Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans
14. Oktober 2021
Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines Hochdurchsatz-Workflows für die Wurmkultivierung, Fluoreszenzbildgebung und automatisierte Bildverarbeitung zur Quantifizierung von Polyglutaminaggregaten als Bewertung von Veränderungen der Proteostase.
Ein einfacher Ansatz wurde gewählt, um Veränderungen in der Proteostase zu überwachen, indem die Polyglutaminaggregation bewertet und ein Framework bereitgestellt wurde, das für Anwendungen mit hohem Durchsatz verwendet werden kann. Die Bewertung eines Phänotyps wie der Anzahl der Aggregate durch I kann subjektiv werden. Die Automatisierung der Aggregatzählung ermöglicht es uns, solche Verzerrungen zu eliminieren, den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.
Diese Methode hilft, bakterielle Gene zu identifizieren, die zur Störung der Wirtsproteostase beitragen. Das Verständnis des Beitrags einzelner bakterieller Gene wird uns helfen, ihre Auswirkungen auf die Pathogenese von Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Huntington zu verstehen. Beginnen Sie damit, die Platten, die Würmer enthalten, aus dem Gefrierschrank zu entfernen und bei Raumtemperatur auftauen zu lassen.
Wischen Sie dann überschüssiges Kondenswasser ab und entfernen Sie den Deckel vor der Bildgebung. Verwenden Sie die Mikroskopeinstellungen mit einer Belichtungszeit von 500 Millisekunden, einer Vergrößerung von 40 X mit einem 0,63-fachen Kameraadapter und einer GFP-Intensität von 100% während der Bildaufnahme. Stellen Sie nun die Durchlichtsteuerung so lange ein, bis die Würmer im Vergleich zum dunklen Hintergrund hell beleuchtet erscheinen, um eine Überbelichtung zu vermeiden.
Ändern Sie die Positionen von Würmern innerhalb des Bohrlochs, um ein übermäßiges Verklumpen zu verhindern, indem Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um Würmer vorsichtig in die gewünschte Position zu drücken. Legen Sie den Kanal auf GFP-Filter fest, um eine Fokusebene für beide Bilder festzulegen. Nehmen Sie ein helles Feldbild auf.
Klicken Sie auf die Bilder in der Dateiliste, um sie zu öffnen. Wählen Sie die Lupe aus, um einen Bereich von Interesse hervorzuheben, und das Pfeilsymbol, um die Länge von Würmern und Aggregaten zu messen. Bewegen Sie den Mauszeiger über das gewünschte Objekt, um seinen Intensitätswert zu bestimmen, der im unteren Teil des Bildschirms zu sehen ist.
Um die CellProfiler-Bildanalyse-Pipeline zu nutzen, benennen Sie die Bildpaare wie im Textmanuskript beschrieben, nachdem Sie den CellProfiler von der offiziellen Website heruntergeladen haben. Laden Sie die Pipeline herunter und laden Sie sie in CellProfiler hoch, indem Sie Datei, Import und Pipeline aus Datei auswählen. Wählen Sie das Modul Entwirrte Würmer aus, um seine Einstellungen zu öffnen, um ein Trainingsset zu laden, das zum Identifizieren von Würmern im Modul für entwirrte Würmer verwendet wird.
Identifizieren Sie dann den Dateinamen des Trainingssatzes. Wählen Sie das Symbol Datei hochladen und laden Sie auch die Zusatzdatei hoch. Laden Sie Bilder hoch, indem Sie das Bildmodul in der oberen linken Ecke auswählen.
Wählen Sie das Symbol Bilder analysieren aus, um mit der Bildanalyse zu beginnen. Wenn die Analyse zu lange dauert und bei der Verarbeitung eines einzelnen Bildes stecken bleibt, brechen Sie die Ausführung ab und identifizieren Sie das unverarbeitete Bild, indem Sie den Ausgabeordner sortieren und notieren, welcher Bildname nicht gefunden wurde. Nach vollständiger Analyse organisiert die Software die Ergebnisse in einer Excel-Tabelle, die einzelne Würmer in Spalte N und die jeweilige Anzahl von Aggregaten in Spalte K enthält.Laden Sie den Metadaten-Organizer herunter, um Daten aus der CSV-Ausgabedatei von CellProfiler bequem zu organisieren.
