Softwaregestützte quantitative Messung der osteoarthritischen subchondralen Knochendicke
18. März 2022
Dieser Methodenartikel stellt ein softwaregestütztes quantitatives Messprotokoll zur Quantifizierung der histologischen subchondralen Knochendicke in murinen osteoarthritischen Kniegelenken und normalen Kniegelenken als Kontrollen vor. Dieses Protokoll ist sehr empfindlich gegenüber subtiler Verdickung und eignet sich zur Erkennung früher osteoarthritischer subchondraler Knochenveränderungen.
Subchondrale Knochenverdickung oder Sklerose ist eines der Kennzeichen der Osteoarthritis, sowohl im Tiermodell als auch beim Menschen. Derzeit wird der Schweregrad der histologischen subchondralen Knochenverdickung hauptsächlich durch visuelle Schätzung auf der Grundlage semiquantitativer Grading-Systeme bestimmt. Diese Studie zielt darauf ab, ein reproduzierbares und leicht auszuführendes Protokoll zur quantitativen Messung der subchondralen Knochendicke in einem Mausmodell der Knie-OA zu entwickeln, das durch Destabilisierung des medialen Meniskus induziert wird.
Wir haben ein Mausmodell für Kniearthrose durch chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus erstellt, die unter dem Operationsmikroskop und dem sterilen Zustand durchgeführt wird. Der histologische Prozess der Kniegelenke der Maus umfasst Gewebefixierung, Entkalkung, Trimmen, Verarbeiten, Einbetten, Schneiden und Färben, gefolgt von mikroskopischer Bildgebung. Das Bild auf dem Bildschirm zeigt die Kniearthrose der Maus mit Gelenkknorpelläsionen, Osteophytenbildung und subchondraler Knochenverdickung Quantitative Messung des osteoarthritischen subchondralen Knochens mit der ImageJ-Software.
Laden Sie ImageJ von imagej.nih.gov/ij herunter. Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf die Registerkarte Datei und dann auf die Option Öffnen, um das histologische Bild zu öffnen.
Suchen Sie die Adresse des Dateiverzeichnisses, wählen Sie die Bilddatei aus, und klicken Sie auf Öffnen. Verwenden Sie das Geradelinien-Werkzeug, um eine Längeneinheit(einen Mikrometer) zu skizzieren, und klicken Sie auf Analysieren (Analyze) und dann auf Skalierung festlegen (Set Scale). Stellen Sie den bekannten Abstand und das Pixel-Seitenverhältnis auf eins und klicken Sie auf Ok.ImageJ kann die Pixellänge in die Einheitslänge eines Mikrometers umwandeln.
Legen Sie den gemessenen Faktor auf Fläche fest. Klicken Sie auf Analysieren, dann auf Messung festlegen und aktivieren Sie im neuen Fenster das Kontrollkästchen Fläche und Grenzwert auf Schwellenwert. In diesem Schritt wird ImageJ so eingestellt, dass der Parameterbereich innerhalb des ausgewählten Schwellenwerts gemessen wird.
Definierter subchondraler Knochenbereich von Interesse, wie im Radio gezeigt, der die subchondrale kortikale Platte und einen Teil des darunter liegenden trabekulären Knochens neben der kortikalen Platte abdeckt. Skizzieren Sie den Umriss des gesamten subchondralen Knochenbereichs mit dem Auswahlwerkzeug unter dem Hauptfenster des Bildes. Die Auswahlwerkzeuge geben dem System einen Schwellenwert, um die Messung nach der Auswahl des Schwellenwerts zu begrenzen.
Klicken Sie auf Analysieren und dann auf Messen. Es öffnet sich ein Ergebnisfenster mit Flächenmessung. Klicken Sie auf Bearbeiten und dann auf Außen löschen, um den Bereich außerhalb des gesamten subchondralen Knochenbereichs auszuschließen.
Nachdem Sie auf die Option "Außen löschen" geklickt haben, ist nur der gesamte subchondrale Knochenbereich sichtbar. Klicken Sie auf Bild, dann auf Anpassen und dann auf Farbwert, um das Farbfenster für den Schwellenwert zu öffnen. Klicken Sie unten im Schwellenwert-Farbfenster auf Original, um den ursprünglichen Status des Bilds wiederherzustellen.
Verwenden Sie Auswahlwerkzeuge, um eine kleine Box im Knochensubstanzbereich zu zeichnen. Klicken Sie unten im Fenster auf Sample Option (Sample Option), um den Knochensubstanzbereich zu definieren. Der ausgewählte Knochensubstanzbereich wird rot.
