Name: Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Lernen Sie eine radiomarkierte Aminosäureaufnahme-Methode zur Bewertung des Nährstoffverbrauchs in primären Knochenzellen und isolierten Knochenschäften. Diese kostengünstige Technik ermöglicht schnelle und empfindliche quantifizierende Analysen.

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Das Karner-Labor wird durch R01-Zuschüsse des National Institute of Health (AR076325 und AR071967) an C.M.K.

Alle hier beschriebenen Mausverfahren wurden von den Animal Studies Committees am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt. Das Bestrahlungsprotokoll wurde vom Radiation Safety Advisory Committee am Southwestern Medical Center der University of Texas in Dallas genehmigt.
1. Aufnahme von Aminosäuren in Zellen (Protokoll I)
<ol><li>Platte 5 x 104 ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Plattenzellen aus α-MEM, die 10% FBS, 100 U/ml Penicillin und 0,1 μg/ml Streptomycin (Pen/Streptokokken) enthalten. Plate zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl pro Bedingung für die Normalisierungen in Schritt 1.12 zu quantifizieren. Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 °C mit 5%CO2 inkubieren.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellen für 2-3 Tage, bis sie konfluieren.</li>
	<li>Bereiten Sie am Tag des Experiments die folgenden Lösungen vor: 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 und Krebs Ringers HEPES (KRH) Puffer, pH 8,0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glucose). Auf 37 °C vorwärmen.</li>
	<li>Das Medium absaugen und die Zellen zweimal mit 1 ml 1x PBS, pH 7,4 waschen. HINWEIS: Dieses Protokoll eignet sich auch für sich schnell teilende nicht konfluente Zellen. In diesem Fall ist es wichtig, die Radioaktivität entweder auf absolute Zellzahl oder DNA-Gehalt zu normalisieren. Erwägen Sie außerdem, die Größe der Kulturplatte oder des Kulturkolbens zu erhöhen, um die Gesamtzahl der Zellen und die cpm-Werte zu erhöhen. Dies ist wichtig, um empirisch auf individueller Basis zu bestimmen.</li>
	<li>1x PBS absaugen und die Zellen einmal mit 1 mL KRH waschen.</li>
	<li>Stellen Sie 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedien her, indem Sie 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin-Brühe pro 1 ml KRH verdünnen. HINWEIS: Bevor Sie radioaktive Stoffe verwenden, wenden Sie sich bitte an das Amt für Strahlenschutz Ihrer Heimateinrichtung, um Genehmigungen zu erhalten. Alle Verfahren im Zusammenhang mit der Strahlung müssen hinter dem Plexiglasschirm durchgeführt werden.</li>
	<li>Zellen mit 0,5 mL KRH inkubieren, die 4 μCi/ml L-[3,4-3 H]-Glutamin-Arbeitsmedien enthalten, für 5 min.</li>
	<li>Sammeln Sie das radioaktive Medium und geben Sie es in den flüssigen Abfallbehälter. Waschen Sie die Zellen dreimal kurz mit eiskaltem KRH, um die Reaktion zu beenden. Sammeln und entsorgen Sie alle Waschungen im Behälter für radioaktive flüssige Abfälle.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml 1% SDS zu jeder Vertiefung hinzu und triturate 10x, um die Zellen zu lysieren und zu homogenisieren. Übertragen Sie die Zelllysate in 1,5 ml Röhrchen. Entsorgen Sie Zellkulturplatten, serologische Pipetten und Pipettenspitzen im Behälter für feste radioaktive Abfälle.</li>
	<li>Zentrifugieren bei >10.000 x g für 10 min. Die Überstände werden in Szintillationsfläschchen überführt, die 8 ml der Szintillationslösung enthalten. Mischen Sie, indem Sie die Szintillationsfläschchen kräftig schütteln. Entsorgen Sie Röhrchen und Pipettenspitzen in einem Behälter für feste radioaktive Abfälle.</li>
	<li>Lesen Sie Radioaktivität in Zählungen pro Minute (cpm) mit einem Szintillationszähler. Entsorgen Sie Szintillationsfläschchen in einem Abfallbehälter der Szintillationsfläschchen.</li>
	<li>Trypsinisieren, resuspendieren und zählen Sie die Zellen aus den verbleibenden nicht-radioaktiven Zellplatten (siehe Schritt 1.1), um die Anzahl der Zellen in den lysierten, radioaktiven Kulturen zu schätzen. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen pro nicht radioaktiver Vertiefung für jeden experimentellen Zustand. Normalisieren Sie die cpm von Schritt 1.11 auf die geschätzte Zellzahl der nicht radioaktiven Platten.</li>
	<li>Nach Abschluss des Experiments dekontaminieren Sie die Zellkulturhaube, den Labortisch und alle Instrumente mit einem Radioaktivitäts-Dekontaminationsspray. Führen Sie schließlich Wischtests durch, um sicherzustellen, dass der Arbeitsbereich strahlungsfrei ist.</li>
</ol>2. Aminosäureaufnahme in frisch isoliertem Knochengewebe (Protokoll II)
<ol><li>KRH auf 37 °C vorwärmen.</li>
