Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans
October 14th, 2021
Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Hochdurchsatz-Workflows für die Wurmkultivierung, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutaminaggregaten als Bewertung von Veränderungen der Proteostase.
Ein einfacher Ansatz wurde gewählt, um Veränderungen in der Proteostase zu überwachen, indem die Polyglutaminaggregation bewertet und ein Framework bereitgestellt wurde, das für Anwendungen mit hohem Durchsatz verwendet werden kann. Die Bewertung eines Phänotyps wie der Anzahl der Aggregate durch I kann subjektiv werden. Die Automatisierung der Aggregatzählung ermöglicht es uns, solche Verzerrungen zu eliminieren, den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
Diese Methode hilft, bakterielle Gene zu identifizieren, die zur Störung der Wirtsproteostase beitragen. Das Verständnis des Beitrags einzelner bakterieller Gene wird uns helfen, ihre Auswirkungen auf die Pathogenese von Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Huntington zu verstehen. Beginnen Sie damit, die Platten, die Würmer enthalten, aus dem Gefrierschrank zu entfernen und bei Raumtemperatur auftauen zu lassen.
Wischen Sie dann überschüssiges Kondenswasser ab und entfernen Sie den Deckel vor der Bildgebung. Verwenden Sie die Mikroskopeinstellungen mit einer Belichtungszeit von 500 Millisekunden, einer Vergrößerung von 40 X mit einem 0,63-fachen Kameraadapter und einer GFP-Intensität von 100% während der Bildaufnahme. Stellen Sie nun die Durchlichtsteuerung so lange ein, bis die Würmer im Vergleich zum dunklen Hintergrund hell beleuchtet erscheinen, um eine Überbelichtung zu vermeiden.
Ändern Sie die Positionen von Würmern innerhalb des Bohrlochs, um ein übermäßiges Verklumpen zu verhindern, indem Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um Würmer vorsichtig in die gewünschte Position zu drücken. Legen Sie den Kanal auf GFP-Filter fest, um eine Fokusebene für beide Bilder festzulegen. Nehmen Sie ein helles Feldbild auf.
Klicken Sie auf die Bilder in der Dateiliste, um sie zu öffnen. Wählen Sie die Lupe aus, um einen Bereich von Interesse hervorzuheben, und das Pfeilsymbol, um die Länge von Würmern und Aggregaten zu messen. Bewegen Sie den Mauszeiger über das gewünschte Objekt, um seinen Intensitätswert zu bestimmen, der im unteren Teil des Bildschirms zu sehen ist.
Um die CellProfiler-Bildanalyse-Pipeline zu nutzen, benennen Sie die Bildpaare wie im Textmanuskript beschrieben, nachdem Sie den CellProfiler von der offiziellen Website heruntergeladen haben. Laden Sie die Pipeline herunter und laden Sie sie in CellProfiler hoch, indem Sie Datei, Import und Pipeline aus Datei auswählen. Wählen Sie das Modul Entwirrte Würmer aus, um seine Einstellungen zu öffnen, um ein Trainingsset zu laden, das zum Identifizieren von Würmern im Modul für entwirrte Würmer verwendet wird.
Identifizieren Sie dann den Dateinamen des Trainingssatzes. Wählen Sie das Symbol Datei hochladen und laden Sie auch die Zusatzdatei hoch. Laden Sie Bilder hoch, indem Sie das Bildmodul in der oberen linken Ecke auswählen.
Wählen Sie das Symbol Bilder analysieren aus, um mit der Bildanalyse zu beginnen. Wenn die Analyse zu lange dauert und bei der Verarbeitung eines einzelnen Bildes stecken bleibt, brechen Sie die Ausführung ab und identifizieren Sie das unverarbeitete Bild, indem Sie den Ausgabeordner sortieren und notieren, welcher Bildname nicht gefunden wurde. Nach vollständiger Analyse organisiert die Software die Ergebnisse in einer Excel-Tabelle, die einzelne Würmer in Spalte N und die jeweilige Anzahl von Aggregaten in Spalte K enthält.Laden Sie den Metadaten-Organizer herunter, um Daten aus der CSV-Ausgabedatei von CellProfiler bequem zu organisieren.
Suchen Sie unter Windows die heruntergeladene Datei und extrahieren Sie sie an den gewünschten Speicherort. Suchen und öffnen Sie den extrahierten Ordner mit dem Namen gui_Windowsos_64x. Starten Sie die Anwendung, indem Sie auf das GUI-Anwendungssymbol klicken.
