Name: Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Lernen Sie die Live-Bildgebung olfaktorischer Schaltkreise in Drosophila auf Einzelaxon-Ebene. Dieses Explantationssystem ermöglicht hochauflösende Zeitraffer-Studien neuronaler Entwicklung.

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Wir danken N. Özel und R. Hiesinger für ihre Ratschläge zur Explantationskultur; M. Wagner für die technische Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie; D.J. Luginbuhl zur Erzeugung transgener Fliegen; D. Friedmann für Anregungen zur Fidschi-Softwareanalyse; Y. Ge für Unterstützung bei der Fliegenarbeit; C. McLaughlin und K.K.L. Wong für Kommentare zum Manuskript. L.L. ist ein Ermittler des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der National Institutes of Health 1K99DC01883001 (an T.L.) und R01-DC005982 (an L.L.) unterstützt.

1. Herstellung von Reagenzien
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll werden bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchgeführt, sofern nicht anders erklärt.
<ol><li>Um die Kulturschale für die Immobilisierung des Explantats während der Zeitrafferbildgebung vorzubereiten, legen Sie 0,5 cm dickes Sylgard (vor Gebrauch zwei flüssige Komponenten im Verhältnis 10:1 gründlich mischen) auf die Unterseite einer 60 mm x 15 mm großen Petrischale und lassen Sie es bei Raumtemperatur 48 h aushärten (Abbildung 2A, im folgenden Text als Sylgard-Platte bezeichnet).</li>
	<li>Um Mikrostifte für die Immobilisierung des Explantats auf dieser Platte vorzubereiten, verwenden Sie eine Pinzette, um mehrere Mikrostifte auf ein Band zu kleben, wobei die scharfen Enden auf einer Seite ausgerichtet sind (Abbildung 2B). Verwenden Sie eine Schere, um ~ 2 mm von den scharfen Enden der Mikrostifte zu schneiden (Abbildung 2B'). Verwenden Sie eine Pinzette, um die geschnittenen Mikrostifte zu halten, und setzen Sie eine vorgefertigte Sylgard-Platte in die Sylgard-Schicht ein (Abbildung 2C). Zwei Mikrostifte werden verwendet, um ein Explantat zu immobilisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Pinsel, um weiße Puppen zu sammeln, die innerhalb von 1 h Puparium bilden, von hsFLP, Kieselstein-GAL4 / +; UAS-FRT 100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 Genotyp und Transfer auf neue Fläschchen. Hitzeschock im 37 °C Wasserbad für 40 Minuten, um spärliche ORN-Klone von zufälligen Typen zu induzieren. Nach einem Hitzeschock die Fläschchen 30 h lang auf 25 ° C stellen, was dazu führt, dass die Puppen nach der Pupariumbildung (APF) um 30 h gealtert sind.</li>
	<li>Um das Kulturmedium für die Explantation vorzubereiten, fügen Sie 5 ml Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) zu 500 ml Schneiders Drosophila Medium hinzu. Filtern Sie das Medium und machen Sie 45 mL Aliquots in 50 mL konischen Röhrchen. Das Medium kann 1-2 Monate bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Nehmen Sie am Tag der Bildgebung eine Tube mit 45 ml Drosophila-Medium von Schneider und fügen Sie 5 ml fetales Rinderserum (10% v/v), 125 μL 4 mg/ml Humaninsulinstammlösung (10 μg/ml Endkonzentration), 50 μL 1 mg/ml 20-Hydroxyecdyson-Stammlösung, gelöst in Ethanol (1 μg/ml Endkonzentration), hinzu. Mischen Sie gut und übertragen Sie 15 ml volles Medium in ein neues konisches 50-ml-Rohr. Der Rest des gesamten Mediums kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. Fetales Rinderserum, humane Insulinstocklösung und 20-Hydroxyecdyson-Stammlösung werden aliquotiert und bei -20 °C gelagert.</li>
