relevanter Mikroglia aus juvenilen Entwicklungsstadien liefern.

Mikroglia ist der ZNS-residente Makrophag, der aktiviert wird, wenn er Umweltproblemen (Trauma, toxische Moleküle, Entzündungen) ausgesetzt ist4,5,6,34 (Abbildung 3A). In-vitro-Studien an Mikroglia werden häufig verwendet, um zellautonome Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Umweltherausforderungen zu bewerten und den Aktivierungszustand nach pharmakolog...

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Mikroglia unter Bedingungen zu kultivieren, die die In-vivo-Eigenschaften genau nachahmen. Mit Hilfe der Magnetzellensortiertechnologie ermöglicht uns unser Protokoll, Mikroglia nur zwei Tage in vitro zu stimulieren, ohne Serum im Kulturmedium zu verwenden. Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um die Haut vom Hals bis zur Nase zu schneiden, indem Sie der sagittalen Naht von 15 bis 20 Millimetern folgen.Führen Sie die Spitzen mit dem Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite zu den Augen schneiden. Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen.Greifen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in der Nähe der Riechkolben und reißen Sie vorsichtig den Schädel auf. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und die olfaktorische Birne und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke. Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 40 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium.Dissoziationsmischung gemäß dieser Tabelle vorbereiten. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke in ein C-Röhrchen für ein Gesamtgewicht von 1,2 Gramm pro Dissoziationsröhrchen. Legen Sie dann C-Rohre auf den Dis

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Neuroscience

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Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen...

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von CD11b-Zellen, einschließlich Mikroglia, aus Mäuse-Welpengehirnen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Das Hirngewebe wird homogenisiert, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten, die mit Anti-CD11b-Antikörpern beschichteten Mikrokügelchen inkubiert werden, gefolgt von einer magnetischen Säulentrennung, um die CD11b+-Zellpopulation zu reinigen.

Magnetische Isolierung von Mikroglia aus dem Gehirn von Maus-Welpen

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Extraktion von Mikrogliazellen aus demyelinisierenden Läsionen in Mäusegehirnen mittels magnetischer Zellsortierung. Das Protokoll umfasst das Präparieren des läsionierten Hirngewebes, das Mikrogliazellen enthält, die Behandlung des Gewebes mit spezifischen Enzymen, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und die Verwendung von Mikrogliarezeptor-spezifischen magnetischen Kügelchen zur Isolierung der Mikrogliazellen.

Isolierung von Mikroglia aus demyelinisierenden Läsionen des Mausgehirns mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung

Das Video demonstrierte die Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus einem neugeborenen Mäusegehirn. Es beinhaltete die enzymatische und mechanische Dissoziation des Gehirns, gefolgt von der Kultivierung in Wachstumsmedien ohne neuronalen Wachstumsfaktor, um eine gemischte Gliapopulation zu erhalten.

Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Ein Protokoll für die Isolierung von primären Mikroglia aus murine Gehirn wird vorgestellt. Diese Technik hilft bei der Förderung des gegenwärtigen Verständnis von neurologischen Erkrankungen. Dichte-Gradienten-Zentrifugierung und magnetische Trennung werden kombiniert, um genügend Ertrag einer hochreinen Probe zu produzieren. Darüber hinaus erläutern wir die Schritte zur Charakterisierung der Mikroglia.

Charakterisierung und Isolierung der Maus primären Mikroglia durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogliazellen aus dem Hypothalamus der Maus (oder gleichwertigen kleinen Gehirnstrukturen) mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) in relativ kurzer Zeit. Die MACS-sortierten hypothalamischen Mikroglia können für die ex vivo-Analyse verwendet werden und können für die Durchführung von In-vitro-Assays plattiert werden.

Isolierung von hypothalamischen Mikroglia aus frisch perfundiertem adulten Mausgehirn durch magnetisch aktivierte Zellsortierung  

Erfahren Sie die magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborenen Mäusen für primäre Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung phagozytärer Aktivität und neuroinflammatorischer Prozesse in vitro.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

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