Name: Tiefe vaskuläre Bildgebung im Auge mit flussverstärktem Ultraschall (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die flussverstärkte Ultraschallbildgebung zur nicht-invasiven 3D-Darstellung der Augengefäße bei Wirbeltieren mit kernhaltigen Erythrozyten. Diese Methode ermöglicht tiefere Einblicke in die Evolution des Auges.

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Diese Arbeit wurde von der Carlsberg Foundation finanziert (CF17-0778; CF18-0658), die Lundbeck-Stiftung (R324-2019-1470; R346-2020-1210), die Velux-Stiftungen (00022458), die A.P. Møller-Stiftung zur Förderung der medizinischen Wissenschaft, das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung (Nr. 754513) und die Forschungsstiftung der Universität Aarhus.

Das folgende Protokoll wurde mit Genehmigung der dänischen Aufsichtsbehörde für Tierversuche innerhalb des dänischen Ministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei, der dänischen Veterinär- und Lebensmittelbehörde durchgeführt (Genehmigungsnummer 2016-15-0201-00835).
1. Anästhesie- und Ultraschallmedium
<ol><li>Betäuben Sie das Forschungstier. HINWEIS: Art und Dosis der geeigneten Anästhesie sind stark artabhängig. Im Allgemeinen sind immersionsbasierte Anästhetika wie MS-222 (Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonsäure), Benzocain (Ethyl-4-aminobenzoat) und Propofol (2,6-Diisopropylphenol) bei Fischen und Amphibien nützlich, die das Anästhetikum leicht über Kiemen oder Haut aufnehmen (z. B. 0,05 mg). L-1 Benzocain in Regenbogenforellen). Eine Reihe von gelösten Verbindungen, die intravenös, intramuskulär, intraperitoneal verabreicht werden können, ist für Amnioten verfügbar, ebenso wie Anästhetika auf Gasbasis. Alfaxalon, das intramuskulär verabreicht wird, ist bei Reptilien nützlich (z. B. 30 mg·kg-1 bei Eidechsen), und Isofluran, das als Gas verabreicht wird, ist bei Vögeln nützlich (z. B. 2% in Luft für Tauben). Einen vollständigen Überblick über die verfügbaren Anästhetika in allen Arten finden Sie in der veröffentlichten Literatur30,31,32.</li>
	<li>Testen Sie Reflexe im Tier, um ein optimales Anästhesieniveau zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass das Tier während des Eingriffs völlig bewegungslos ist, da das strömungsverstärkte Ultraschallverfahren empfindlich auf Bewegungsgeräusche reagiert.<ol>
<li>Eine zu tiefe Anästhesie kann die Blutflussmuster verändern, also führen Sie eine Dosistitration in der Startphase eines Experiments durch.</li>
		<li>Erhöhen Sie die Anästhesiedosis in Schritten und beobachten Sie den Blutfluss im Auge, unterstützt durch Ultraschall im einfachen Helligkeitsmodus (B-Modus). HINWEIS: Ein optimales Maß an Anästhesie wird erreicht, wenn das Tier bewegungslos ist (außer Atmung) mit sichtbarem okulärem Blutfluss.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Art / Dosis des Anästhetikums für Atembewegungen nicht zulässig ist, stellen Sie eine ausreichende Belüftung des Tieres sicher, z. B. mit einer Luftpumpe, um das Wasser für aquatische Arten mit Sauerstoff zu versorgen, oder einem Beatmungsgerät für luftatmende Arten.</li>
	<li>Positionieren Sie das Tier in einer Haltung, die einen direkten Zugang von oben zum Auge ermöglicht. HINWEIS: Je nach Art kann sich dies entweder in Rückenlage oder seitlich befinden. Es kann sinnvoll sein, eine einfache Haltevorrichtung mit einem kleinen Stück nicht reaktivem Metall (z. B. Edelstahl) und losen Gummibändern zu konstruieren (siehe Abbildung 1).</li>