	<li>Oxygenieren Sie das 15 ml volle Medium, indem Sie Sauerstoffblasen aus einer Sauerstoffflasche unter der Flüssigkeitsoberfläche durch eine sterile 5 ml Pipettenspitze mit einer Rate von einer Blase / s für 20-30 min pumpen. Verwenden Sie eine Paraffinfolie, um die Öffnung der Tube während dieses Vorgangs abzudecken.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Oberfläche des Sezierbrunnens und die Sylgard-Platte (mit Mikrostiften, die auf die Sylgard-Schicht eingesetzt und in den Schritten A1 und A2 vorbereitet wurden) mit 70% Ethanol. Vor Gebrauch trocknen lassen.</li>
</ol>2. Explantisierung
<ol><li>Verwenden Sie eine Bürste, um 30 h APF (30 h nach Pupariumbildung) Puppen auf ein Papiertuch zu übertragen und die äußere Oberfläche der Puppen für 5 min zu trocknen.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf einen Glasschieber. Befestigen Sie die getrockneten Puppen vorsichtig auf der klebrigen Oberfläche des Bandes, wobei die Rückenseite nach oben zeigt. Drücken Sie die Puppen vorsichtig mit einem Pinsel, damit die Bauchseite der Puppen gut am Band befestigt werden kann (Abbildung 3A). Beschädigen Sie die Puppe nicht.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um braunes Puppengehäuse zu entfernen, das die dorsale Seite des Kopfes bedeckt (Abbildung 3A, B). Führen Sie eine scharfe Spitze der Pinzette zwischen der braunen Puppenkoffer und der Puppe von der Seitenseite ein und brechen Sie die braune Puppenkoffer vorsichtig durch eine Linie zum hinteren Ende der Puppe (Abbildung 3B, C). Öffnen Sie die braune Puppenhülle. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Puppe vorsichtig zu halten und mit 1 ml sauerstoffreichem Vollmedium auf die Dissektionsschacht zu übertragen. Tauchen Sie schwimmende Puppen auf die mittlere Oberfläche, damit sie auf den Boden des Bohrlochs sinken kann (Abbildung 3D). HINWEIS: Führen Sie die Pinzettenspitze nicht zu tief in die braune Puppenhülle ein, um zu verhindern, dass die Puppe mit der Pinzette verletzt wird.</li>
	<li>Um die Antennen-Hirn-Explantation aus der Puppe zu sezieren, verwenden Sie eine Pinzette, um die Puppe vorsichtig mit einer Hand zu halten, und schneiden Sie mit einer Mikroschere ein kleines Loch von der hinteren Seite der Puppe mit der anderen Hand (Abbildung 3E). Dieses kleine Loch löst den hohen Druck in der Puppe.</li>
	<li>Schneiden Sie mit der Mikroschere die ventrale Mittellinie der Puppe vom Loch bis zum Hals (die schmale Struktur, die den Kopf und den Thorax verbindet) durch (Abbildung 3F). Schneiden Sie dann den Umfang des Halses durch, um den Kopf vom Körper der Puppe zu lösen (Abbildung 3G). Entfernen Sie den Körper und legen Sie ihn in einen anderen Brunnen. HINWEIS: Schneiden Sie den Hals nicht direkt von der dorsalen/ventralen Seite der Puppe ab, die das Gehirn zusammendrücken kann.</li>
	<li>Schneiden Sie die transparente Kutikula ab, die die dorsale Seite des Gehirns bedeckt (Abbildung 3H). Dies wird den fetten Körper auf dem Gehirn freilegen. Bewahren Sie eine Kutikula auf, an der die Netzhaut und die Antennen befestigt sind. Wiederholen Sie den gleichen Vorgang auf der ventralen Seite des Gehirns. HINWEIS: Führen Sie die Klinge der Schere nicht zu tief unter die Kutikula ein, da dies zu einer Durchtrennung der Antennennerven führt, die die Antennen und das Gehirn verbinden (Abbildung 3H').</li>
	<li>Verwenden Sie eine P10-Pipette, um den Fettkörper, der das Gehirn und die Antennen bedeckt, sanft auszuwaschen, indem Sie das Medium in Richtung der offenen Regionen auf der dorsalen und ventralen Seite des Kopfes pipettieren (Abbildung 3I). HINWEIS: Seien Sie sehr vorsichtig beim Pipettieren des Mediums, da sich das Gehirn leicht von der Kutikula lösen kann. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Fettkörper während dieses Schritts entfernt wird. Gestoppte Entwicklung von ORN-Axonen wurde beobachtet, wenn der Fettkörper nicht gut gereinigt wurde, wahrscheinlich aufgrund eines schlechten Sauerstoffzugangs aus dem Medium.</li>
