Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen
25. Juli 2022
Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.
Dieses Protokoll ermöglicht es uns, Mikroglia unter Bedingungen zu kultivieren, die die In-vivo-Eigenschaften genau nachahmen. Mit Hilfe der Magnetzellensortiertechnologie ermöglicht uns unser Protokoll, Mikroglia nur zwei Tage in vitro zu stimulieren, ohne Serum im Kulturmedium zu verwenden. Verwenden Sie zunächst eine kleine Schere, um die Haut vom Hals bis zur Nase zu schneiden, indem Sie der sagittalen Naht von 15 bis 20 Millimetern folgen.
Führen Sie die Spitzen mit dem Foramen magnum parallel zum Schädel ein. Von jeder Seite zu den Augen schneiden. Mit einer kleinen Schere zwischen die Augen schneiden, um den Schädel und das Gehirn vom Kopf zu lösen.
Greifen Sie den Schädel mit zwei Pinzetten in der Nähe der Riechkolben und reißen Sie vorsichtig den Schädel auf. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge das Kleinhirn und die olfaktorische Birne und schneiden Sie das Gehirn in zwei Stücke. Legen Sie die Gehirnstücke in eine Petrischale mit 40 Milliliter HBSS ohne Kalzium und Magnesium.
Dissoziationsmischung gemäß dieser Tabelle vorbereiten. Übertragen Sie 12 Gehirnstücke in ein C-Röhrchen für ein Gesamtgewicht von 1,2 Gramm pro Dissoziationsröhrchen. Legen Sie dann C-Rohre auf den Dissoziator mit Erwärmung.
Starten Sie das optimierte NTDK-Programm im Dissoziator. Zentrifugieren für 20 Sekunden. Schließen Sie die mechanische Dissoziation durch dreimaliges Pipettieren ab.
Die Zellen werden in vier 15-Milliliter-Röhrchen mit angebrachten Sieben überführt. Spülen Sie die Siebe mit 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium ab. 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette entfernen.
Fügen Sie vorsichtig 10 Milliliter HBSS mit Kalzium und Magnesium hinzu und suspendieren Sie das Pellet erneut. Wieder zentrifugieren und den Überstand entfernen. Suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.
Wiederholen Sie die Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand. Dann fügen Sie 200 Mikroliter CD11b-Mikroperlenlösung hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen für 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation suspendieren Sie das Pellet mit sechs Milliliter Sortierpuffer.
Wiederholen Sie die Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet mit acht Milliliter Sortierpuffer. Folgen Sie als Nächstes dem Possel-Programm auf dem Trennzeichen, um acht Spalten vorzubereiten. Führen Sie die Zellen durch die Säule, indem Sie jeweils einen Milliliter Zellsuspension hinzufügen.
Mit einem Milliliter Sortierpuffer CD11b-positive Zellen auf einer sterilen Elutionsplatte eluieren. Bündeln Sie die Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren und suspendieren Sie das Pellet mit 10 Milliliter kaltem Mikrogliamedium.
Zählen Sie die CD11b-positiven Zellen. Resuspendieren Sie die Zellen in kaltem Mikrogliamedium, um eine Endkonzentration von 650.000 bis 700.000 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Die Suspension wird in Zellkulturplatten abgegeben.
Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch ein vorgewärmtes Mikrogliamedium und wiederholen Sie die Inkubation über Nacht. Stimulieren Sie die Zellen vor diesem Schritt und führen Sie während der letzten drei Stunden der Stimulation einen phagozytischen Assay durch.
Berechnen Sie die Anzahl der Perlen gemäß dieser Tabelle im Verhältnis 50 Perlen pro Zelle. Bereiten Sie die Perlenmischung vor. Inkubieren Sie das Röhrchen für eine Stunde in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.
Wirbel alle 10 Minuten. Zu jeder Vertiefung das berechnete Volumen der Perlenlösung hinzufügen und drei Stunden lang inkubieren. Mit diesem Ansatz wurde die phagozytische Aktivität von Mikroglia nach Stimulation durch entzündungsfördernde Faktoren wie Interleukin-1 beta plus Interferon gamma oder Lipopolysaccharide bewertet.