	<li>Legen Sie ein geeignetes Ultraschallmedium auf das Auge des Tieres. Wenn geschuppte Augenlider (ultraschallundurchlässig) das Auge bedecken, dann verdrängen Sie diese vorsichtig mit einem Wattestäbchen. HINWEIS: Für aquatische Arten ist das beste Ultraschallmedium sauberes Tankwasser, in dem das Tier normalerweise lebt. Bei terrestrischen Spezies sorgt eine großzügige Menge an Ultraschallgel für freie Bewegungen und Bildgebung des Ultraschallwandlers (d.h. der linearen Array-Sonde) über die gesamte Oberfläche des Auges. Tierarztsalbe auf dem kontralateralen Auge ist für terrestrische Arten erforderlich.</li>
</ol>2. 2D- und 3D-Bilderfassung von Augenultraschall
<ol><li>Positionieren Sie den Ultraschallwandler medial zum Auge entweder in einer dorsalen/ventralen oder rostralen/kaudalen Ausrichtung, abhängig von der gewünschten Bildausrichtung.</li>
	<li>Stellen Sie im B-Modus mit maximaler Schärfentiefe den medialen und tiefsten Teil des Auges ab und stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind. HINWEIS: Bei einigen Arten nimmt die kristalline Linse einen vergleichsweise großen Anteil des Glaskörpers ein, der den Ultraschall absorbieren kann, insbesondere bei höheren Frequenzen.</li>
	<li>Übersetzen Sie den Wandler langsam auf jede Seite, während Sie die Echtzeitbilder inspizieren. Stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind. Wenn nicht, wechseln Sie zu einem Wandler mit einer niedrigeren Frequenz und größerer Schärfentiefe. HINWEIS: Die folgenden Mittenfrequenzen ermöglichen die folgende maximale Schärfentiefe: 21 MHz: 3 cm, 40 MHz: 1,5 cm, 50 MHz: 1 cm (siehe Tabelle 1). Diese maximalen Tiefenschärfewerte können jedoch deutlich niedriger sein, wenn das Auge verkalkte oder andere ultraschallundurchlässige Strukturen enthält.</li>
	<li>Passen Sie die Bildtiefe, den Tiefenversatz (Abstand vom oberen Bildrand zur interessierenden Struktur), die Bildbreite sowie die Anzahl und Position der Fokuszonen an, um den gewünschten Interessenbereich in allen drei Raumdimensionen abzudecken (z. B. 1 cm Bildtiefe, 2 mm Tiefenversatz, 1 cm Bildbreite, eine Fokuszone). HINWEIS: Obwohl die spezifische Benennung von Tasten, die diese Parameter anpassen, zwischen Ultraschallsystemen variieren kann, verfügen die meisten Systeme über Tasten mit logischen Namen für diese Anpassungen. Diese Bildparametereinstellungen wirken sich in der Regel auf den Bereich möglicher zeitlicher Auflösungen der Ultraschallerfassung aus.</li>
	<li>Stellen Sie die Bildrate im Bereich von 50-120 Bildern·s-1 ein. HINWEIS: Die zeitliche Auflösung (d.h. das Zeitintervall zwischen aufeinanderfolgenden B-Scans) muss ausreichend sein, um eine große Pixelintensitätsvariabilität in abgebildeten Blutgefäßen anzuzeigen, d.h. die zeitliche Auflösung darf nicht zu hoch sein. Auf der anderen Seite, um eine vollständige 3D-Aufnahme des Auges in einer angemessenen Zeit abzuschließen, kann die zeitliche Auflösung nicht zu niedrig sein. Eine zeitliche Auflösung von 50-120 Bildern·s-1 ist in der Regel für das strömungsverstärkte Verfahren bei den meisten Arten ausreichend. Bei einigen Ultraschallsystemen kann diese gewünschte zeitliche Auflösung durch Umschalten zwischen den Modi "allgemeine Bildgebung" (hohe räumliche/niedrige zeitliche Auflösung) und "Kardiologie" (niedrige räumliche/hohe zeitliche Auflösung) erreicht werden.</li>
