Name: Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Erfahren Sie die Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA mittels DNA-Curtains-Methode. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Phasenseparation und liefert Erkenntnisse über die Tumorgenese des Ewing-Sarkoms.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) unterstützt.

<ol><li>Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+regulation+of+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization and regulation of gene transcription.</a> Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+ncRNAs+allosterically+modify+RNA-binding+proteins+in+cis+to+inhibit+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription.</a> Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).</li>
<li>Alexander, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mediates+target+gene+association+with+nuclear+speckles+for+amplified+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).</li>
<li>Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+required+for+accurate+initiation+of+transcription+by+purified+RNA+polymerase-II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II.</a> Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).</li>
<li>Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+and+3D+genome+conformation+in+cell-fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions.</a> Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).</li>
<li>Peng, Y., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+super-enhancer%3A+Positive+regulators+in+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Models+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription.</a> Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human transcription factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-nuclear+mobility+and+target+search+mechanisms+of+transcription+factors%3A+a+single-molecule+perspective+on+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).</li>
<li>Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion-driven+mechanisms+of+protein+translocation+on+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids.</a> Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).</li>
<li>Loverdo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+hopping+and+jumping+in+facilitated+diffusion+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins.</a> Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).</li>
<li>Boija, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+activate+genes+through+the+phase-separation+capacity+of+their+activation+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains.</a> Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).</li>
<li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), (2018).</li>
<li>Kim, S., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+interplay+between+transcription+factors+and+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome.</a> Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).</li>
<li>Shrinivas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+features+that+drive+formation+of+transcriptional+condensates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates.</a> Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+DNA-induced+phase+separation+for+transcriptional+repressor+VRN1%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).</li>
<li>Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+binding+between+distant+transcription+factors+is+a+hallmark+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers.</a> Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Qi, Z., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+recombination+intermediates+with+single-stranded+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains.</a> Methods. 105, 62-74 (2016).</li>
<li>Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+dynamics+of+human+RPA+and+RAD51+on+ssDNA+during+assembly+and+disassembly+of+the+RAD51+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1+alpha+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547, 236-240 (2017).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loci-specific+phase+separation+of+FET+fusion+oncoproteins+promotes+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription.</a> Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).</li>
<li>Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains%3A+novel+tools+for+imaging+protein-nucleic+acid+interactions+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level.</a> Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).</li>
<li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging.</a> Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).</li>
<li>Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+EWS%2FFLI+regulation+via+GGAA+microsatellites+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma.</a> Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).</li>
<li>Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ETS+family+of+oncogenic+transcription+factors+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours.</a> Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).</li>
<li>Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+C+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+biological+reaction+intermediates+with+DNA+curtains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Da Einzelmolekülansätze extrem empfindlich auf den Inhalt des Reaktionssystems reagieren, müssen zusätzliche Anstrengungen unternommen werden, um eine gute Qualität aller Materialien und Lösungen während der DNA-Vorhangexperimente zu gewährleisten, insbesondere der in den Abschnitten 1 und 2 hergestellten Lipide und der in Abschnitt 5 verwendeten Puffer. Zur Herstellung von Puffern müssen Reagenzien höherer Reinheit verwendet werden, und Puffer müssen frisch für den Einzelmolekültest vorbereitet werden.
<p class="jov...