Klicken Sie unten im Farbfenster des Schwellenwerts auf Auswählen, um einen Schwellenwert für die Flächenmessung zu erstellen. Klicken Sie im Hauptmenü von ImageJ auf Analysieren und dann auf Messen. Das Ergebnis der Messung des Knochensubstanzbereichs wird im Ergebnisfenster angezeigt.
Speichern Sie die Daten der gesamten subchondralen Knochenfläche und der Knochensubstanzfläche. Die Inter- und Intraobservervariabilität sowie die Reproduzierbarkeit wurden durch pearsons Korrelationskoeffizientenanalyse bestimmt. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen den Studiengruppen wurde mit Hilfe des Student t-Tests oder der Einweg-ANOVA bestimmt, gefolgt von einem Post-hoc-Test.
Diese Abbildung zeigt die oberen und unteren Paneele. Das obere Feld zeigt Mikrofotografien histologischer Bilder aus Sham- und DMM-Gruppen für eine auf visueller Schätzung basierende subchondrale Knochenbewertung. Die unteren Panels zeigen Mikrofotografien histologischer Bilder aus Sham- und DMM-Gruppen für die ImageJ-gestützte, quantitative subchondrale Knochenmessung.
Die mit einer gepunkteten gelben Linie umrandeten Felder, die mit Adobe Illustrator erstellt wurden, definieren den gesamten subchondralen Knochenbereich von Interesse. Der Bereich der Knochensubstanz innerhalb der Boxen ist orange hervorgehoben. Bemerkenswerte subchondrale Knochenverdickungen im medialen Femurkondylus und im medialen Tibiaplateau können mit der ImageJ-Software quantifiziert werden.
In dieser Abbildung zeigen Interobserver-Variationstests eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen Beobachtern sowohl für die erste als auch für die zweite Messung der subchondralen Knochendicke im medialen Tibiaplateau und den medialen femmoralen Kondylenregionen von Interesse. In dieser Abbildung zeigen Intraobserver-Variationstests eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den ersten und zweiten subchondralen Knochendickenmessungen im medialen Tibiaplateau und den medialen femmoralen Kondylenregionen von Interesse. Tabelle 1 zeigt eine vergleichende Analyse der Reproduzierbarkeit zwischen der visuellen Gradierung und der ImageJ-gestützten quantitativen Messung der subchondralen Knochendicke.
Der Korrelationskoeffiziententest legt nahe, dass die quantitative Messung relativ reproduzierbarer war als das visuelle Bewertungssystem. Diese Abbildung zeigt eine vergleichende Sensitivitätsanalyse der visuellen Gradierung und die ImageJ-gestützte quantitative Messung der subchondralen Knochendicke im medialen Femurkondylus und im medialen Tibiaplateau. Die histologischen Bilder für die visuelle Schätzungsbewertung wurden in drei Gruppen unterteilt.
Der quantitative subchondrale Knochendickenwert aller drei Beobachter für die DMM-Bilder mit einem visuellen Null-Score war signifikant höher als der der Sham-Bilder mit einem visuellen Null-Score, was darauf hindeutet, dass die quantitative Messung empfindlicher ist als die visuelle Einstufung auf eine leichte subchondrale Knochenverdickung. Das neu entwickelte Protokoll zur quantitativen Messung der osteoarthritischen subchondralen Knochendicke ist empfindlicher gegenüber leichten subchondralen Knochenveränderungen als die weit verbreiteten visuellen Grading-Systeme. Und dieses Protokoll kann zur Erkennung früher osteoarthritischer subchondraler Knochenveränderungen und zur Beurteilung der In-vivo-Wirksamkeit von Osteoarthritis-Behandlungen in Verbindung mit osteoarthritis knorpelgrading verwendet werden.
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Übersicht
Dieser methodische Artikel stellt ein softwaregestütztes, quantitatives Messverfahren zur Bestimmung der histologischen subchondralen Knochendicke in murinen Kniegelenken mit Osteoarthritis sowie in normalen Kniegelenken als Kontrollen vor. Das Protokoll ist so konzipiert, dass es hochgradig empfindlich gegenüber geringfügigen Verdickungen ist und sich daher zur Detektion früher osteoarthritischer Veränderungen eignet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Forschung zur Osteoarthritis
- Histologie
Hintergrund
- Die Verdickung des subchondralen Knochens ist ein Kennzeichen der Osteoarthritis.
- Aktuelle Methoden stützen sich auf visuelle Schätzungen und semiquantitative Einstufungen.
- Ein reproduzierbares Protokoll ist erforderlich, um genaue Messungen durchzuführen.
- Die Studie verwendet ein Mausmodell, das durch eine Destabilisierung des medialen Meniskus induziert wurde.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines quantitativen Messprotokolls für die Dicke des subchondralen Knochens.