Suchen Sie unter Windows die heruntergeladene Datei und extrahieren Sie sie an den gewünschten Speicherort. Suchen und öffnen Sie den extrahierten Ordner mit dem Namen gui_Windowsos_64x. Starten Sie die Anwendung, indem Sie auf das GUI-Anwendungssymbol klicken.
Suchen Sie unter Mac OS die heruntergeladene Datei und extrahieren Sie die Anwendungsdatei für die Dateimetadaten-Organizer. Öffnen Sie den extrahierten Ordner, der in Downloads gefunden wurde. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die GUI-Anwendung und wählen Sie Öffnen.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Organisieren, die den Benutzer zu einem neuen Bildschirm mit einer Schaltfläche zum Herunterladen von Dateien führt. Klicken Sie auf die Schaltfläche und wählen Sie den gewünschten Speicherort aus, um die Ausgabedatei zu speichern. Die Ausgabedatei wird als ursprünglicher Dateiname angezeigt, wobei dem Dateinamen _organized Erweiterung hinzugefügt wird.
In Gegenwart von FUDR hatten Würmer, die mit verschiedenen Bakterien gefüttert wurden, eine konsistentere Körpergröße, die eine gleichmäßigere und genauere Erkennung von Würmern ermöglichte und so das Problem der Überfüllung löste. Das Einfrieren der Würmer verbesserte die PolyQ-Aggregaterkennung durch Eliminierung der Hintergrundfluoreszenz sowie die Genauigkeit der automatisierten Zählung, die mit der manuellen Zählung vergleichbar ist. Die invertierte Hellfeldbeleuchtung wurde verwendet, um den gesamten C.elegans- und GFP-Kanal zu detektieren, um PolyQ-YFP-Aggregate abzubilden.
Die Erkennung, Entwirrung und Aggregatquantifizierung von Würmern für jeden Wurm erfolgte durch Anwendung einer optimierten CellProfiler-Bildverarbeitungspipeline, die es ermöglicht, die Anzahl der Aggregate pro einzelnen Wurm zu erhalten. Der Unterschied zwischen der Wirksamkeit der automatisierten Aggregatquantifizierung und der Verwendung der CellProfiler-Pipeline war minimal, was darauf hindeutet, dass die automatisierte Methode auf großflächige Bildschirme angewendet werden kann. Von 90 getesteten Bakterienstämmen zeigte die Besiedlung des Darms von C. elegans mit einem Kandidaten eine signifikante Abnahme der Anzahl der Aggregate.
Die Bestätigungsexperimente durch manuelle Zählung zeigten, dass keine der Mutanten, einschließlich derer, die die Anzahl der Aggregate signifikant verringerte, die PolyQ-Aggregation beeinflusste. Forscher, die sich für die Verwendung dieses Frameworks entscheiden, sollten verstehen, dass die beschriebenen Schritte nicht absolut sind. Modifikation und ein grundlegendes Verständnis für die Manipulation von CellProfiler sind für den Erfolg unerlässlich.
Zusätzliche biochemische Ansätze wie Western Blotting können verwendet werden, um die PolyQ-Aggregation zu bestätigen.
Übersicht
Diese Studie entwickelt einen Hochdurchsatz-Arbeitsablauf zur Kultivierung von Würmern, Fluoreszenzbildgebung und automatisierten Bildverarbeitung, um Polyglutamin-Aggregate als Maß für Veränderungen in der Proteostase zu quantifizieren. Die Methode verbessert die Beurteilung dieser Aggregate, insbesondere bei der Erforschung ihrer Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Proteostase
- Neurodegenerative Erkrankungen
- High-Throughput-Screening
Hintergrund
- Die Aggregation von Polyglutamin ist mit Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und Huntington verbunden.
- Das Verständnis des Beitrags bakterieller Gene zur Störung der Proteostase ist essenziell.
- Herkömmliche Bewertungsmethoden für Aggregate können subjektiv sein.
Verwendete Methoden
- Hochdurchsatz-Bildgebung und Analyse mithilfe von CellProfiler
- C. elegans als biologisches Modell
- Automatisierte Quantifizierung von Polyglutamin-Aggregaten
Hauptergebnisse
- Die automatisierte Bildverarbeitung ermöglicht die Eliminierung von Bias und erhöht die Reproduzierbarkeit beim Zählen von Aggregaten.
- Identifizierte bakterielle Gene, die die Proteostase des Wirts beeinflussen, mit bedeutenden Ergebnissen bezüglich der Aggregate im Fadenwurm.