Die transkriptionelle Regulation ist ein entscheidender Schritt für eine präzise Genexpression in lebenden Zellen. Viele Faktoren, wie chromosomale Modifikation, Transkriptionsfaktoren (TFs) und nicht-kodierende RNAs, sind an diesem komplizierten Prozess beteiligt 1,2,3. Unter diesen Faktoren tragen TFs zur Spezifität der Transkriptionsregulation bei, indem sie spezifische DNA-Sequenzen, die als Promotoren oder Enhancer bekannt sind, erkennen und daran binden und anschließend andere funktionelle Proteine rekrutieren, um die Transkription zu aktivieren oder zu unterdrücken 4,5,6,7. Wie diese TFs es schaffen, nach ihren Zielstellen im menschlichen Genom zu suchen und mit DNA zu interagieren, die mit Histonen und nicht-histon-DNA-bindenden Proteinen beschichtet ist, hat Wissenschaftler seit Jahrzehnten verblüfft. In den letzten Jahren wurden mehrere klassische Modelle für den Zielsuchmechanismus von TFs entwickelt, um zu beschreiben, wie sie entlang derDNA-Kette 8,9,10,11 "gleiten", "hüpfen", "springen" oder "intersegmentieren". Diese Modelle konzentrieren sich auf das Suchverhalten auf der DNA eines einzelnen TF-Moleküls. Neuere Studien zeigen jedoch, dass einige TFs entweder allein im Zellkern oder mit dem Mediator-Komplex12 einer Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) unterzogen werden. Die beobachteten Tröpfchen von TFs sind mit den Promotor- oder Enhancerregionen assoziiert, was die Rolle der biomolekularen Kondensatbildung bei der Transkription und dem dreidimensionalen Genomunterstreicht 13,14,15. Diese biomolekularen Kondensate sind in vivo und in vitro mit membranfehlenden Kompartimenten verbunden. Sie werden über LLPS gebildet, in dem modulare Biomakromoleküle und intrinsisch ungeordnete Regionen (IDRs) von Proteinen zwei Hauptantriebskräfte multivalenter Wechselwirkungen sind16. Somit suchen TFs nicht nur DNA, sondern funktionieren auch synergistisch innerhalb dieser Kondensate 4,17,18. Bis heute ist die biophysikalische Eigenschaft dieser Transkriptionskondensate auf DNA unklar.
Daher zielte diese Studie darauf ab, eine Einzelmolekülmethode - DNA-Vorhänge - anzuwenden, um die Bildung und Dynamik der von TFs gebildeten Transkriptionskondensate auf DNA in vitro direkt abzubilden. DNA Curtains, eine Hochdurchsatz-In-vitro-Bildgebungsplattform zur Untersuchung der Interaktion zwischen Proteinen und DNA, wurde bei der DNA-Reparatur 19,20,21, der Zielsuche22 und LLPS 17,23,24 eingesetzt. Die Flusszelle von DNA Curtains ist mit biotinylierten Lipiddoppelschichten beschichtet, um die Oberfläche zu passivieren und die Biomoleküle auf der Oberfläche diffundieren zu lassen. Die nanofabrizierten Zick-Zack-Muster begrenzen die Bewegung der DNA. Biotinylierte Lambda-DNA-Substrate können sich entlang der Barrierekanten ausrichten und durch den orientierten Pufferfluss gedehnt werden. Die gleichen Start- und Endsequenzen aller Moleküle erlauben die Verfolgung des Proteins auf der DNA und beschreiben die Positionsverteilung der Bindungsereignisse25,26. Darüber hinaus trägt die Kombination von DNA-Vorhängen mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) dazu bei, das Hintergrundrauschen zu minimieren und Signale auf Einzelmolekülebene zu detektieren. Daher könnten DNA-Vorhänge eine vielversprechende Methode sein, um die Dynamik der Transkriptionskondensatbildung an DNA-Motiven zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt das Beispiel eines Fusionsonkoproteins der FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie, EWS-FLI1, das durch chromosomale Translokation erzeugt wird. Lambda-DNA mit 25× GGAA - der Bindungssequenz von EWS-FLI127 - wurde als DNA-Substrat in den DNA-Vorhangexperimenten verwendet, um zu beobachten, wie EWS-FLI1-Moleküle LLPS auf DNA durchlaufen. Dieses Manuskript diskutiert das experimentelle Protokoll und die Methoden der Datenanalyse im Detail.