	<li>Passen Sie die 2D-Verstärkung auf einen Pegel (~ 5 dB) an, so dass anatomische Strukturen in der B-Mode-Erfassung gerade erst sichtbar sind, um das Signal-Rausch-Verhältnis in der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu erhöhen.</li>
	<li>Um ein 2D-Flow-verbessertes Bild an einer einzelnen Slice-Position zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler in diese Position und fahren Sie mit Schritt 3.1 fort.</li>
	<li>Um eine 3D-Aufnahme einer ganzen Region von Interesse, z. B. der Netzhaut, zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler auf ein Extrem der interessierenden Region.<ol>
<li>Um die genaue Position des äußersten Endes der interessierenden Region zu bestimmen, erhöhen Sie die 2D-Verstärkung kurz.</li>
		<li>Nachdem die korrekte Platzierung des Wandlers abgeschlossen ist, verringern Sie die 2D-Verstärkung vor der Aufnahme, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis bei der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassen Sie für jeden Schritt (Slice) in der 3D-Aufnahme ≥100 Frames (optimal ≥1000 Frames).</li>
	<li>Übersetzen Sie den Wandler mit einem Mikromanipulator oder einem eingebauten Wandlermotor über den gesamten Interessenbereich in Schritten von z. B. 25 μm oder 50 μm (denken Sie daran, die Schrittgröße zu beachten) und wiederholen Sie die Erfassung von ≥100 Bildern für jeden Schritt.</li>
	<li>Euthanasie das Forschungstier gemäß den Tierpflegerichtlinien der Einrichtung.</li>
</ol>3. Flussverstärkte Bildrekonstruktion
<ol><li>Exportieren Sie die Aufnahmen in das DICOM-Dateiformat (Digital Imaging and Communications in Medicine) (Little-Endian).</li>
	<li>Um ein einzelnes flussverstärktes Bild basierend auf einer Cine-Aufnahme mit ≥100 Bildern (T) zu erzeugen, berechnen Sie die Standardabweichung auf Pixelebene (STD(x,y)) mit der folgenden Formel: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62986/62986eq01.jpg"> Dabei ist It(x,y) die Intensität des Pixels an der (x,y) Pixelkoordinate zum Zeitpunkt t, und Īt(x,y) ist der arithmetische Mittelwert von I im Zeitverlauf.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.2 für jedes Segment in der 3D-Aufnahme.</li>
	<li>Um die STD-Berechnung und Bildrekonstruktion für mehrere Slices in einer 3D-Aufnahme zu automatisieren, führen Sie diesen Vorgang im Batch-Modus durch, z. B. mit ImageJ und dem ergänzenden Makroskript (Supplementary File 1).</li>
	<li>Kombinieren Sie alle rekonstruierten Slices in einem Image-Stack (Befehl "Images to Stack" in ImageJ).</li>
	<li>Geben Sie die Segmentdicke anhand der während der Aufnahme verwendeten Schrittgröße an (Befehl Eigenschaften in ImageJ).</li>
	<li>Speichern Sie den Bildstapel als 3D-TIF-Datei. HINWEIS: Flussgewichtete dreidimensionale Aufzeichnungen von Augenblutgefäßen können anschließend verwendet werden, um Volumen-Renderings zu erstellen und digitale und physikalische anatomische Modelle von Gefäßstrukturen des Auges zu erstellen. Diese Bildverarbeitungsoptionen liegen außerhalb des Anwendungsbereichs dieses Protokolls. Weitere Informationen finden Sie in den zuvor veröffentlichten Artikeln33,34,35.</li>
</ol>