- Verbesserung der Empfindlichkeit bei der Detektion früher osteoarthritischer Veränderungen.
- Bereitstellung einer standardisierten Methode für zukünftige Forschungsarbeiten.
Verwendete Methoden
- Chirurgische Destabilisierung des mediale Meniskus bei Mäusen.
- Histologische Verfahren einschließlich Fixierung, Dekalzifizierung und Färbung.
- Mikroskopische Bildgebung zur Analyse.
- Quantitative Messung mithilfe der ImageJ-Software.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Erstellung eines Mausmodells für das Kniegelenk-Osteoarthritis.
- Nachweis von Gelenkknorpeldefekten und Osteophytbildung.
- Quantitative Beurteilung der subchondralen Knochendickung erreicht.
- Protokoll zeigt eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen der Knochendicke.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll ermöglicht eine genaue Messung der Dicke des subchondralen Knochens.
- Diese Methode kann das Verständnis des Fortschreitens der Osteoarthritis verbessern.
- Zukünftige Studien können dieses Protokoll für weitere Forschungen zur Osteoarthritis nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Messung der subchondralen Knochendicke schließt eine entscheidende Lücke bei der Zielstrukturvalidierung der Osteoarthritis, indem sie die subjektive visuelle Einstufung durch eine reproduzierbare, softwaregestützte Analyse ersetzt. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, da er den Nachweis früher, subtiler struktureller Veränderungen ermöglicht, die einem offensichtlichen Knorpelabbau vorausgehen. Die Methode unterstützt die mechanistische Risikominderung von Osteoarthritis-Therapeutika, indem sie einen standardisierten, übertragbaren Biomarker für Knochenumbauwege bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die auf Signalwege der subchondralen Knochenumbildung bei Arthrose abzielen.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Messgrößen zur funktionellen Zielstrukturvalidierung in murinen Arthrose-Modellen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er milde Knochendickung erfasst, die für visuelle Bewertungssysteme unsichtbar bleibt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte histologische Proben für standardisierte, hochdurchsatzfähige Analysen mittels ImageJ vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt kontinuierliche, schwellenwertunabhängige Messungen der subchondralen Knochenfläche für die Wirkstoff-Screening.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen OA-Studien mit konsistenten Definitionsbereichen für die Interessenregion im medialen Femurkondylus und Tibiakondylus.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Korreliert mit der menschlichen Pathologie der Osteoarthritis, bei der eine subchondrale Sklerose ein charakteristisches Merkmal des Fortschreitens darstellt.
- Translationale Kontinuität: Verbindet Forschung und präklinische Abläufe, indem sie einen Biomarker bereitstellt, der mit der Knorpelgraduierung kompatibel ist.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Unterstützt Go/No-Go-Kriterien basierend auf quantitativen Veränderungen der Knochendicke in Studien zur Therapiewirksamkeit.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Protokoll passt in den Entdeckungsprozess der Osteoarthritis von der Target-Validierung über die Lead-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsbewertung, insbesondere wenn die Knochenremodellierung im mechanistischen Fokus steht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Zielstrukturen, die an der subchondralen Knochensklerose und der Mechanotransduktion beteiligt sind.
- Screening: Liefert assaysbereite, reproduzierbare quantitative Ergebnisse zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Knochendicke.
- Analytik: Ermöglicht den statistischen Vergleich der Knochendicke zwischen Gruppen mithilfe der beschriebenen Pearson-Korrelation sowie t-Test/ANOVA.
- Translationale Forschung: Schließt an die präklinische Validierung an, indem ein Biomarker bereitgestellt wird, der klinischen OA-Progressionsmetriken entspricht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Workflow für die histologische Analyse, der auf verschiedene OA-Modelle und Behandlungsarme übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem die Unsicherheit bei der Beurteilung von Knochenphänotypen verringert wird.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Messung zwischen Beobachtern und Sitzungen mit geringer intra- und interindividueller Variabilität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühe strukturelle Veränderungen erkannt werden, die bei semiquantitativer Bewertung übersehen werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung basierend auf sensitiven, quantitativen Endpunkten des Knochenumbaus.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der histologischen Probenvorbereitung und der Threshold-Analyse mit ImageJ.
- Abhängig von kalibrierter Mikroskopie und konsistenter Definition des interessierenden Bereichs.
- Erfordert die Standardisierung von Messprotokollen über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind modellspezifische Knochenanatomie und Färbeprotokolle.
- Praktische Einschränkung: Die manuelle Umrandung kann Variabilität einführen, wenn die Definitionen des interessierenden Bereichs nicht streng standardisiert sind.