<table><tbody><tr><td>488 nm diodengepumpter Festkörperlaser</td><td>Coherent</td><td>OBIS488LS</td><td></td></tr><tr><td>diodengepumpter Festkörperlaser 561 nm</td><td>Coherent</td><td>OBIS561LS</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Rhawn</td><td>R003215-50g</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes DOPE</td><td>Avanti</td><td>870273P</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Amresco</td><td>1595C027</td><td></td></tr><tr><td>Beschichtung Electra 92</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-PC 5090.02</td><td>Die leitfähige Schutzbeschichtung</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I Rind</td><td>Sigma</td><td>D5139-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Sigma</td><td>Z805939-1EA</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda Packung Extrakte</td><td>Epizentrum</td><td>MP5120</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>s3014</td><td></td></tr><tr><td>Nanoport</td><td>Idex</td><td>N-333-01</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NZCYM Bouillon</td><td>Sigma</td><td>N3643-250G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-2000 DOPE</td><td>Avanti</td><td>880130P-1G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 200K, ETHYLLACTAT 4%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 649.04</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950K, ANISOL 2%</td><td>Allresist GmbH</td><td>AR-P 672.02</td><td></td></tr><tr><td>Prime 95B Scientific CMOS Kamera</td><td>PHOTOMETRICS</td><td>Prime95B</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Quarzglas Objektträger</td><td>G.Finkenbeiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sechs-Wege-Injektionsventil</td><td>Idex</td><td>MXP9900-000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo</td><td>S888</td><td>Verdünnt mit ddH2</td></tr><tr><td>O Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Pump11 Elite</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146V</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1 Iodid (491/509)</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td>Verdünnt mit DMSO</td></tr></tbody></table>

einzelmolekül-bildgebung von ews-fli1-kondensaten auf dna

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

Die Fusionsgene, die aus der chromosomalen Translokation resultieren, wurden in vielen soliden Tumoren oder Leukämien gefunden. EWS-FLI1, das zur FUS/EWS/TAF15 (FET)-Familie von Fusionsonkoproteinen gehört, ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene beim Ewing-Sarkom. Diese Fusionsproteine der FET-Familie beherbergen typischerweise eine Low-Complexity-Domäne (LCD) des FET-Proteins an ihrem N-Terminus und eine DNA-bindende Domäne (DBD) an ihrem C-Terminus. Es wurde bestätigt, dass EWS-FLI1 aufgrund von LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen biomolekulare Kondensate an seinen Zielbindungsstellen bildet, und diese Kondensate können RNA-Polymerase II rekrutieren, um die Gentranskription zu verbessern. Wie diese Kondensate an ihren Bindungsstellen zusammengesetzt werden, bleibt jedoch unklar. Kürzlich wurde eine Einzelmolekül-Biophysik-Methode - DNA Curtains - angewendet, um diese Montageprozesse von EWS-FLI1-Kondensaten zu visualisieren. Hier werden die detaillierten experimentellen Protokoll- und Datenanalyseansätze für die Anwendung von DNA-Vorhängen bei der Untersuchung der biomolekularen Kondensate diskutiert, die sich auf Ziel-DNA ansammeln.

Das Schema der DNA-Vorhänge ist in Abbildung 1A, Abbildung 1B und Abbildung 1D dargestellt. Die klonierte Zielsequenz mit 25 ununterbrochenen Wiederholungen von GGAA befindet sich im NORB1-Promotor des Ewing-Sarkoms. Diese Zielsequenz ist entscheidend für die EWS-FLI1-Rekrutierung28. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-nm-La...

Hier beschreiben wir die Verwendung der Einzelmolekül-Bildgebungsmethode DNA Curtains, um den biophysikalischen Mechanismus von EWS-FLI1-Kondensaten zu untersuchen, die sich auf DNA ansammeln.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