Suchen Sie unter Mac OS die heruntergeladene Datei und extrahieren Sie die Anwendungsdatei für die Dateimetadaten-Organizer. Öffnen Sie den extrahierten Ordner, der in Downloads gefunden wurde. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die GUI-Anwendung und wählen Sie Öffnen.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Organisieren, die den Benutzer zu einem neuen Bildschirm mit einer Schaltfläche zum Herunterladen von Dateien führt. Klicken Sie auf die Schaltfläche und wählen Sie den gewünschten Speicherort aus, um die Ausgabedatei zu speichern. Die Ausgabedatei wird als ursprünglicher Dateiname angezeigt, wobei dem Dateinamen _organized Erweiterung hinzugefügt wird.
In Gegenwart von FUDR hatten Würmer, die mit verschiedenen Bakterien gefüttert wurden, eine konsistentere Körpergröße, die eine gleichmäßigere und genauere Erkennung von Würmern ermöglichte und so das Problem der Überfüllung löste. Das Einfrieren der Würmer verbesserte die PolyQ-Aggregaterkennung durch Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz sowie die Genauigkeit der automatisierten Zählung, die mit der manuellen Zählung vergleichbar ist. Die invertierte Hellfeldbeleuchtung wurde verwendet, um den gesamten C.elegans- und GFP-Kanal zu detektieren, um PolyQ-YFP-Aggregate abzubilden.
Die Erkennung, Entwirrung und Aggregatquantifizierung von Würmern für jeden Wurm erfolgte durch Anwendung einer optimierten CellProfiler-Bildverarbeitungspipeline, die es ermöglicht, die Anzahl der Aggregate pro einzelnen Wurm zu erhalten. Der Unterschied zwischen der Wirksamkeit der automatisierten Aggregatquantifizierung und der Verwendung der CellProfiler-Pipeline war minimal, was darauf hindeutet, dass die automatisierte Methode auf großflächige Bildschirme angewendet werden kann. Von 90 getesteten Bakterienstämmen zeigte die Besiedlung des Darms von C. elegans mit einem Kandidaten eine signifikante Abnahme der Anzahl der Aggregate.
Die Bestätigungsexperimente durch manuelle Zählung zeigten, dass keine der Mutanten, einschließlich derer, die die Anzahl der Aggregate signifikant verringerte, die PolyQ-Aggregation beeinflusste. Forscher, die sich für die Verwendung dieses Frameworks entscheiden, sollten verstehen, dass die beschriebenen Schritte nicht absolut sind. Modifikation und ein grundlegendes Verständnis für die Manipulation von CellProfiler sind für den Erfolg unerlässlich.
Zusätzliche biochemische Ansätze wie Western Blotting können verwendet werden, um die PolyQ-Aggregation zu bestätigen.
Übersicht
Diese Studie entwickelt einen Hochdurchsatz-Workflow für die Kultivierung von Würmern, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutamin-Aggregaten als Maß für Veränderungen in der Proteostase. Die Methode verbessert die Bewertung dieser Aggregate, insbesondere bei der Erforschung ihrer Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Proteostase
- Neurodegenerative Erkrankungen
- Hochdurchsatz-Screening
Hintergrund
- Polyglutamin-Aggregation ist mit Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Huntington verbunden.
- Das Verständnis der bakteriellen Genbeiträge zur Störung der Proteostase ist wesentlich.
- Traditionelle Bewertungsmethoden für Aggregate können subjektiv sein.
Verwendete Methoden
- Hochdurchsatz-Bildgebung und -Analyse mit CellProfiler
- C. elegans als biologisches Modell
- Automatisierte Quantifizierung von Polyglutamin-Aggregaten
Hauptergebnisse
- Automatisierte Bildverarbeitung ermöglicht die Eliminierung von Verzerrungen und eine erhöhte Reproduzierbarkeit bei der Zählung von Aggregaten.
- Identifizierte bakterielle Gene, die die Proteostase des Wirtes beeinflussen, mit signifikanten Ergebnissen in der Anzahl der Würmer-Aggregate.
- Validierte Ergebnisse zeigen, dass Automatisierung mit manueller Zählung vergleichbar ist und großangelegte Screenings unterstützt.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet einen zuverlässigen Rahmen für die Untersuchung der Proteostase durch Polyglutamin-Aggregation.
- Die aus dieser Methode gewonnenen Erkenntnisse sind relevant für das Verständnis der Mechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