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<li>Damsgaard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+evolution+of+oxygen+secreting+mechanism+in+the+fisheye%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology and evolution of oxygen secreting mechanism in the fisheye.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 252, 110840(2021).</li>
<li>Damsgaard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+acidification+mechanism+for+greatly+enhanced+oxygen+supply+to+the+fish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A novel acidification mechanism for greatly enhanced oxygen supply to the fish retina.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Haedrich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+II.+Distribution+and+relation+to+the+pseudobranch+and+to+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. II. Distribution and relation to the pseudobranch and to the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 137-156 (1974).</li>
<li>Wittenberg, J. B., Wittenberg, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+rete+mirabile+of+the+fish+eye.+I.+Oxygen+secretion+and+structure%3A+comparison+with+the+swimbladder+rete+mirabile%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The choroid rete mirabile of the fish eye. I. Oxygen secretion and structure: comparison with the swimbladder rete mirabile.</a> Biological Bulletin. 146 (1), 116-136 (1974).</li>
<li>Berenbrink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+reconstructions+of+evolving+physiological+complexity%3A+O2+secretion+in+the+eye+and+swimbladder+of+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Historical reconstructions of evolving physiological complexity: O2 secretion in the eye and swimbladder of fishes.</a> Journal of Experimental Biology. 210, Pt 9 1641-1652 (2007).</li>
<li>Berenbrink, M., Koldkjaer, P., Kepp, O., Cossins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+oxygen+secretion+in+fishes+and+the+emergence+of+a+complex+physiological+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of oxygen secretion in fishes and the emergence of a complex physiological system.</a> Science. 307 (5716), 1752-1757 (2005).</li>
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<li>Mueller, R. L., Ryan Gregory, T., Gregory, S. M., Hsieh, A., Boore, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+size%2C+cell+size%2C+and+the+evolution+of+enucleated+erythrocytes+in+attenuate+salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology%22%5BJournal%5D)">Genome size, cell size, and the evolution of enucleated erythrocytes in attenuate salamanders.</a> Zoology. 111 (3), 218-230 (2008).</li>
<li>Greis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+microvascular+blood+flow+by+contrast-enhanced+ultrasound+%28CEUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of microvascular blood flow by contrast-enhanced ultrasound (CEUS).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 49, 137-149 (2011).</li>
<li>Urs, R., Ketterling, J. A., Tezel, G., Silverman, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhanced+plane-wave+ultrasound+imaging+of+the+rat+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhanced plane-wave ultrasound imaging of the rat eye.</a> Experimental Eye Research. 193, 107986(2020).</li>
<li>Walls, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+GL+%22The+vertebrate+eye+and+its+adaptive+radiation%22">The vertebrate eye and its adaptive radiation</a>. , Cranbrook Institute of Science. Michigan. (1942).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine abschließenden Interessen bestehen.

