Name: Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Lernen Sie den Adhäsion Footprint Assay zur Untersuchung molekularer Kräfte bei der Zelladhäsion. Diese Methode ermöglicht die räumliche Kartierung und Quantifizierung von Rolladhäsion auf molekularer Ebene.

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Diese Arbeit wurde von der Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), dem New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), der Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) und dem University of British Columbia Eminence Fund unterstützt.

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Der Adhäsions-Footprint-Assay ermöglicht die Visualisierung der molekularen Adhäsionsereignisse zwischen PSGL-1 und P-Selektin während der Zellrollenadhäsion. Dieser Prozess wird durch P-Selektin-vermittelte Erfassung eingeleitet, gefolgt von einem Walzen unter fluidischer Scherspannung. Mögliche Probleme während des Experiments beinhalten in der Regel ein schlechtes Zellrollen oder fehlende fluoreszierende Spuren, selbst wenn die Zellen gut rollen. Diese Probleme resultieren häufig aus Qualitätskontrollen an den kritisc...

Die rollende Adhäsionskaskade beschreibt, wie zirkulierende Zellen an die Blutgefäßwand binden und entlang dieser rollen1. Passives Walzen wird hauptsächlich durch Selectine vermittelt, eine Hauptklasse zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAMs)1. Unter dem Scherfluss des Blutes bilden Leukozyten, die P-Selektin-Glykoprotein-Ligand-1 (PSGL-1) exprimieren, hochtransiente Bindungen mit P-Selektin, die auf der Oberfläche entzündeter Endothelzellen exprimiert werden können. Dieser Prozess ist entscheidend dafür, dass Leukozyten an einen Ort der Entzündung wandern2. Darüber hinaus ist PSGL-1 auch ein mechanosensitiver Rezeptor, der in der Lage ist, die nachfolgende feste Adhäsionsstufe der rollenden Adhäsionskaskade auszulösen, wenn er mit P-Selektin3 interagiert.
Genetische Mutationen, die die CAM-Funktion beeinflussen, können das Immunsystem stark beeinträchtigen, wie z.B. bei der seltenen Erkrankung des Leukozytenadhäsionsmangels (LAD), bei der eine Fehlfunktion der Adhäsionsmoleküle, die das Rollen vermitteln, zu stark immungeschwächten Personen führt4,5,6. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen nach einem ähnlichen Rollprozess wandern, was zu Metastasen führt7,8. Da das Zellrollen jedoch schnell und dynamisch ist, sind herkömmliche experimentelle mechanotische Methoden ungeeignet, um molekulare Wechselwirkungen während des Zellrollens zu untersuchen. Während Einzelzell- und Einzelmolekül-Manipulationsmethoden wie Rasterkraftmikroskopie und optische Pinzette molekulare Wechselwirkungen wie die kraftabhängige Wechselwirkung von P-Selectin mit PSGL-1 auf Einzelmolekülebene untersuchen konnten9, sind sie für die Untersuchung von Live-Adhäsionsereignissen während des Zellrollens ungeeignet. Darüber hinaus kann die in vitro charakterisierte Interaktion die Frage nach der molekularen Adhäsion in vivo nicht direkt beantworten. Welcher molekulare Spannungsbereich ist beispielsweise biologisch relevant, wenn Zellen in ihrer natürlichen Umgebung funktionieren? Berechnungsmethoden wie die Klebstoffdynamiksimulation10 oder das einfache stationäre Modell11 haben bestimmte molekulare Details und deren Einfluss auf das Walzverhalten erfasst, sind aber stark von der Genauigkeit der Modellierungsparameter und -annahmen abhängig. Andere Techniken wie die Zugkraftmikroskopie können Kräfte während der Zellmigration erkennen, liefern jedoch keine ausreichende räumliche Auflösung oder quantitative Informationen über die molekulare Spannung. Keine dieser Techniken kann direkte experimentelle Beobachtungen der zeitlichen Dynamik, der räumlichen Verteilung und der Magnitudenheterogenität molekularer Kräfte liefern, die sich direkt auf die Zellfunktion und das Zellverhalten in ihrer nativen Umgebung beziehen.
Daher ist die Implementierung eines molekularen Kraftsensors, der in der Lage ist, selektive Wechselwirkungen genau zu messen, von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis der Walzadhäsion zu verbessern. Hier beschreiben wir das Protokoll für den Adhäsions-Footprint-Assay12, bei dem PSGL-1-beschichtete Kügelchen auf einer Oberfläche gerollt werden, die p-selektin-funktionalisierte Spannungsmessstreifen-Tethers (TGTs)13 präsentiert. Diese TGTs sind irreversible DNA-basierte Kraftsensoren, die zu einer permanenten Historie von Bruchereignissen in Form von Fluoreszenzanzeigen führen. Dies wird durch das Aufbrechen des TGT (dsDNA) und anschließende Markierung des rupturierten TGT (ssDNA) mit einem fluoreszierend markierten Komplementärstrang erreicht. Ein großer Vorteil dieses Systems ist seine Kompatibilität sowohl mit beugungsbegrenzter als auch mit hochauflösender Bildgebung. Der fluoreszenzmarkierte Komplementärstrang kann entweder dauerhaft gebunden (>12 bp) für die beugungsbegrenzte Bildgebung oder vorübergehend gebunden (7-9 bp) für die hochauflösende Bildgebung durch DNA PAINT. Dies ist ein ideales System, um die Walzhaftung zu untersuchen, da die TGTs während des aktiven Walzens gerissen sind, aber die Fluoreszenzanzeige wird nach dem Walzen analysiert. Die beiden bildgebenden Verfahren geben dem Anwender zudem mehr Freiheit, die Rollhaftung zu untersuchen. Typischerweise ist die beugungsbegrenzte Bildgebung nützlich, um die molekulare Bruchkraft durch Fluoreszenzintensität zu extrahieren13, während die hochauflösende Bildgebung eine quantitative Analyse der Rezeptordichte ermöglicht. Mit der Fähigkeit, diese Eigenschaften der Walzadhäsion zu untersuchen, bietet dieser Ansatz eine vielversprechende Plattform für das Verständnis des Kraftregulationsmechanismus auf die molekulare Adhäsion von rollenden Zellen unter Scherfluss.