	<li>Euthanasieren Sie eine 3 Tage alte Maus und entfernen Sie die Haut an den Armen. Trennen Sie den Humeri mit einer Schere von der Schulter und sezieren Sie beide Oberarmknochen. Entfernen Sie alle Magistralgewebe mit einem Skalpell und einer Pinzette. Entfernen Sie die Epiphysen vom Knochen. HINWEIS: Zusätzlich zu humerii kann dieses Protokoll an neonatale Femora, Tibiae und Calvariae sowie Humerii, Femora und Tibiae angepasst werden, die aus 2- und 4 Monate alten Mäusen isoliert wurden (unveröffentlichte Daten).</li>
	<li>Spülen Sie das Knochenmark aus dem Knochen und wiegen Sie die Knochenschäfte, um sich in Schritt 2.14 zu normalisieren.</li>
	<li>Kochen Sie einen Humerus in 1x PBS bei 100 °C für 10 min, um den Knochen zu dezellularisieren. Der dezellularisierte gekochte Knochen wird als Negativkontrolle verwendet. HINWEIS: Als Qualitätskontrolle bettet Paraffin die gekochten und nicht gekochten Knochen für histologische Färbungen ein, um visuell zu bestätigen, dass das Kochen bei der Dezellularisierung des Knochens wirksam war.</li>
	<li>Beide Humeri in 1 ml KRH für 30 min im Zellkulturinkubator bei 37 °C ausgleichen.</li>
	<li>Man stellt eine Arbeitslösung von 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginin in KRH her, indem man 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Argininbestand pro 1 ml KRH verdünnt. HINWEIS: Dieses Protokoll ist geeignet, um die Aufnahme des gewählten radioaktiv markierten Nährstoffs zu bewerten. L-[2,3,4-3 H]-Glutamin, L-[14CU]-Alanin und L-[2,3-3 H]-Prolin wurden mit ähnlichen Ergebnissen getestet. Arginin-Daten werden gezeigt, um den Nutzen dieses Protokolls hervorzuheben. ACHTUNG: Alle Verfahren mit Strahlung müssen hinter dem Plexiglasschirm unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) durchgeführt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie sowohl den experimentellen als auch den gekochten Kontrollknochen separat in KRH mit 4 μCi/ml L-[2,3,4-3 H]-Arginin für bis zu 90 min bei 37 °C. HINWEIS: Es ist wichtig, die Inkubationszeiten für verschiedene Bedingungen, einschließlich des Alters der Mäuse, verschiedener Skelettelemente und der Arten von radioaktiv markierten Aminosäuren, empirisch zu bestimmen, indem ein Zeitverlauf durchgeführt wird. Die Sättigung erfolgt meist nach ca. 3-4 h. Die Aufnahme sollte zu einem Zeitpunkt in der linearen Wut der Aufnahme bewertet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie das radioaktive Medium und entsorgen Sie es im Behälter für flüssige radioaktive Abfälle. Waschen Sie Humeri dreimal mit eiskaltem 1 ml KRH, um die Reaktion zu beenden. Entsorgen Sie alle Waschungen im Behälter für flüssige radioaktive Abfälle.</li>
	<li>Übertragen Sie jeden Knochen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 500 μL RIPA-Puffer hinzu [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8,0); 0,5% NP40 (v/v); 0,5% DOX (w/v); 0,1% SDS (w/v)]. Entsorgen Sie die Kulturplatten, serologischen Pipetten und Pipettenspitzen in einem Behälter für radioaktive feste Abfälle.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Oberarmknochen, indem Sie 100 Mal mit einer Schere in einem RIPA-Puffer hacken.</li>
	<li>Sonicate (Amplitude: 35%, Pulse 1 s) den resultierenden homogenisierten Knochen für 10 s. HINWEIS: Es ist auch bekannt, dass die Sondierung Aerosole erzeugt. Beschallungsschritte können in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Um die Aerosolbildung zu reduzieren, ist es wichtig, die Röhrchen nicht zu überfüllen. Die Beschallung kleiner Probenvolumina kann zu einer unvollständigen Beschallung oder zu Probenverlust aufgrund von Schaumbildung führen. Wenn Schaumbildung auftritt, zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten, um sich abzusetzen.</li>
	<li>Klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren für 10 min bei >10.000 x g bei Raumtemperatur. 200 μL des Überstands werden in Szintillationsfläschchen überführt, die 8 ml der Szintillationslösung enthalten. Mischen Sie, indem Sie die Szintillationsfläschchen kräftig schütteln. Entsorgen Sie alle festen radioaktiven Abfälle (z. B. gebrauchte Röhrchen, Pipettenspitzen, Platten usw.) in den Behälter für feste radioaktive Abfälle.</li>
	<li>Radioaktivität (cpm) mit dem Szintillationszähler ablesen. Entsorgen Sie gebrauchte Szintillationsfläschchen in dem für Szintillationsfläschchen vorgesehenen Behälter für radioaktive Abfälle.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die cpm des gekochten Knochens (Basalwert) von der cpm des experimentellen Knochens. Normalisieren Sie die Radioaktivität mit Knochengewicht aus Schritt 2.3.</li>
	<li>Besprühen Sie die Zellkulturhaube, die Instrumente und die Bank mit Radioaktivitätsdekontaminant. Führen Sie Wischtests durch, um zu bestätigen, dass der Arbeitsbereich strahlungsfrei ist.</li>
</ol>