	<li>Um die Wechselwirkung von bilateralen ORN-Axonen oder ORN-Axonen mit PN-Dendriten-Targeting zu untersuchen, trennen Sie in diesem Stadium8 einen oder zwei Antennennerven mit der Mikroschere (Abbildung 3J). Platzieren Sie vorsichtig die Klingen der Schere zwischen der Nagelhaut und dem Gehirn und durchtrennen Sie interessierte Antennennerven.</li>
	<li>Um das sezierte Explantat auf die Sylgard-Platte zu übertragen, legen Sie einen Tropfen sauerstoffhaltigen Vollmediums (~ 200 μL) auf die Sylgard-Oberfläche. Beschichten Sie die innere Oberfläche einer 200 μL breiten Pipettenspitze mit dem Fettkörper aus dem sezierten Stamm (Schritt 1.6), indem Sie den Fettkörper mehrmals pipettieren, wodurch verhindert wird, dass die Explantate während des Transfers die Pipettenspitze verkleben. Verwenden Sie dann diese breite Pipettenspitze, um das Explantat aus der Dissektionsvertiefung auf das mittlere Tröpfchen auf der Kulturplatte zu übertragen (Abbildung 3K).</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um das Explantat auf der Sylgard-Schicht in den beiden optischen Lappen zu befestigen (Abbildung 3L). Positionieren Sie die Sylgard-Platte vorsichtig auf der Bildgebungsstation und immobilisieren Sie die Platte mit Bändern. Fügen Sie der Sylgard-Platte langsam 10 ml sauerstoffhaltiges Vollmedium mit P1000-Pipette hinzu. HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Explantat zu stören, wenn Sie das Medium zur Sylgard-Platte hinzufügen.</li>
</ol>3. Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierte Live-Bildgebung
<ol><li>Um Zeitraffer-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Mikroskop, einen Ti: Saphir-Laser, ein 20-faches Wasser-Tauchobjektiv (1,0 NA) und eine Bildgebungssoftware. Verwenden Sie die Anregungswellenlänge bei 920 nm für die Abbildung von GFP-Proteinen. Stellen Sie die Verweildauer des Pixels auf 10 μs ein.</li>
	<li>Stellen Sie die Position der Bildgebungsstation so ein, dass sich die Explantate grob unter dem Objektiv befinden. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Linse vor der Bildgebung zu sterilisieren. Senken Sie das Objektiv langsam unter dem Medium in der Nähe der Explantate ab. Überprüfen Sie, ob sich eine Blase auf der Linse des Objektivs befindet.<ol>
<li>Wenn ja, heben Sie das Objektiv über das Medium und wiederholen Sie dies, bis die Blase verschwunden ist. Finden Sie die Explantate mit dem Okular und zentrieren Sie ein Explantat auf dem Feld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um ein Explantat mit ein paar ORNs zu gewährleisten, die für die Zeitrafferbildgebung spärlich beschriftet sind, sezieren Sie jedes Mal ~ 10 Explantate und richten Sie sie auf der y-Achse auf der Kulturplatte aus. Sieb alle Explantationen, indem Sie das Objektiv entlang der y-Achse bewegen, und wählen Sie ein Explant, bei dem einige einzelne ORN-Axone gerade den Antennenkeule für die Bildgebung erreicht haben (Abbildung 4A).<ol>
<li>Erkennen Sie den Antennenlappen an seiner ovalen Form und den ORN-Axonen, die ihn zu umrunden beginnen. Abbildung eines ~150 μm x 150 μm großen Bereichs in der xy-Ebene (3-facher Zoom mit dem 20-fachen Objektiv). Schätzen Sie die Grenze der beiden Antennenlappen und zentrieren Sie sie im Bildbereich.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie einen anfänglichen Bildbereich entlang der z-Achse aus, indem Sie den unteren und oberen Abschnitt des Scannens definieren. Richten Sie den Bildgebungsbereich entlang der z-Achse ein. Stellen Sie den tiefsten Abschnitt mit ORN-Axonsignalen als erste Bildgebungssitzung und die Sitzung 100 μm darüber (oberflächlichere Seite) als letzte Bildgebungssitzung ein (Abbildung 4B). HINWEIS: Dies lässt einige Abschnitte auf der Oberseite (oberflächliche Seite) der ORN-Axone und vermeidet eine Verschiebung der ORN-Axone nach oben außerhalb des Bildgebungsbereichs aufgrund des Wachstums des Gehirns während der Kultur.<ol>
