Herstellung von siRNA-beladenen Lipid-Nanopartikeln mit einem mikrofluidischen Gerät
22. März 2022
Mikrofluidik-basierte Lipid-Nanopartikel (LNP) Produktionsmethoden haben Aufmerksamkeit in Drug-Delivery-Systemen (DDSs) erregt, einschließlich der RNA-Delivery. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, die LNP-Produktion (siRNA-loaded LNP) und die LNP-Auswertungsprozesse unter Verwendung unseres ursprünglichen mikrofluidischen Geräts namens iLiNP.
Die Größe der Lipid-Nanopartikel beeinflusst die Bioverteilung, den Anti-Tumor-Effekt und die Gen-Silencing-Leistung. Daher ist die LNP-Größenkontrollmethode eine effektive Technik zur Herstellung von Nanoarzneimitteln, einschließlich RNA-Abgabesystemen. Dieses ursprüngliche mikrofluidische Gerät, das als iLiNP-Gerät bezeichnet wurde, war in der Lage, die LNP-Größe von 20 bis 100 Nanometern in 10 Nanometer-Intervallen zu kontrollieren.
Das iLiNP-Gerät kann nicht nur siRNA-beladene LNPs produzieren, sondern auch mRNA-beladene LNPS und Ribonukleoprotein-geladene LNPs. Nehmen Sie zunächst die Lipidethanollösungen und produzieren Sie die siRNA-beladenen LNPs, indem Sie DOTAP-, DSPC-, Cholesterin- und DMG-PEG2k-Lösungen in einem molaren Verhältnis von 50 zu 10 zu 38,5 zu 1,5 mischen. Stellen Sie die Gesamtlipidkonzentration auf acht Millimolar ein.
Dann nehmen Sie die wässrigen Lösungen von 154 Millimol-Kochsalzlösung und 25 Millimolar-Acetatpuffer bei pH 4 und filtern Sie sie durch 0,2 Mikrometer Membranfilter oder Spritzenfilter. Bereiten Sie die siRNA-Pufferlösung vor, indem Sie 70 Mikrogramm siGL4 in einen Milliliter mit 25 Millimolaracetatpuffer auflösen. Füllen Sie eine Milliliter Glasspritze mit Lipid- bzw. wässrigen Lösungen.
Verbinden Sie die Glasspritzen mit Hilfe von Spritzenverbindern mit den Peak-Kapillaren, stellen Sie dann die Durchflussrate der Lipid- und wässrigen Lösungen ein und führen Sie die Lipid- und wässrigen Lösungen separat mit Hilfe von Spritzenpumpen in das iLiNP-Gerät ein. Sammeln Sie die LNP-Suspensionen in einem Mikroröhrchen aus dem Auslass des iLiNP-Geräts. Dialysieren Sie die LNP-Suspension mit einer Dialysemembran von 12 bis 14 KiloDalton Molekulargewichtsgrenzen bei vier Grad Celsius über Nacht gegen Kochsalzlösung oder DPBS für POPC-LNPs bzw. siRNA-beladene LNPs.
Sammeln Sie die dialysierten LNP-Suspensionen in Mikroröhrchen und pipetieren Sie dann 20 bis 30 Mikroliter der LNP-Suspension zu einer Mikroquarzzelle. Messen Sie schließlich die LNP-Größe, die LNP-Größenverteilung und den Polydispergierindex durch dynamische Lichtstreuung. Die POPC-LNP-Größenverteilung, die unter verschiedenen Durchflussbedingungen erzeugt wird, z. B. der Gesamtdurchfluss und die Durchflussratenverhältnisse, sind hier dargestellt.
Präzise LNP-Größen von 20 bis 100 Nanometern können mit diesem iLiNP-Gerät gesteuert werden. Kleine LNPs werden bei hohen Gesamtdurchflussbedingungen gebildet. Darüber hinaus sind die LNP-Größen, die bei der FRR 5 gebildet werden, unabhängig von der Gesamtdurchflussrate kleiner als die der FRR 3.
Die Größenverteilung von siRNA-beladenen LNPs ist hier dargestellt. siRNAs werden durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem kationischen Lipid DOTAP und den negativ geladenen siRNAs in die LNPs eingekapselt. Das iLiNP-Gerät produzierte 90 Nanometer siRNA-beladene kationische LNPs mit einer engen Verteilung.
Die siRNA-Verkapselungseffizienz betrug 95% aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem kationischen Lipid und den negativ geladenen siRNAs. Die Zytotoxizität und die Gen-Silencing-Aktivität der 19 Nanometer-siRNA-beladenen LNPs wurden bewertet. siRNA-beladene LNPs zeigten Zytotoxizität bei einer Dosis von 10 bis 100 nanomolarer siRNA.
Das Expressionsniveau der Luciferase war in Abhängigkeit von der siRNA-Konzentration erniedrigt. Die siRNA-geladenen LNPs unterdrückten 80% Luciferase-Expression bei einer Dosis von 100 nanomolarer siRNA. Optimierungen der Strömungsverhältnisse sind die wichtigsten Schritte im Protokoll, um die gewünschte LNPs-Größe zu erhalten.
Die mikrofluidische LNP-Produktionsmethode einschließlich des iLiNP-Geräts erfordert kein kompliziertes Verfahren und wird voraussichtlich als Standard-LNP-Produktionsmethode eingesetzt.