<ol><li>Xiao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+%CE%B1-KG-dependent+histone+and+DNA+demethylases+by+fumarate+and+succinate+that+are+accumulated+in+mutations+of+FH+and+SDH+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors.</a> Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).</li>
<li>Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Krebs+to+clinic%3A+glutamine+metabolism+to+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).</li>
<li>Karner, C. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+and+cellular+metabolism+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).</li>
<li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin%2FIGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+dehydrogenase+promotes+senescence+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species.</a> Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).</li>
<li>Comes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Proline+induces+a+mesenchymal-like+invasive+program+in+embryonic+stem+cells+by+remodeling+H3K9+and+H3K36+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation.</a> Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine-driven+oxidative+phosphorylation+is+a+major+ATP+source+in+transformed+mammalian+cells+in+both+normoxia+and+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia.</a> Molecular Systems Biology. 9, 712(2013).</li>
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<li>Welbourne, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia+production+and+glutamine+incorporation+into+glutathione+in+the+functioning+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney.</a> Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).</li>
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<li>Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+promotes+cancer+cell+proliferation+through+use+as+an+amino+acid+exchange+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor.</a> Nature Communications. 7, 11457(2016).</li>
<li>Green, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+catabolism+fuels+adipocyte+differentiation+and+lipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis.</a> Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).</li>
<li>Shiraki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methionine+metabolism+regulates+maintenance+and+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+regulation+of+glutamine+consumption+by+WNT+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation.</a> Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sensor+Eif2ak4%2FGCN2+is+required+for+proliferation+of+osteoblast+progenitors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).</li>
<li>Rached, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+is+a+positive+regulator+of+bone+formation+by+favoring+protein+synthesis+and+resistance+to+oxidative+stress+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts.</a> Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).</li>
<li>Elefteriou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATF4+mediation+of+NF1+functions+in+osteoblast+reveals+a+nutritional+basis+for+congenital+skeletal+dysplasiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae.</a> Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).</li>
<li>Maleknia, S. D., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+amino+acids+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%2C+Peptides+and+Proteins+in+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of amino acids and proteins.</a> Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).</li>
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<li>Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transporters+revisited%3A+New+views+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Amino acid transporters revisited: New views in health and disease.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Angaben.

Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen schnellen und sensitiven Ansatz zur Bewertung der Aminosäureaufnahme als Reaktion auf verschiedene experimentelle Permutationen entweder in vitro oder ex vivo. Im Vergleich zu handelsüblichen Kits (z. B. Glutamine and Glutamate Determination Kit) ist diese Methode viel empfindlicher, schneller und weniger arbeitsintensiv16,17,25. In unserem Protokoll bewerten wir d...

Aminosäuren sind organische Verbindungen, die eine funktionelle Amino- (-NH2) und Carboxylgruppe (-COOH) mit einer variablen Seitenkette enthalten, die für jede Aminosäure spezifisch ist. Im Allgemeinen sind Aminosäuren als Grundbestandteil von Protein bekannt. In jüngerer Zeit wurden neuartige Anwendungen und Funktionen von Aminosäuren aufgeklärt. Zum Beispiel können einzelne Aminosäuren metabolisiert werden, um intermediäre Metaboliten zu erzeugen, die zur Bioenergetik beitragen, als enzymatische Cofaktoren fungieren, reaktive Sauerstoffspezies regulieren oder zur Synthese anderer Aminosäuren verwendet werden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Viele Studien zeigen, dass der Aminosäurestoffwechsel für die Pluripotenz, Proliferation und Differenzierung von Zellen in verschiedenen Kontexten entscheidend ist 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblasten sind sekretorische Zellen, die die Kollagen-Typ-1-reiche extrazelluläre Knochenmatrix produzieren und sezernieren. Um hohe Proteinsyntheseraten während der Knochenbildung aufrechtzuerhalten, benötigen Osteoblasten eine konstante Versorgung mit Aminosäuren. Um diese Nachfrage zu decken, müssen Osteoblasten aktiv Aminosäuren erwerben. In Übereinstimmung damit zeigen neuere Studien die Bedeutung der Aminosäureaufnahme und des Stoffwechsels für die Osteoblastenaktivität und Knochenbildung 15,16,17,18,19,20.
Osteoblasten erwerben zelluläre Aminosäuren aus drei Hauptquellen: extrazelluläres Milieu, intrazellulärer Proteinabbau und de novo Aminosäurebiosynthese. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bewertung der Aminosäureaufnahme aus der extrazellulären Umgebung. Die gebräuchlichsten Methoden zur Messung der Aminosäureaufnahme basieren entweder auf radioaktiv markierten (z. B. 3H oder 14C) oder schweren isotopenmarkierten (z. B. 13C) Aminosäuren. Schwere Isotopomer-Assays können die Aminosäureaufnahme und den Stoffwechsel gründlicher und sicherer analysieren, sind jedoch zeitaufwendiger und dauern mehrere Tage, da es einen Tag dauert, um Proben vorzubereiten und zu derivatisieren, und mehrere Tage, um auf dem Massenspektrometer zu analysieren, abhängig von der Anzahl der Proben21,22. Im Vergleich dazu sind radioaktiv markierte Aminosäureaufnahmetests nicht informativ über den nachgeschalteten Stoffwechsel, aber billig und relativ schnell, da sie innerhalb von 2-3 h nach Beginn des Experiments abgeschlossen werden können23,24. Hier beschreiben wir ein leicht modifizierbares Basisprotokoll zur Bewertung der radioaktiv markierten Aminosäureaufnahme in kultivierten Primärzellen oder Zelllinien in vitro oder einzelnen Knochenschäften ex vivo. Die Anwendung dieser beiden Protokolle kann auf andere radioaktiv markierte Aminosäuren und andere knochenassoziierte Zelltypen und Gewebe ausgedehnt werden.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD Präzision</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30G Nadel</td><td>BD Präzision</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Arginin Monohydrochlorid L-[2,3,4-3H]-, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1123001MC</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 Szintillationszähler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Cholinchlorid</td><td>Sigma</td><td>C7077</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Präparierwerkzeug</td><td></td><td></td><td>Pinzetten, Scheren, Scapels</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>HEPES(1M)</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>L-[3,4-3H(N)]-Glutamin</td><td>PerkinElmer</td><td>NET551250UC</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen mit flüssiger Szintilation</td><td>Sigma</td><td>Z190535</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumchloridlösung, 8M</td><td>Sigma</td><td>L7026</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MEM&alpha;</td><td>Gibco</td><td>12561</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 15mL</td><td>Biotix</td><td>89511-256</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonic& Werkstoffe</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>648311</td><td></td></tr><tr><td>Ultima Gold (Szintillationslösung)</td><td>PerkinElmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-(Methylamino)isobuttersäure</td><td>Sigma</td><td>M2383</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung des aminosäureverbrauchs in kultivierten knochenzellen und isolierten knochenschäften