Nach sechs- bis 24-stündiger Stimulation wurden fluoreszierende Cy3-Mikroglia-Beads konfokalmikroskopisch analysiert. Nach sechs Stunden beginnen Mikroglia, Cy3-Perlen nur unter Interleukin-1 beta plus Interferon-gamma-Bedingung zu phagozyten. Nach 24 Stunden gab es einen Anstieg der Cy3-Fluoreszenz für beide Arten der Stimulation, was eine erhöhte phagozytische Aktivität hervorhob.
Die Reinheit der Mikrogliakultur wurde durch Durchflusszytometrie erhöht, was eine Erhöhung der Zelllebensfähigkeit nach der Sortierung zeigte. Mit Hilfe von Durchflusszytometrie und RT-qPCR wurden Zellpopulationsmarker vor und nach dem Sortieren von CD11b-positiven Zellen aus Mäusegehirnen am postnatalen achten Tag analysiert. Diese Analysen unterschieden verschiedene Gehirnzellpopulationen, wie CX3CR135 für Mikroglia, O4 oder OLIG2 für Oligodendrozyten, NeuN oder Synaptophysin für Neuronen und ACSA-2 oder GFAP für Astrozyten.
Nach der Zellsortierung mit CD11b-Antikörpern wurden nur Mikroglia erhalten. Es ist wichtig, sehr vorsichtig zu pipettieren, während die Suspension in die Säule gegeben wird, um Verstopfungen zu vermeiden und den mechanischen Zelltod zu vermeiden. Nach dieser Methode kann transkriptomische Proteomik wie westliches Blut oder Luminex und sogar Immunchemie durchgeführt werden, um die Wirkung der Mikrogliastimulation zu sehen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein reproduzierbares Protokoll zur Isolierung primärer Mikrogliazellen aus neonatalen Mäusen unter Verwendung der magnetischen Sortiertechnologie vor. Die Methodik ermöglicht die Kultivierung von Mikrogliazellen unter Bedingungen, die in-vivo-Charakteristika eng nachahmen, und liefert Einblicke in ihre phagozytische Aktivität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Forschung zu Mikroglia
Hintergrund
- Microglia übernehmen entscheidende Funktionen im zentralen Nervensystem.
- Das Verständnis der mikroglialen Reaktionen auf Stimuli ist wichtig für die Forschung zur Neuroinflammation.
- Die magnetische Zellsortierung bietet eine geeignete Strategie zur Isolierung von Mikroglia.
- Frühere Protokolle weisen möglicherweise Mängel bei der Reproduzierbarkeit oder der Relevanz für in-vivo-Bedingungen auf.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur effizienten Isolierung und Kultivierung primärer Mikroglia.
- Möglichkeit zur Beurteilung der Reaktionen von Mikroglia auf entzündliche Stimuli.
- Beurteilung der Reinheit und Vitalität der isolierten Mikroglia.
Verwendete Methoden
- Zellkulturmethode unter Verwendung der magnetischen Sortierung zur Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Mäusen.
- Das biologische Modell umfasst kortikale Mikroglia aus neugeborenen Welpen.
- Immunchemie und Durchflusszytometrie wurden zur Beurteilung der Zellreinheit eingesetzt.
- Zentrale Schritte umfassen die Dissektion, enzymatische Dissoziation und Sortierung mithilfe von CD11b-Mikroperlen.
- Phagozytose-Assays bewerteten die mikrogliale Aktivität als Reaktion auf proinflammatorische Faktoren.
Hauptergebnisse
- Die Mikroglia zeigten eine erhöhte phagozytische Aktivität als Reaktion auf bestimmte entzündliche Bedingungen.
- Erhöhte Zellviabilität und Reinheit wurden mittels Durchflusszytometrie nach der Sortierung bestätigt.
- Die konfokale Mikroskopie verdeutlichte deutliche Unterschiede in der phagozytischen Aktivität in Abhängigkeit von der Stimulationsdauer.
- Die Methode verdeutlichte Unterschiede zwischen verschiedenen Gehirnzellpopulationen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Mikroglia aus Mäusen für Experimente in vitro.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis der Funktionen von Mikroglia und ihrer Reaktionen auf Entzündungen.