Wir bieten einen Einzelmolekül-Assay an, um die Phasentrennung von Transkriptionsfaktoren auf DNA zu beobachten Diese Technik ermöglicht die Echtzeitrealisierung des dynamischen Prozesses von Transkriptionsfaktoren, die sich als flüssiges Tröpfchen auf DNA zusammensetzen. EWS-FL1 ist eines der am häufigsten beteiligten Fusionsgene bei der Tumorgenese des Ewing-Sarkoms. Unsere Forschung konnte den Zusammenhang zwischen der DNA-Motivzahl und der EWS-FL1-Kondensatbildung identifizieren, die mit einer unfruchtbaren Gentranskription in Tumorzellen assoziiert ist und für die Prognose hilfreich sein kann.Diese Methode könnte angewendet werden, um alle Transkriptionskondensate oder -komplexe in vitro wie P53 und MED1 zu untersuchen. Um eine Flusszelle mit Zickzack-Nanobarrieren für ein DNA-Vorhangexperiment vorzubereiten, verbinden Sie die Eingangs- und Ausgangsröhren in die richtige Richtung. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer mit zwei Drei-Milliliter-Spritzen, um sicherzustellen, dass sich keine Blase in der Durchflusszelle befindet.Nehmen Sie die Spritze aus dem Ausgang und injizieren Sie dreimal einen Milliliter der Liposomenlösung mit einer fünfminütigen Inkubation zwischen jeder Injektion. Zur Heilung die Flusszelle mit 2,5 Milliliter Lipidpuffer langsam erneut waschen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie während der Inkubation den BSA-Puffer wie im Textmanuskript erwähnt vor.Nach 30 Minuten Heilung waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer von der Ausgangsseite. Als nächstes injizieren Sie 800 Mikroliter Streptavidinpuffer in zwei Schritten von der Eingangsseite in die Durchflusszelle mit einer 10-minütigen Inkubation nach jedem Schritt. Dann waschen Sie die Durchflusszelle mit 2,5 Milliliter BSA-Puffer, um alle freien Streptavidinmoleküle zu entfernen.Als nächstes verdünnen Sie die Biotin-Lambda-DNA mit geklonten Motiven unter Verwendung von BSA-Puffer und injizieren Sie sie viermal langsam in Fünf-Minuten-Abständen. Schalten Sie während der Injektion das Mikroskop im wissenschaftlichen komplementären Metalloxid-Halbleitersystem ein. Dann waschen Sie den Schlauch mit 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser und spülen Sie das Prisma und den Schlauchanschluss mit Wasser, 2% flüssigem Küvettenreiniger und 99% Ethanol.Als nächstes ziehen Sie mindestens 20 Milliliter des Bildgebungspuffers in eine 30-Milliliter-Spritze. Stellen Sie die Durchflusszelle auf dem Mikroskoptisch auf und verbinden Sie sie mit dem mikrofluidischen System. Mit einer Flussrate von 0,03 Milliliter pro Minute spülen Sie die DNA-Moleküle 10 Minuten lang zur Barriere.Schalten Sie dann das mikrofluidische System aus und inkubieren Sie für 30 Minuten. mit dem Fluss gestoppt, so dass die DNA seitlich diffundieren kann. Um die EWS-FLI1-Kondensationsbildung auf DNA-Vorhängen abzubilden, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und suchen und markieren Sie die Positionen der neun Zickzackmuster unter Hellfeld.Schalten Sie dann den Fluss bei 0,2 Milliliter pro Minute ein, um die DNA 10 Minuten lang mit doppelsträngigem DNA-Farbstoff zu färben. Als nächstes verdünnen Sie das mCherry EWS-FLI1-Protein mit dem Bildgebungspuffer in einer Konzentration von 100 Nanomol in 100 Mikrolitern. Laden Sie dann die Proteinprobe mit einer 100-Mikroliter-Glasspritze durch das Ventil und ändern Sie die Durchflussrate auf 0,4 Milliliter pro Minute.Nach dem Einschalten des 488-Nanometer-Lasers scannen Sie jede Region vor, um den DNA-Verteilungszustand zu überprüfen und den Bereich auszuwählen, in dem sich die DNA-Moleküle gleichmäßig verteilen. Stellen Sie dann die Laserleistung auf 10% für den 488-Nanometer-Laser und 20% für den 561-Nanometer-Laser ein. Messen Sie mit dem Leistungsmesser die tatsächliche Laserleistung in der Nähe des Prismas.Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern im Abstand von zwei Sekunden mit 488- und 561-Nanometer-Lasern gleichzeitig. Ändern Sie dann das Ventil vom manuellen Modus in den Injektionsmodus, damit der Bildgebungspuffer die Proteinprobe nach 60 Sekunden in die Durchflusszelle spülen kann. Um das freie EWS-FLI1 zu entfernen, waschen Sie die Flusszelle fünf Minuten lang mit dem Bildpuffer, wobei nur der 561-Nanometer-Laser eingeschaltet ist.Dann stoppen Sie den Fluss und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Schalten Sie nach 10 Minuten den Fluss mit 0,4 Milliliter pro Minute ein, damit sich die DNA ausdehnen kann, und nehmen Sie Bilder in Zwei-Sekunden-Intervallen zwischen verschiedenen Frames auf, um Hochdurchsatzdaten der EWS-FLI1-Kondensatbildung zu erhalten. EWS-FLI1-Moleküle wurden durch Detektion der mCherry-markierten EWS-FLI1-Signale visualisiert, die mit einem 561-Nanometer-Laser erhalten wurden.Die in vitro Bildung von EWS-FLI1-Kondensat an der Stelle der 25 GGAA-Wiederholungen im DNA-Substrat konnte direkt visualisiert werden. Die Spezifität des in DNA-Vorhängen verwendeten mCherry EWS-FLI1 wurde durch einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstest unter Verwendung einer DNA-Vorlage mit und ohne die 25 GGAA-Wiederholungen separat bestätigt. Wenn die EWS-FLI1-Konzentration von 20 auf 500 Nanomol titriert wurde, stieg die EWS-FLI1-Intensität dramatisch an.Während die Änderung der FLI-DBD-Intensität vernachlässigbar war, wenn die Proteine gesättigt waren, um die GGAA-Wiederholungen abzudecken, deutet dies darauf hin, dass EWS-FLI1 Kondensate auf der DNA bildete. Die Injektion sollte sehr langsam und weich sein, damit sich das Liposom und die DNA gleichmäßig auf der Flusszelle verteilen können. Es ist wichtig, MSA durchzuführen, um zu bestätigen, dass ein gereinigter Transkriptionsfaktor spezifisch an die Zielsequenz in vitro bindet.Diese Technik ermöglicht es zu untersuchen, ob das Kondensat die gezielte Suche nach Transkriptionsfaktoren und seine Wirkung auf die Transkription erleichtert.