Evaluation of Amino Acid Consumption in Cultured Bone Cells and Isolated Bone Shafts

Knochenentwicklung und Homöostase sind abhängig von der Differenzierung und Aktivität knochenbildender Osteoblasten. Die Osteoblastendifferenzierung ist sequentiell durch Proliferation gekennzeichnet, gefolgt von der Proteinsynthese und schließlich der Knochenmatrixsekretion. Proliferation und Proteinsynthese erfordern eine konstante Zufuhr von Aminosäuren. Trotzdem ist sehr wenig über den Aminosäureverbrauch in Osteoblasten bekannt. Hier beschreiben wir ein sehr empfindliches Protokoll, das entwickelt wurde, um den Aminosäureverbrauch mit radioaktiv markierten Aminosäuren zu messen. Diese Methode ist optimiert, um Veränderungen in der Aminosäureaufnahme zu quantifizieren, die mit der Proliferation oder Differenzierung von Osteoblasten, Arzneimittel- oder Wachstumsfaktorbehandlungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen verbunden sind. Wichtig ist, dass diese Methode austauschbar verwendet werden kann, um den Aminosäureverbrauch in kultivierten Zelllinien oder Primärzellen in vitro oder in isolierten Knochenschäften ex vivo zu quantifizieren. Schließlich kann unsere Methode leicht angepasst werden, um den Transport einer der Aminosäuren sowie von Glukose und anderen radioaktiv markierten Nährstoffen zu messen.

Der Aminosäuretransport wird durch viele membrangebundene Aminosäuretransporter reguliert, die basierend auf zahlreichen Merkmalen, einschließlich Substratspezifität, Kinetik sowie Ionen- und pH-Abhängigkeit in unterschiedliche Transportsysteme eingeteilt wurden25. Beispielsweise kann die Glutaminaufnahme durch die Na+-abhängigen Transportsysteme A, ASC, γ+L und N oder das Na+-unabhängige System L vermittelt werden. Die Na+-abhängigen Systeme unterscheiden sich durch die Fähi...

Dieses Protokoll stellt einen radioaktiv markierten Aminosäureaufnahmetest vor, der für die Bewertung des Aminosäureverbrauchs entweder in Primärzellen oder in isolierten Knochen nützlich ist.

Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften

Bone development and homeostasis is dependent upon the differentiation and activity of bone forming osteoblasts. Osteoblast differentiation is ...

Aminosäureaufnahme und Stoffwechsel sind essentiell für die Osteoblastenspezifikation, Differenzierung und Knochenbildung. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und empfindliche Methode zur Bewertung der Aminosäureaufnahme. Unser Protokoll verwendet radioaktiv markierte Aminosäuren, um die Aminosäureaufnahme zu quantifizieren.Es ist eine billige, empfindliche und schnelle Methode, die leicht für verschiedene Bedingungen modifiziert werden kann. Dieses Protokoll kann leicht modifiziert werden, um die Aufnahme anderer radioaktiv markierter Nährstoffe wie Glukose und Fettsäuren in einer Vielzahl von Geweben sowie in Primär- oder Transformationszellen zu bewerten. Zu Beginn der Aminosäureaufnahme Assay-Platte fünfmal 10 bis zum vierten ST2-Zellen in jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte in alpha-MEM-Medium ergänzt mit FBS, Penicillin und Streptomycin.Plate zusätzliche Vertiefungen von Zellen, um die Zellzahl pro Bedingung für die Normalisierungen zu quantifizieren. Als nächstes inkubieren Sie Zellen in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Tage, bis sie konfluieren. Nach der Inkubation saugen Sie das Medium ab und w

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Eine Phagen-Display-Bibliothek verwendet wurde, um Peptidsequenzen, die auf Knochen zu identifizieren. Das Ziel war, die Wirkung dieser Peptide auf mesenchymale Zelldifferenzierung zu untersuchen und ihre Wirkung auf die Knochenregeneration zu bestimmen.