<li>Bild in Intervallen von 2 μm. Stellen Sie das automatische Scannen der Bildgebung mit der Häufigkeit alle 20 Minuten mithilfe der Bildgebungssoftware ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verschieben Sie den Bildgebungsbereich nach der ersten 4-stündigen Bildgebung entlang der z-Achse um 20 μm nach oben und nach 16 h Bildgebung um weitere 20 μm entlang der z-Achse. Dies kann durch das Setzen eines Skripts und verschiedener z-Stacks in der Imaging-Software erreicht werden.</li>
	<li>Kultivieren Sie das Explantat für einen zusätzlichen Zeitraum nach der Bildgebung (bis zu 24 h ex vivo) vor der Fixierung und Färbung mit N-Cadherin, einem Neuropil-Marker, um die genetische Identität jedes einzelnen ORN durch den Glomerulus zu enthüllen, auf den es abzielt.</li>
</ol>4. Bildverarbeitung
<ol><li>Um z-Stack-Bilder aus Abschnittsserien zu verarbeiten, die zu jedem Zeitpunkt mit der Fidschi-Software aufgenommen wurden, öffnen Sie die Bildabschnittsserie und klicken Sie auf Bild | Stapel | Z-Projekt [/].</li>
	<li>Um die seitliche Drift der Probe während der Kultur zu korrigieren, installieren Sie das TurboReg Plugin in Fidschi.<ol>
<li>Öffnen Sie eine z-Stack-Image-Serie und ein einzelnes z-Stack-Image aus der Serie. Plugins | öffnen Registrierung | TurboReg.</li>
		<li>Wählen Sie die z-Stack-Bildserie in der Quelle und das einzelne z-Stack-Bild in der Ziel-| aus Übersetzung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Batch, um alle Bilder aus der geöffneten z-stack-Bildserie zu registrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um den Nutzen von abgebildeten Proben zu maximieren, trennen Sie spärlich beschriftete einzelne Axone in der Nähe voneinander von den z-Stack-Bildern, die 3D-Bildschnitten folgen.<ol>
<li>Um einzelne ORN-Axone aus einigen Axonen im selben Bild zu extrahieren, öffnen Sie die Bildabschnittsreihe, klicken Sie auf Plugins | Segmentierung | Segmentierungs-Editor [/]. Wählen Sie das Pinselwerkzeug aus und maskieren Sie das interessierte ORN-Axon im Arbeitsfenster des Segmentierungseditors, indem Sie die Schaltflächen "+" oder "-" für jeden Bildausschnitt auswählen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Process | Bildrechner [/]. Wählen Sie "Bild X" in Bild 1, "Multiplizieren" in Betrieb, "Bild X. Beschriftungen" in Bild 2, [/]. Dadurch wird eine neue Bildseriendatei nur mit dem interessierten Axon erzeugt. Führen Sie Schritt 4.1 aus, um das z-Stack-Image zu verarbeiten. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Zeitpunkte, um eine Zeitreihenbilddatei zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um verschiedene Axone aus demselben Bild zu pseudofärben, führen Sie zunächst Schritt 4.3 aus, um die Zeitreihenbilddatei jedes Axons separat zu generieren. Öffnen Sie die Zeitreihenbilddateien für verschiedene einzelne Axone aus demselben Rohdatenbild. Klicken Sie auf Bild | Farbe | Kanäle zusammenführen. Wählen Sie verschiedene Zeitreihenbilddateien in verschiedenen Farbkanälen aus und klicken Sie auf OK.</li>
</ol>

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<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Drosophila-Antennen-Hirn-Explantat behält das normale Targeting des olfaktorischen Schaltkreises bei. Wir haben festgestellt, dass die Entwicklung ex vivo im Vergleich zu in vivo 2-mal langsamer ist. Es wird darauf hingewiesen, dass das Explantationssystem den Oberkieferpalp, der sechs Arten von ORNs beherbergt, nicht beibehält. Um sicherzustellen, dass die normale Entwicklung ex vivo rekapituliert wird, muss eine Dehnung der Antennennerven während der Explantissektion vermieden w...

Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Seit über 100 Jahren versuchen Neurowissenschaftler zu verstehen, wie sich Neuriten mit extremer Präzision auf ihre Zwischen- und Endziele ausdehnen. Infolgedessen haben sie wichtige Gene identifiziert, die Leitfäden für die Entwicklung neuronaler Prozessekodieren 1. Das olfaktorische System von Drosophila bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da olfaktorische Rezeptorneuronen (ORNs, die primären sensorischen Neuronen) auf 50 identifizierbare Glomeruli mit stereotyper Größe, Form und relativer Position projizieren, wo sie synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden, von denen jeder Dendriten an einen der 50 Glomeruli2 sendet (Abbildung 1A ). Daher ist es relativ einfach, mutierte Phänotypen bei synaptischer (glomerulärer) Auflösung im olfaktorischen Fliegensystem zu identifizieren. Dies führte zur Entdeckung wichtiger Gene, die die olfaktorische Schaltkreismontageregulieren 3.
Der Aufbau des olfaktorischen Flugkreislaufs beruht auf zeitlich und räumlich koordinierten Entwicklungsprozessen3. ORNs und PNs erwerben unterschiedliche Zellschicksale, die das Programm für ihre Verdrahtungsspezifika einrichten. Als nächstes mustern PN-Dendriten den Antennenlappen vor (Abbildung 1B). Die Axone von ORNs umrunden dann den ipsilateralen Antennenlappen und überqueren die Mittellinie des Gehirns, um den kontralateralen Antennenlappen zu erreichen. Anschließend dringen ORN-Axone sowohl in ipsi- als auch in kontralaterale Antennenlappen ein und bilden Synapsen mit Dendriten ihrer Partner-PNs in spezifischen Glomeruli. Dieses grobe Modell für die olfaktorische Schaltungsmontage wurde auf der Grundlage der Charakterisierung fester Proben aus Zwischenzeitpunkten während der Entwicklung vorgeschlagen. Die schlechte zeitliche Auflösung und die Unfähigkeit, den gleichen neuronalen Prozessen während der gesamten Entwicklung aus festem Gewebe zu folgen, schränken das mechanistische Verständnis des Schaltkreismontageprozesses ein.