Die vaskuläre Bildgebung mit strömungsverstärktem Ultraschall bietet eine neue Methode für die nicht-invasive Bildgebung des Gefäßsystems des Auges, die mehrere Vorteile gegenüber derzeitigen Techniken bietet, aber ihre intrinsischen Grenzen hat. Der Hauptvorteil von strömungsverstärktem Ultraschall ist die Fähigkeit, Augenangiographien mit einer Schärfentiefe zu erzeugen, die das retinale Pigmentepithel übersteigt, was die Schärfentiefe in optischen Techniken einschränkt. In der Ultraschallbildgebung werden die räumlich...

Der hohe Stoffwechsel auf der Netzhaut von Wirbeltieren erlegt einen intrinsischen Kompromiss zwischen zwei gegensätzlichen Bedürfnissen dar; hohe Blutflussraten und ein Lichtweg ohne Blutgefäße. Um Sehstörungen bei der Durchblutung roter Blutkörperchen zu vermeiden, erhält die Netzhaut aller Wirbeltiere Sauerstoff und Nährstoffe über eine Kapillarschicht hinter den Photorezeptoren, die Choriocapillaris1,2,3. Diese einzige Quelle von Nährstoffen und Sauerstoff erlegt jedoch eine Diffusionsbegrenzung der Dicke der Netzhaut vor4,5, so dass viele visuell aktive Spezies eine Vielzahl von ausgeklügelten Gefäßnetzwerken besitzen, um dieses metabolisch aktive Organ zusätzlich mit Blut zu versorgen6. Zu diesen Gefäßbetten gehören Blutgefäße, die die inneren Netzhautschichten bei Säugetieren und einigen Fischen durchbluten4,7,8,9,10, Blutgefäße auf der inneren (lichtzugewandten) Seite der Netzhaut, die bei vielen Fischen, Reptilien und Vögeln zu finden sind4,11,12,13 und gegenstromförmige Gefäßanordnungen der Fischaderhaut, der Aderhautrete Mirable, das die Erzeugung von Super-Luftsauerstoff-Partialdrücken ermöglicht14,15,16,17,18,19,20. Obwohl diese zusätzlichen nicht-choroidalen Pfade für die retinale Nährstoffversorgung eine wesentliche Rolle bei der Deckung der metabolischen Anforderungen des überlegenen Sehens spielen4, ist die dreidimensionale Anatomie dieser Gefäßstrukturen kaum verstanden, was unser Verständnis der morphologischen Entwicklung des Wirbeltierauges einschränkt.
Traditionell wurde die retinale Blutversorgung mit optischen Techniken wie der Fundus-Ophthalmoskopie untersucht. Diese Kategorie von Techniken liefert zerstörungsfreie Hochdurchsatzinformationen über die nicht-choroidale Blutgefäßanatomie in hoher Auflösung21 und wird daher leicht in der klinischen Diagnose von Anomalien in der Netzhautgefäßstruktur verwendet22. Das retinale Pigmentepithel absorbiert jedoch das durchgelassene Licht und begrenzt die Sichttiefe bei diesen optischen Techniken, wodurch die Informationen über die Struktur und Funktion der Aderhaut ohne den Einsatz von Kontrastmitteln reduziert werden21. Ähnliche Tiefenbeschränkungen treten bei der optischen Kohärenztomographie (OCT) auf. Diese Technik kann hochauflösende Fundusangiographien unter Verwendung von Lichtwellen auf Kosten der Tiefenpenetration erzeugen23, während die erweiterte Tiefenbildgebung OCT die Aderhaut auf Kosten der retinalen Bildgebungsqualität visualisieren kann24. Die Magnetresonanztomographie überwindet die optischen Einschränkungen von Ophthalmoskopie und OCT und kann Gefäßschichten in der Netzhaut abbilden, wenn auch mit niedriger Auflösung25. Histologie und Mikrocomputertomographie (μCT) halten die hohe Auflösung der optischen Techniken aufrecht und liefern Informationen über die Ganzaugen-Gefäßmorphologie4, aber beide Techniken erfordern eine Augenprobenahme und sind daher in der Klinik oder bei seltenen oder gefährdeten Arten nicht möglich. Um einige der Einschränkungen dieser etablierten retinalen Bildgebungsverfahren zu überwinden, präsentiert die Studie hier ein Ultraschallprotokoll an anästhesierten Tieren, bei dem die Blutbewegung in silico auf einer Reihe von zweidimensionalen Ultraschalluntersuchungen mit gleichem Abstand abgebildet wird, die ein ganzes Auge überspannen, indem eine vergleichbare Technik angewendet wird, wie zuvor für embryonale und kardiovaskuläre Bildgebung beschrieben26,27, 28 und in der Angiographie des OKT29. Dieser Ansatz ermöglicht die Generierung nicht-invasiver dreidimensionaler Tiefen-Augenangiographien ohne Verwendung eines Kontrastmittels und eröffnet neue Wege zur Kartierung der Blutflussverteilung innerhalb des Auges über Spezies hinweg.

<table><tbody><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Benzocain</td><td>Sigma</td><td>E-1501</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>B Braun</td><td> 12260470_0320</td><td></td></tr><tr><td>Alfaxalon</td><td>Jurox</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Zoetis</td><td>50019100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr></tbody></table>

tiefe vaskuläre bildgebung im auge mit flussverstärktem ultraschall

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Die Netzhaut im Auge ist eines der energieintensivsten Gewebe im Körper und benötigt daher eine hohe Sauerstoffzufuhr aus einer reichhaltigen Blutversorgung. Die Kapillarlamina der Aderhaut kleidet die äußere Oberfläche der Netzhaut aus und ist die dominierende Sauerstoffquelle in den meisten Netzhaut von Wirbeltieren. Dieses Gefäßbett ist jedoch aufgrund seiner Position hinter der stark lichtabsorbierenden Netzhaut mit traditionellen optischen Techniken schwierig abzubilden. Hier beschreiben wir eine Hochfrequenz-Ultraschalltechnik mit anschließender Strömungsverstärkung, um tiefe Gefäßbetten (0,5-3 cm) des Auges mit einer hohen raumzeitlichen Auflösung abzubilden. Diese nicht-invasive Methode funktioniert gut bei Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen (nicht-säugetierische und fötale Tiermodelle). Es ermöglicht die Erstellung nicht-invasiver dreidimensionaler Angiographien ohne den Einsatz von Kontrastmitteln und ist unabhängig von Blutflusswinkeln mit einer höheren Empfindlichkeit als Doppler-basierte Ultraschall-Bildgebungsverfahren.