- Dieses Protokoll dient als Grundlage für weitere Untersuchungen neuroinflammatorischer Prozesse.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus neonatalen Mäusen, die physiologisch relevante In-vitro-Modelle für die Forschung zur Neuroinflammation ermöglicht. Durch die Erzielung hoher Reinheit und Vitalität mittels magnetischer CD11b-basierter Sortierung unterstützt der Ansatz die mechanistische Risikominderung bei der Target-Validierung und der Assay-Entwicklung für Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die Methode erhöht die Vorhersagegenauigkeit in der präklinischen Screening-Phase, indem sie die Funktionalität und Aktivierungszustände der Mikroglia bewahrt, die in-vivo-Bedingungen eng nachahmen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Mikroglia-Aktivierungsphänotypen und proinflammatorischen Reaktionen, die für Hypothesen zu neurodevelopmentalen und neurodegenerativen Erkrankungen relevant sind.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes, serumfreies Kultursystem, das die biologische Variabilität verringert und konsistente Target-Engagement-Studien ermöglicht.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitativ bewertbare phagozytische und transkriptionelle Ergebnisse zur Untersuchung modulierender Substanzen in entzündlichen Signalwegen.
- Operativer Wert: Bietet einen skalierbaren, reproduzierbaren Isolierungsworkflow, der mit Mehrfachplatten und zeitlichen Stimulationsassays kompatibel ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Prozesse, indem mikrogliale Identitätsmarker (z. B. CX3CR1) sowie funktionelle Reaktionen auf Stimuli wie IL-1β/IFN-γ und LPS erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine translationale Durchgängigkeit von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch standardisierte Reinigung und funktionelle Validierung mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und liefert validierte Primärzellen für die Hypothesenprüfung, die Bereitschaft für Assays sowie die Datenerzeugung, die der Lead-Identifizierung und der präklinischen Risikobewertung zugrunde liegen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die mechanistische Entlastung durch Isolierung von Mikroglia, um die Beteiligung von Signalwegen bei neuroinflammatorischen Prozessen zu klären.
- Screening: Stellt assaysbereite Zellen mit quantifizierbaren Phagozytose- und mRNA-Auslesungen für die Wirkstoffscreening- und Zielmodulationsstudien bereit.
- Analytik: Unterstützt quantitative Messungen abhängiger Variablen, einschließlich phagozytotischer Aktivität (Aufnahme von Cy3-Kügelchen) und Genexpression (RT-qPCR), zur Analyse vergleichender Bedingungen.
- Translationale Forschung: Erhält die phänotypische Treue und Markerexpression aufrecht und unterstützt die Biomarkerabstimmung sowie Kontinuität bei der präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Isolationsplattform, die auf mehrere Projekte anwendbar ist, die die Funktion von Mikroglia in Modellen zentralnervöser Erkrankungen untersuchen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem mechanistische Unschärfen durch physiologisch relevante Mikroglia-Modelle reduziert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch magnetische Sortierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Variabilität von Charge zu Charge minimiert wird.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich der Weiterentwicklung von Zielstrukturen, indem zuverlässige präklinische Daten zu Zielmodulation und Profilen der entzündlichen Reaktion bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von ZNS-Zielstrukturen basierend auf validierten Daten zur Mikroglia-Aktivierung und funktionellen Endpunkten.
Umsetzungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Dissektion neonatalen Gewebes, enzymatischen Dissoziation und magnetischen Zellsortierungstechniken.
- Setzt Zugang zu Zellsortierern (z. B. MACS), Zentrifugen und steriler Zellkulturinfrastruktur voraus.
- Erfordert standardisierte Reagenzherstellung und Inkubationszeiten, um eine konsistente Ausbeute und Vitalität von CD11b-positiven Zellen sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme oder Entwicklungsstadien kann eine Optimierung der Dissoziations- und Sortierparameter erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die mechanische Empfindlichkeit während des Säulendurchlaufs, weshalb vorsichtiges Pipettieren erforderlich ist, um Verstopfungen und Zellschäden zu vermeiden.