- Validierte Ergebnisse zeigen, dass die Automatisierung dem manuellen Zählen vergleichbar ist, was groß angelegte Untersuchungen unterstützt.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet einen zuverlässigen Rahmen, um die Proteostase mittels Polyglutamin-Aggregation zu untersuchen.
- Die mithilfe dieser Methode gewonnenen Erkenntnisse sind relevant für das Verständnis der Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Automatisierung der Quantifizierung von Aggregaten bei C. elegans trägt dem Bedarf nach hochdurchsatzfähigen, unvoreingenommenen Bewertungen der Proteostase in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen Rechnung. Durch die Standardisierung der Bildakquisition und der auf CellProfiler basierenden Analyse ermöglicht die Methode die reproduzierbare Untersuchung großer Substanz- oder genetischer Bibliotheken. Dies unterstützt die frühe Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung in Entdeckungsprozessen für proteinkonformationelle Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Polyglutamin-Aggregation als Proxy für die Störung der Proteostase quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Reduziert die Subjektivität der phänotypischen Bewertung und verbessert die Datenzuverlässigkeit für Zielvalidierungsstudien.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Projekten im Portfolio, indem quantitative und reproduzierbare Messgrößen für die mechanismenbasierte Priorisierung von Wirkstoffen bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, quantitative Aggregatezahlen pro Wurm und ermöglicht dadurch robuste Assayauslesungen für Screening-Kampagnen.
- Operationaler Wert: Steigert die Durchsatzleistung und Reproduzierbarkeit durch Automatisierung und verringert manuelle Arbeitsschritte sowie interindividuelle Variabilität zwischen Bedienern.
- Assay-Eignung: Erzeugt strukturierte Ausgabedaten (Excel-Tabelle mit Wurm- und Aggregatezahlen), die mit nachgelagerten Datenanalyse-Workflows kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet C. elegans-Proteostasemodelle mit menschlichen neurodegenerativen Krankheitsmechanismen über konservierte polyQ-Aggregationswege.
- Mechanistische Ent风险minderung: Erleichtert die Identifizierung bakterieller oder genetischer Modulatoren der Aggregation und unterstützt die Target-Validierung in krankheitsrelevanten Systemen.
- Predictive Confidence: Ermöglicht es interdisziplinären Teams, Bedingungen mithilfe standardisierter, automatisierter Quantifizierung von Aggregaten zu vergleichen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung ein und liefert quantitative Aussagen zum Proteostasestatus, die über Go/No-Go-Entscheidungen informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu Proteostase-Mechanismen, indem objektive, inhaltsreiche Phänotypisierung von Aggregationen ermöglicht wird.
- Screening: Bietet einsatzbereite, standardisierte Wurm-Bildgebung und -Analyse, die mit Screenings im 96-Loch-Format oder größeren Formaten kompatibel ist.
- Analysen: Erzeugt quantifizierbare abhängige Variablen (Anzahl der Aggregate pro Wurm), die statistische Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus Invertebratenmodellen mit menschlichen Krankheitswegen über konservierte Aggregationsbiologie.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungs- und Analyse-Pipeline, die an verschiedene Proteostase-Ziele und Screening-Kampagnen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem Verzerrungen durch manuelles Zählen von Aggregaten eliminiert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Bildverarbeitung und automatisierte Datenausgabe.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem großangelegte Untersuchungen mit reduzierter manueller Arbeitszeit und höherer Datenqualität ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Weiterentwicklung durch zuverlässige, quantitative Biomarker der Proteostase.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Vertrautheit mit der Fluoreszenzmikroskopie und den GFP/YFP-Bildgebungsparametern zur Detektion von polyQ.
- Basiert auf der CellProfiler-Software und der zugehörigen Pipeline-Konfiguration für die automatisierte Segmentierung von Würmern und Aggregaten.
- Setzt eine standardisierte Benennung von Bildern und eine strukturierte Ordnerorganisation für die erfolgreiche Batch-Verarbeitung voraus.
- Profitiert von einer FUDR-Behandlung, um die Variabilität der Wurmgröße zu verringern und die Detektionsgenauigkeit in Hochdurchsatz-Platten zu verbessern.
- Erfordert eine Schulung der Benutzer, um die Pipeline an verschiedene Wurmartstämme, Expressionsmuster oder Bildgebungsaufbauten anzupassen.