Die strömungsverstärkte Ultraschalltechnik zur Abbildung von Gefäßbetten des Auges kann bei einer Reihe von Arten angewendet werden und wird derzeit bei 46 verschiedenen Wirbeltierarten angewendet (Abbildung 1, Tabelle 1). Das Vorhandensein von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei nicht-erwachsenen Säugetierwirbeltieren bietet einen positiven Kontrast des fließenden Blutes im Vergleich zu statischem Gewebe in Kinoaufzeichnungen (Supplementary File 2). Bei e...

Wir stellen eine nicht-invasive Ultraschalltechnik vor, um dreidimensionale Angiographien im Auge ohne den Einsatz von Kontrastmitteln zu erzeugen.

Tiefe vaskuläre Bildgebung im Auge mit flussverstärktem Ultraschall

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Die Flow-Enhanced Ultrasound-Technik ermöglicht es uns, das Gefäßsystem des Auges in drei Dimensionen abzubilden, ohne den Einsatz von Kontrastmitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Stabilität, um das Vester hinter der pigmentierten Netzhaut abzubilden, was bei mehreren optischen Bildgebungstechniken eine Herausforderung darstellt. Wir demonstrieren diese Technik bei Goldfischen, aber sie kann auf alle Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen angewendet werden, so dass die Forscher einen Einblick in die funktionelle Evolution der Augen gewinnen können.Diese Technik kann von Forschern mit einer Grundausbildung in Ultraschallbildgebung und Tierhandhabung angewendet werden. Nachdem Sie ein optimales Anästhesieniveau bestätigt haben, positionieren Sie das Tier in einer Haltung, die einen direkten Zugang von oben zum Auge ermöglicht. Legen Sie ein geeignetes Ultraschallmedium auf das Auge des Tieres.Wenn geschuppte Augenlider das Auge bedecken, verschieben Sie diese vorsichtig mit einem Wattestäbchen. Bei Wassertieren eignet sich Wasser gut als Ultraschallmedium, Als nächstes positionieren Sie den Ultraschallwandler, medial für das Auge, entweder in einer dorsalen ventralen oder rostralen kaudalen Ausrichtung, abhängig von der gewünschten Bildausrichtung. Im B-Modus mit maximaler Schärfentiefe können Sie den medialen und tiefsten Teil des Auges abbilden, um sicherzustellen, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind.Übersetzen Sie den Wandler langsam auf jede Seite, während Sie die Echtzeitbilder inspizieren. Stellen Sie sicher, dass alle interessanten Strukturen im Bildfeld sichtbar sind. Wenn nicht, wechseln Sie zu einem Wandler mit einer niedrigeren Frequenz und einer größeren Schärfentiefe.Passen Sie die Bildtiefe, den Tiefenversatz, die Bildbreite und die Anzahl der Positionen der Fokuszonen an, um den gewünschten Interessenbereich in allen drei Raumdimensionen abzudecken. Stellen Sie dann die Bildrate im Bereich von 50 bis 120 Bildern pro Sekunde ein. Als nächstes passen Sie die 2D-Verstärkung auf ein Niveau an, so dass die anatomischen Strukturen in der B-Mode-Aufnahme nur gerade noch sichtbar sind, um das Signal-Rausch-Verhältnis in der anschließenden strömungsverstärkten Rekonstruktion zu erhöhen.Um ein 2D-Flow-verstärktes Bild an einer einzelnen Slice-Position zu erfassen, übersetzen Sie den Wandler in diese Position und fahren Sie mit der flussverstärkten Bildrekonstruktion fort. Um eine 3D-Aufnahme einer ganzen Region von Interesse zu erhalten, übersetzen Sie den Wandler in ein Extrem der Region von Interesse. Um die genaue Position des extremen Endes zu bestimmen, erhöhen Sie die 2D-Verstärkung kurz.Nachdem der Wandler richtig platziert wurde, verringern Sie die 2D-Verstärkung vor der Aufnahme, um ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis bei der anschließenden flussverstärkten Rekonstruktion zu gewährleisten. Erfassen Sie für jeden Schritt oder jede