Es ist technisch schwierig, ORN- und PN-Prozesse in vivo live abzubilden, da der Verdrahtungsprozess in der ersten Hälfte des Puppenstadiums stattfindet, wenn der Antennenlappen von einem undurchsichtigen Fettkörper im Puppengehäuse umgeben ist. Es ist daher unmöglich, den sich entwickelnden olfaktorischen Kreislauf direkt von intakten Puppen abzubilden. Ex-vivo kultiviertes seziertes Gewebe kann die Opazität des Gewebes umgehen und wurde erfolgreich zur Untersuchung der neuronalen Entwicklungeingesetzt 4,5,6. Die Herausforderung bei der Verwendung einer ähnlichen Ex-vivo-Explantationskulturstrategie zur Untersuchung der neuronalen Verdrahtung im Puppengehirn besteht darin, ob sie das genaue Neuronen-Targeting in einem Kulturzustand rekapituliert. Basierend auf einer zuvor berichteten Ex-vivo-Kulturbedingung für den Fliegenaugehirn-Komplex7 wurde kürzlich ein Explantat entwickelt, das das gesamte Puppengehirn, die Antennen und die verbindenden Antennennerven intakt enthält, das eine präzise Ausrichtung des olfaktorischen Schaltkreises beibehält und einer Zwei-Photonen-Mikroskopie-basierten Live-Bildgebung für bis zu 24 h mit einer Frequenz von jeweils 20 minunterzogen werden kann 8 . Hier wird ein detailliertes Protokoll der Explantierkultur und Bildgebung beschrieben. Das Explant-System bietet eine leistungsstarke Methode, um den Aufbau des olfaktorischen Schaltkreises und möglicherweise anderer Schaltkreise im zentralen Gehirn zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>20-Hydroxyecdyson</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Chamäleon Ti:Saphir Laser</td><td>Coherent</td><td>Coherent MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Humaninsulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Bildgebungssoftware</td><td>Prairie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoffflasche</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikonelastomer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Mikroskopie</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wassertauchobjektiv (20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

ein explantationssystem für zeitraffer-bildgebungsstudien der olfaktorischen schaltkreismontage bei drosophila

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~ Neuronen sind präzise miteinander verbunden, um Schaltkreise zu bilden, die für die ordnungsgemäße Funktion des Gehirns unerlässlich sind. Das Drosophila-Geruchssystem bietet ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess zu untersuchen, da 50 Arten von olfaktorischen Rezeptorneuronen (ORNs) aus den Antennen und Oberkieferpalpen ihre Axone auf 50 identifizierbare Glomeruli im Antennenlappen projizieren und synaptische Verbindungen mit Dendriten aus 50 Arten von Projektionsneuronen zweiter Ordnung (PNs) bilden. Frühere Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die Identifizierung wichtiger Moleküle, die das präzise Targeting im Riechkreislauf mit festem Gewebe regulieren. Hier wird ein Antennen-Hirn-Explantationssystem beschrieben, das wichtige Entwicklungsmeilensteine der olfaktorischen Schaltkreismontage in Kultur rekapituliert. Durch das Sezieren der äußeren Kutikula und die Reinigung undurchsichtiger Fettkörper, die das sich entwickelnde Puppengehirn bedecken, können mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder einzelner Neuronen aus lebenden Gehirnen gesammelt werden. Dies ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung einzelner ORN-Axon-Targeting aus lebendem Gewebe. Dieser Ansatz wird dazu beitragen, wichtige zellbiologische Kontexte und Funktionen zuvor identifizierter wichtiger Gene aufzudecken und Mechanismen zu identifizieren, die dem dynamischen Prozess der Schaltungsmontage zugrunde liegen.

ORN-Axone kommen zwischen 18 h und 36 h APF am Antennenlappen an. Sie navigieren dann durch den Antennenlappen, überqueren die Mittellinie und innervieren die Glomeruli. Video 1 ist ein repräsentatives Video , das den gesamten Prozess für mehrere einzeln identifizierbare Axone zeigt, aufgenommen mit einer Frequenz von 20 Minuten für 24 Stunden. Vor der Registrierung mit TurboReg zeigen die Axone eine gewisse seitliche Drift, wenn sich das Gehirn entwickelt (erste Hälfte des Videos). Nach der Registrierun...

Dieses Protokoll beschreibt das Dissektionsverfahren, den Kulturzustand und die Live-Bildgebung eines Antennen-Hirn-Explantationssystems zur Untersuchung der olfaktorischen Schaltkreisanordnung.

Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

Dieses Protokoll präsentiert eine Methode zum Live-Bild, Fliegen olfaktorische Schaltkreis-Montage auf Einzelaxon-Ebene von einem sich entwickelnden Gehirn. Dissektion Um das Gewebe zu reinigen, das das sich entwickelnde Gehirn bedeckt, können wir qualitativ hochwertige Bilder aus dem inneren Gehirn sammeln. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die zellbiologischen Grundlagen der Schaltkreisentwicklung.Es kann leicht modifiziert werden, um auch die Entwicklung anderer Schaltungen zu untersuchen. Es dauert einige Zeit, bis eine Person eine stabile Handkontrolle in der Mikrodissektion durchführt. Mehr Übung wird hilfreich sein.Bereiten Sie zunächst die Kulturschale für die Mobilisierung des Explants während der Zeitrafferbildgebung vor, indem Sie 0,5 Zentimeter dicke Sylgard auf die Unterseite einer Petrischale legen und sie 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten lassen. Um Mikrostifte für die Immobilisierung des Explants auf dieser Platte mit einer Pinzette vorzubereiten, kleben Sie mehrere Mikrostifte auf ein Band, wobei die scharfen Enden auf einer Seite ausgerichtet sind, und schneiden Sie zwei Millimeter scharfe Enden mit einer Schere. Setzen Sie dann mit der Pinzette die geschnittenen Mikrostifte in die Sylgard-Schicht einer vorgefertigten Sylgard-Platte ein.Sammeln Sie mit einem Pinsel weiße Puppen, die innerhalb einer Stunde Puparium bilden, und übertragen Sie sie in ein neues Fläschchen. Inkubieren Sie die Puppen im Wasserbad, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist, für 40 Minuten, um spärliche ORN-Klone aus zufälligen Typen zu induzieren. Nach einem Hitzeschock die Durchstechflasche 30 Stunden lang auf 25 Grad Celsius stellen, wodurch die Puppen 30 Stunden nach der Pupariumbildung gealtert sind.Dann bereiten Sie das Kulturmedium für Explantation wie im Textmanuskript beschrieben vor und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Am Tag der Bildgebung fügen Sie fötales Rinderserum, Humaninsulinbrüllösung und 20 Hydroxyecdyson-Stammlösung, die in Ethanol gelöst wird, zu einer 50-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, die 45 Milliliter Drosophila-Medium von Schneider enthält. Gut mischen und 15 Milliliter des vollen Mediums in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr überführen und den Rest des vollen Mediums eine Woche lang bei vier Grad Celsius lagern.Decken Sie dann die Röhrenöffnung mit Vollmedium mit Paraffinfilm ab und versorgen Sie das Medium mit Sauerstoff, indem Sie Sauerstoffblasen unter der flüssigen Oberfläche durch eine sterile Fünf-Milliliter-Pipettenspitze mit einer Blase pro Sekunde für 20 bis 30 Minuten pumpen. Als nächstes sterilisieren Sie die Oberfläche der Dissektionsbohrung und die zuvor vorbereitete Sylgard-Platte mit 70% Ethanol und lassen Sie sie vor Gebrauch trocknen. Verwenden Sie einen Pinsel, um 30 Stunden APF-Puppe auf ein Seidenpapier zu übertragen, um die äußere Oberfläche der Puppe für fünf Minuten zu trocknen.Nachdem Sie doppelseitiges Klebeband auf einen Glasobjektträger aufgetragen haben, befestigen Sie die getrocknete Puppe vorsichtig an der klebrigen Oberfläche des Bandes, wobei die Rückenseite nach oben zeigt. Drücken Sie die Puppe vorsichtig mit einer Bürste, um die Bauchseite richtig am Klebeband zu befestigen, ohne die Puppe zu beschädigen. Führen Sie eine scharfe Spitze der Pinzette zwischen der braunen Puppenkoffer und der Puppe von der seitlichen Seite ein und brechen Sie die braune Puppenkoffer vorsichtig durch eine Linie zum hinteren Ende der Puppe.Sobald die braune Puppenkoffer geöffnet ist, halten Sie die Puppe vorsichtig mit der Pinzette fest und geben Sie sie in den Sezierbrunnen, der einen Milliliter sauerstoffreiches Vollmedium enthält. Tauchen Sie die