single-molecule-imaging-of-ews-fli1-condensates-assembling-on-dna

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Dieses Video beschreibt eine Methode, um die Assemblierung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Molekülen an bestimmten Loci mit Hilfe von Einzelmolekül-Bildgebung zu visualisieren. Diese Kondensate werden durch LCD-LCD- und LCD-DBD-Wechselwirkungen gebildet, die die Rekrutierung von RNA-Polymerase II und eine verbesserte Gentranskription ermöglichen.

Einzelmolekül-Bildgebung zur Visualisierung der Ansammlung von Fusionsprotein-Kondensaten auf DNA-Vorhängen

Hier beschreiben wir die Instrumentierung und Verfahren zum Nachweis einzelner fluoreszenzmarkierten Proteinmoleküle in Wechselwirkung mit einem einzelnen DNA-Molekül zwischen den zwei optisch eingeschlossene Mikrokügelchen suspendiert.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll demonstriert die Durchführung eines Einzelmolekül-Assays zur Live-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase. Sie beschreibt (1) die Herstellung eines DNA-Substrats, (2) die Reinigung der fluoreszenzmarkierten Drosophila melanogaster CMG-Helikase, (3) die Vorbereitung einer mikrofluidischen Durchflusszelle für die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) und (4) den Einzelmolekül-DNA-Entwindungsassay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Erfahren Sie die Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA mittels DNA-Curtains-Methode. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Phasenseparation und liefert Erkenntnisse über die Tumorgenese des Ewing-Sarkoms.

Einzelmolekül-Bildgebung von EWS-FLI1-Kondensaten auf DNA

Weitere Videos entdecken