Slice in der 3D-Aufnahme mehr als 100 Bilder. Übersetzen Sie dann mit einem Mikromanipulator oder einem eingebauten Wandlermotor den Wandler über die gesamte Region von Interesse, in Schritten von entweder 25 oder 50 Mikrometern, und wiederholen Sie die Erfassung von mehr als 100 Bildern für jeden Schritt.Für eine flussoptimierte Bildkonstruktion exportieren Sie die Aufnahmen in das DICOM-Dateiformat. Um ein einzelnes flussverbessertes Bild basierend auf einer Szenenaufnahme mit mehr als 100 Bildern zu erzeugen, berechnen Sie die Standardabweichung auf Pixelebene mit dieser Formel und wiederholen Sie die Berechnung für jedes Segment in der 3D-Aufnahme. Um die Standardabweichungsberechnung und den Bildrekonstruktionsprozess für mehrere Segmente in einer 3D-Aufzeichnung zu automatisieren, führen Sie diesen Vorgang im Batch-Modus mit ImageJ und dem Makroskript durch, das im Textmanuskript bereitgestellt wird.Kombinieren Sie alle rekonstruierten Bilder in einem Bildstapel mit dem Befehl "Zu stapelnde Bilder" in ImageJ. Geben Sie dann mit dem Befehl Eigenschaften die Segmentdicke aus der während der Aufnahme verwendeten Schrittgröße an und speichern Sie den Bildstapel als 3D-TIFF-Datei. Das Vorhandensein von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei nicht-erwachsenen Säugetierwirbeltieren bietet einen positiven Kontrast des fließenden Blutes im Vergleich zu statischem Gewebe in Szenenaufnahmen.Wenn man nun jedoch Bild für Bild analysiert, ist die klare Unterscheidung zwischen Blut und umgebendem Gewebe weniger offensichtlich. Dieses Verfahren zur Verbesserung des Blutflusses stellt im Wesentlichen eine Mehrzeitpunktaufnahme im 2D-Raum in einem einzigen Bild zusammen, wobei im inhärenten Signalwert die Fluktuation in Pixeln, die im fließenden Blut positioniert sind, eine höhere Standardabweichung als das umgebende statische Gewebe aufweist und einen positiven Kontrast erzeugt. Bei 3D-Aufnahmen können mehrere parallele Slices mit bekanntem Abstand zu 3D-Bilddaten kombiniert werden.Es kann für dreidimensionales Volumen-Rendering und anatomische Modellierung verwendet werden. Die Doppler-basierte Ultraschallbildgebung bietet auch die Möglichkeit, den Blutfluss spezifisch abzubilden, jedoch mit geringerer Empfindlichkeit als diese Methode. Dieses flussverstärkte Ultraschallverfahren ermöglicht die Bildgebung des Blutflusses bei einer Reihe von Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen.Tiefe Augengefäßbetten, wie die Aderhaut rete mirabile bei einigen Fischen, können abgebildet werden, wenn sie in der Art vorhanden sind. Die Methode ist durch das Fehlen von kernhaltigen roten Blutkörperchen bei Säugetieren begrenzt, bei denen das Flussverbesserungsverfahren einen gewissen Blutflusskontrast erzeugt, aber nicht so ausgeprägt ist wie bei Spezies mit kernhaltigen roten Blutkörperchen. Flow-verstärkter Ultraschall reagiert empfindlich auf Bewegungsgeräusche.Atembewegungen können zu Bildunschärfen und Artefakten wie der Verbesserung der Geweberänder führen. Prospektives oder retrospektives Gating kann verwendet werden, um Bewegungsgeräusche anzupassen. Sowohl für 2D- als auch für 3D-Aufnahmen ist es wichtig, Bewegungsartefakte zu begrenzen, die durch die Bewegung des Tieres verursacht werden, da eine unzureichende Anästhesie auf einem instabilen Wandler eingerichtet ist.Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für die nicht-invasive In-vivo-Untersuchung tiefer Gefäßnetzwerke im Auge der überwiegenden Mehrheit der Wirbeltiere, die kernhaltige Erythrozyten besitzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Insgesamt retinalen Blutflusses wird durch Doppler optische Kohärenztomographie und halbautomatische Grading-Software gemessen.