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Herstellung von mit siRNA beladenen Lipid-Nanopartikeln (LNPs) unter Verwendung eines mikrofluidischen Geräts namens iLiNP vorgestellt. Die Methode ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Größe der LNPs, was für effektive Arzneimittelabgabesysteme von entscheidender Bedeutung ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Arzneimittelabgabesysteme
- Lipid-Nanopartikel
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Die Größe von Lipid-Nanopartikeln beeinflusst die Biodistribution und therapeutische Wirksamkeit.
- Die Kontrolle der LNP-Größe ist entscheidend, um die RNA-Abgabe zu optimieren.
- Mit dem iLiNP-Gerät lässt sich die Partikelgröße von 20 bis 100 Nanometern steuern.
- Elektrostatische Wechselwirkungen fördern die Einschließung von siRNA in LNPs.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Herstellung von siRNA-beladenen LNPs.
- Untersuchung des Einflusses der LNP-Größe auf die Effizienz der Genstilllegung.
- Optimierung der Strömungsbedingungen für gewünschte LNP-Eigenschaften.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Lipid- und wässrigen Lösungen zur Herstellung von LNPs.
- Verwendung des iLiNP-Geräts zum Mischen und zur Bildung von LNPs.
- Dialyse der LNP-Suspensionen zur Entfernung überschüssiger Bestandteile.
- Dynamische Lichtstreuung zur Bestimmung der Größe und Partikelverteilung von LNPs.
Hauptergebnisse
- Das iLiNP-Gerät produzierte siRNA-beladene LNPs mit einer Größe von 90 Nanometern und einer Einschlusswirkung von 95 %.
- Kleine LNPs bildeten sich unter Bedingungen hoher Gesamtdurchflussraten.
- siRNA-beladene LNPs zeigten Zytotoxizität und effektive Genstilllegung.
- Optimierte Durchflussbedingungen waren entscheidend, um die gewünschten LNP-Größen zu erreichen.
Schlussfolgerungen
- Die mikrofluidische Methode unter Verwendung des iLiNP-Geräts vereinfacht die Herstellung von LNPs.
- Es wird erwartet, dass dieser Ansatz die LNP-Herstellung in der Forschung standardisiert.
- Weitere Studien können die Anwendung dieser Methode in verschiedenen RNA-Abgabesystemen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die präzise Kontrolle der Größe von Lipid-Nanopartikeln (LNP) ist entscheidend für die Optimierung der Biodistribution, therapeutischen Wirksamkeit und Gen-Silencing-Leistung in RNA-basierten Arzneimittelabgabesystemen. Das mikrofluidische Gerät iLiNP ermöglicht die reproduzierbare Herstellung von LNPs mit einstellbarer Größe von 20 bis 100 Nanometern und unterstützt somit Workflows zur Validierung früher Zielstrukturen und zur Identifizierung führender Kandidaten. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem sie die Variabilität der Nanopartikel-Leistung verringert, ein entscheidender Faktor zur Risikominimierung bei der translationellen Weiterentwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der größenabhängigen biologischen Aktivität von siRNA-beladenen LNPs in Target-Validierungs-Assays.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte LNP-Formulierungen, um die Streuung in phänotypischen Screenings und mechanistischen Entwicklungsrisiko-Studien zu reduzieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt monodisperse siRNA-LNPs mit definierten Größen und einer Einschlusswirkung von 95 % zur zuverlässigen Wirkstoffbewertung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays durch reproduzierbare Kontrolle der LNP-Größe mittels Einstellung der Durchflussrate im iLiNP-Gerät.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Korrelation der LNP-Größe mit der Effizienz der Genstilllegung und der zellulären Toxizität in krankheitsrelevanten Systemen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die skalierbare Herstellung von mit mRNA, siRNA und ribonukleoproteinbeladenen LNPs für die präklinische Kontinuität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die iLiNP-Mikrofluidik-Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Entwicklung ein, insbesondere für RNA-Therapeutika, bei denen die größenabhängige Abgabe die Wirksamkeit beeinflusst.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem systematische Variationen der LNP-Größe hinsichtlich ihres Einflusses auf die zelluläre Aufnahme und Zielinteraktion ermöglicht werden.
- Screening: Stellt LNP-Formulierungen bereit, die für Assays direkt einsatzbereit sind, mit konsistenter Größenverteilung und hoher siRNA-Einschließung für reproduzierbare Wirkstoffscreenings.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse zur Größe, Polydispersität und Zetapotential mittels dynamischer Lichtstreuung, um Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch zu unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet die optimierte LNP-Herstellung in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Bewertung durch standardisierte, größenkontrollierte Nanomedikamente.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Herstellung verschiedener RNA-beladener LNPs (siRNA, mRNA, RNP) über mehrere Projekte hinweg.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Vertrauen in das Zielmolekül, indem physikochemische Eigenschaften von LNPs mit funktionellen Ergebnissen wie der Gen-Silenzierung verknüpft werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der LNP-Produktion durch die Präzision mikrofluidischer Verfahren.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien, indem die Leistungsfähigkeit von Transportvehikeln frühzeitig bewertet und entschärft werden kann.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von RNA-therapeutischen Kandidaten basierend auf der Effizienz des Transportsystems.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Lipidformulierung, mikrofluidischen Handhabung und Nukleinsäurebeladung.
- Benötigt Spritzenpumpen, Glasspritzen und Dialyseausrüstung zur Reinigung der LNPs.
- Erfordert die Standardisierung von Strömungsgeschwindigkeitsverhältnissen und Gesamtströmungsbedingungen zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel der Lipidzusammensetzung oder der Art der RNA-Fracht.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer Dialyse nach der Produktion und der dynamischen Lichtstreuung zur Qualitätskontrolle.
Biopharma-FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