Puppe in das Medium, um sie auf den Boden des Brunnens zu senken. Um das Antennengehirn aus der Puppe zu sezieren, halten Sie die Puppe vorsichtig mit einer Pinzette mit einer Hand und mit einer Mikroschere, erzeugen Sie ein kleines Loch von der hinteren Seite der Puppe, das hohen Druck in der Puppe freisetzt.Ausgehend vom Loch schneiden Sie durch die ventrale Mittellinie bis zum Hals, schneiden Sie dann durch den Umfang des Halses, um den Kopf vom Körper der Puppe zu lösen und den Körper in einen anderen Brunnen zu legen. Als nächstes schneiden Sie die transparente Kutikula ab, die die dorsale Seite des Gehirns bedeckt, um den Fettkörper auf dem Gehirn freizulegen, um sicherzustellen, dass die Kutikula, an der die Netzhaut und die Antenne befestigt sind, erhalten bleiben, und schneiden Sie in ähnlicher Weise die Kutikula von der ventralen Seite des Gehirns ab. Pipettieren Sie das Medium in Richtung der offenen Regionen auf der dorsalen und ventralen Seite des Kopfes mit einer P10-Pipette, um den Fettkörper, der das Gehirn und die Antenne bedeckt, sanft auszuwaschen.Um die Interaktion von bilateralen ORN-Axonen oder ORN-Axonen mit PN-Dendriten-Targeting zu untersuchen, trennen Sie den Antennennerv während des Stadiums, indem Sie die Klingen der Mikroschere vorsichtig zwischen der Kutikula und dem Gehirn platzieren und den interessierten Antennennerv durchtrennen. Um das sezierte Explantat auf die Sylgard-Platte zu übertragen, legen Sie etwa 200 Mikroliter Tröpfchen des oxygenierten Vollmediums auf die Sylgard-Oberfläche. Pipette den Fettkörper, der aus dem sezierten Stamm stammt, mehrmals durch eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze zur Beschichtung der inneren Oberfläche, um zu verhindern, dass die Explantate während des Transfers von der Dissektionsmulde auf den mittleren Tröpfchen auf der Sylgard-Platte an der Pipettenspitze haften.Verwenden Sie die Pinzette, um das Explantat auf der Sylgard-Schicht in den beiden optischen Lappen zu befestigen, positionieren Sie dann vorsichtig die Sylgard-Platte auf der Bildgebungsstation, immobilisieren Sie die Platte mit Bändern und fügen Sie der Sylgard-Platte langsam 10 Milliliter des sauerstoffhaltigen Vollmediums mit einer P1000-Pipette hinzu. Die ORN-Axone kommen zwischen 18 Stunden und 36 Stunden APF am Antennenlappen an und navigieren dann durch den Antennenlappen, überqueren die Mittellinie und erneuern die Glomeruli. Vor der Registrierung zeigten die Axone eine gewisse seitliche Drift, als sich das Gehirn entwickelte, und nach der Registrierung wurde die Drift korrigiert.Die glomerulären Identitäten der extrahierten ORN-Axone wurden durch Immunfärbung eines Neuropil-Markers und Cadherins aufgedeckt. Durch den Vergleich mit der internen Lappenkarte konnte die Identität jedes Glomerulus bestimmt werden. Während der Ex-vivo-Kultur verursacht das Bakterienwachstum in der Regel eine ausgeruhte Entwicklung des Riechkreises.Daher ist es wichtig, die Kulturschale und die Stifte vor der Bildgebung gründlich zu sterilisieren und den Bildgebungsraum sauber und isoliert zu halten. Um eine höhere räumliche zeitliche Auflösung zu erreichen, kann dieses Explantationssystem mit einem fortschrittlicheren Mikroskop, dem Gitterlichtmikroskop der adaptiven Optik, abgebildet werden. Obwohl hier exemplarisch eine Fabrikschaltungsentwicklung gezeigt wurde, kann dieses System potentiell auf Studien anderer Schaltkreise und Entwicklungsprozesse im sich entwickelnden Zentralgehirn ausgeweitet werden.

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Research

Forschung

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Ein Explantationssystem für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der olfaktorischen Schaltkreismontage bei Drosophila

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