Doppler Optical Coherence Tomography der retinalen Zirkulation

In diesem Beitrag stellen wir eine Methode, um Tumormikrogefäßen in vivo Analyse mit dynamischen Kontrastmittel-Fluoreszenz-Videomikroskopie. Zwei quantitative Parameter wurden erworben: funktionelle Kapillardichte was die Durchblutung des Tumors und Leckage Index spiegelt die Undichtigkeit der endothelialen Wand.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Intravitalmikroskopie kann bei Tieren verwendet werden, um retinale Gefäßdurchmesser, Blutbahngeschwindigkeiten und den gesamten retinalen Blutfluss sichtbar zu machen und zu messen.

Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

Die vorliegende Arbeit beschreibt ein neues Protokoll zur Durchführung von nicht-invasiver Hochfrequenz-Ultraschall- und photoakustischer Bildgebung am Rattengehirn, um tiefe subkortikale Regionen und ihre Gefäßmuster effizient zu visualisieren, indem Signale auf Schädelforamina gerichtet werden, die natürlicherweise auf tierischen Schädeln vorhanden sind.

Nicht-invasive Parenchymale, Gefäß- und Stoffwechselhochfrequenz-Ultraschall und Photoakustische Rat Deep Brain Imaging

Dieses Protokoll zeigt, wie ultraschnelle Ultraschall-Doppler-Bildgebung angewendet wird, um Blutflüsse zu quantifizieren. Nach einer 1 s langen Erfassung hat der Experimentator Zugriff auf einen Film des gesamten Sichtfeldes mit axialen Geschwindigkeitswerten für jedes Pixel pro ≈0,3 ms (abhängig von der Ultraschallzeit des Fluges).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen und technischen Verfahren, die eine Echtzeit-In-vivo-Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebung des Nagetiergehirns während fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen ermöglichen, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen.

Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

Der ultraschnelle Dopplerultraschall (UFUS) mit hoher räumlicher Auflösung (100 μm) und Sensitivität stellt eine geeignete nichtinvasive Bildgebungsmodalität dar, um einen umfassenden qualitativen Überblick über das Lebergefäßsystem zu erhalten. UFUS erleichtert auch quantitative Messungen des Mikrovaskulatursystems und zielt darauf ab, unser Verständnis der Mechanismen von Gefäßerkrankungen zu verbessern.

Bildgebung und Quantifizierung des hepatischen Gefäßsystems von Mäusen mittels ultraschnellem Doppler-Ultraschall

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Ultraschalllokalisationsmikroskopie (ULM), das eine räumliche Auflösung von 12,5 μm erreicht, um die Mikrovaskulatur des Gehirns bei Ratten abzubilden. Es ermöglicht eine detaillierte Visualisierung der Richtung und Geschwindigkeit des Blutflusses und bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die Weiterentwicklung von Studien zu zerebralen Durchblutungs- und Gefäßerkrankungen.

Zweidimensionale superauflösende Visualisierung der Mikrovaskulatur des Gehirns von Ratten mittels Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie

Die Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie (ULM) ist eine neu entwickelte Technik, die eine noch nie dagewesene Auflösung bei der Bildgebung der Mikrogefäße in vivo ermöglicht. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail, wie man mit Hilfe einer standardisierten funktionellen Ultraschall-Bildgebungsplattform, die für die präklinische Forschung entwickelt wurde, superaufgelöste Bilder der Mikrovaskulatur des Gehirns bei Nagetieren erhalten kann.

Ultraschall-Lokalisationsmikroskopie zur hochauflösenden Kartierung der Mikrogefäße des Nagetiergehirns

Für die Bewertung von neuen Stammzelltherapien ist es wichtig, nicht-invasiv Spur der injizierten Zellen in vivo. Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie humanen mesenchymalen und embryonalen Stammzellen mit Eisenoxid-Kontrastmittel in vivo für die nachfolgenden MR-Bildgebung in vivo-Label.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Erfahren Sie die flussverstärkte Ultraschallbildgebung zur nicht-invasiven 3D-Darstellung der Augengefäße bei Wirbeltieren mit kernhaltigen Erythrozyten. Diese Methode ermöglicht tiefere Einblicke in die Evolution des Auges.

Tiefe vaskuläre Bildgebung im Auge mit flussverstärktem Ultraschall

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