Peptide aus Phage Display Bibliothek Genexpression modulieren in mesenchymalen Zellen und potenzieren Osteogenesis in unikortikale Knochendefekten

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zum Nachweis von Osteoblasten-sezernierten Kalziumablagerungen mit einem anionischen Farbstoff, Alizarin Red S. Die kultivierten Osteoblasten werden zuerst gefärbt und dann wird der Farbstoff für die kolorimetrische Quantifizierung von Kalziumablagerungen oder des Grades der Osteoblastenmineralisierung zurückgewonnen.

In-vitro-Mineralisierungsassay: Eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Osteoblasten-Kalziumablagerungen auf Knochentransplantatersatz durch Alizarinrot-Färbung und -Extraktion

Dieses Video zeigt eine in vitro Technik zur Abschätzung der Aminosäureaufnahme durch Stromazellen aus dem Knochenmark. Na+-abhängige Aminosäuretransporter vermitteln die Aufnahme von radioaktiv markierten Aminosäuren in den Zellen, und die zelluläre Aufnahme wird durch Messung der Radioaktivität geschätzt.

Radiomarkierter Aminosäureaufnahme-Assay zur Quantifizierung der zellulären Aufnahme von Aminosäuren

Wir beschreiben hier, wie man Knochen-konditionierten Medium (BCM) vorbereiten und testen ihre Aktivität in vitro.

Knochen konditioniertem Medium: Vorbereitung und Bioassay

Uran ist bekannt, Knochenstoffwechsel beeinflussen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von natürlichem Uranexposition auf die Lebensfähigkeit, die Differenzierung und die Funktion der Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für Knochenabbau.

Methoden zur Analyse der Auswirkungen des natürlichen Urans auf In-vitro- Osteoclastogenesis

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um den Zustand der Mineralien in Vesikeln veröffentlicht von zwei menschlichen Knochen Zelllinien zu vergleichen: hFOB 1,19 und Saos-2. Ihre Mineralisierung Profile wurden von Alizarin rot-S (AR-S) Färbung, ultravioletten (UV) Licht Visualisierung, Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bildgebung und Energie dispersiven Röntgen-Mikroanalyse (EDX) analysiert.

Analyse der Mineralien von hFOB 1.19 produziert und Saos-2 Zellen mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie mit Energy Dispersive x-ray Mikroanalyse

Hier stellen wir eine Methode für die ex vivo-Kultur der langen Murinknochen in den Phasen des Fetales und Neugeborenen vor, die für die Analyse der Knochen-und Knorpelentwicklung und der Homöostase unter kontrollierten Bedingungen geeignet ist, während der In-vivo-Prozess rekapituliert wird.

Die Kultivierung und Messung von Fetalen und Neugeborenen Murine Long Bones

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von 3D-Knochenkonstrukten unter Verwendung menschlicher Osteozyten, die in Methacrylgelatine-(GelMA)-Hydrogelen eingebettet sind und mit einer decellularisierten extrazellulären Matrix ergänzt werden. Die Methode ist kostengünstig, skalierbar und kompatibel mit einfachen Laborgeräten und bietet eine translationale Plattform zur Untersuchung von Prozesse muskuloskelettaler Erkrankungen.

Eine 3D-Knochenkulturplattform mit menschlichen Osteozyten und einer dezellularisierten extrazellulären Matrix zur Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen

Lernen Sie eine radiomarkierte Aminosäureaufnahme-Methode zur Bewertung des Nährstoffverbrauchs in primären Knochenzellen und isolierten Knochenschäften. Diese kostengünstige Technik ermöglicht schnelle und empfindliche quantifizierende Analysen.

Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften

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