<table><tbody><tr><td>4-Kanal-Bohrschablone</td>: <td>Maßanfertigung</td><td></td>, <td>3D-gedruckt mit ABS-Filament</td></tr>, <tr><td>4-Loch-Schiene</td><td>, Maßanfertigung</td><td></td><td>: Bohren Sie saubere Mikroskopschiene mit einem Dremel mit diamantbeschichteten Bohrern auf einer 4-Kanal-Bohrführung, deren Layout mit den Zentren der 8-32 Gewindelöcher an der Aluminiumklemme übereinstimmt.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Acryl Abstandhalter</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Schneiden Sie zwei Blöcke Acrylplatten mit den Maßen 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Bohren Sie auf jedem Block zwei 3-mm-Löcher, die genau mit den 4-40 Löchern auf dem Aluminiumhalter ausgerichtet sind.</td></tr><tr><td></td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>Maschinenförmiger eloxierter Aluminiumblock zu einem C-förmigen Halter mit den Außenmaßen von 640 mm x 500 mm x 65 mm und den Öffnungsmaßen 400 mm x 380 mm x 65 mm. Ein- und Auslässe sind mit 8-32 Gewinde versehen.</td></tr><tr><td>Aminosilan</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Antibiotische / antimykotische Lösung</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Pen/Strepto/Fungiezone</td></tr><tr><td>Beads, ProtG beschichtetes Polystyrol</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Puffer, DNA PAINT</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA-Puffer</td></tr><tr><td>, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Puffer, Rollierender</td><td></td><td></td><td>HBSS mit 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0,1% BSA-Puffer</td></tr><tr><td>, Wash</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Konzentrierte Schwefelsäure</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2,5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Deckglas-Haltepinzette</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Diamantbeschichteter Bohrer Bits</td><td>Schleiftechnologie</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm Diamantbohrer-DNA</td></tr><tr><td>, Amin-ssDNA (oberer Strang)</td><td>IDT DNA</td><td>Custom Oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotin-ssDNA (unterer Strang)</td><td>IDT DNA</td><td>Custom oligo</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, Imager-Strang für DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Custom</td><td>oligo GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, Imager-Strang für die dauerhafte Markierung</td><td>IDT DNA</td><td>Custom oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 Zoll Breite, permanentes doppelseitiges Klebeband</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Gorilla</td><td>42001</td><td>5 Minuten Aushärtungszeit</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Glas, Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Glas, Objektträger</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Glas, Färbeglas</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Wheaton Färbeglas (900620)</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtekammer-Objektträgerhalterung</td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td><td>3D-gedruckt mit ABS-Filament</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Einlässe/Auslässe</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td><td>Bohren Sie mit Kobaltbohrern durch acht Stellschrauben 8-32. Einsatz 1,5 cm&nbsp; Polyethylenschlauch (Tygon, I.D. 1/32" O.D. 3/32") in jede hohle Stellschraube</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Ni-NTA-Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Versandhülsen</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Gelsäulen</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>In SSC Puffer</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-Biotin</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Protein, Protein G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-Terminus His-Tag und C-Terminus </td></tr><tr><td>Cysteinprotein, P-Selektin-Fc</td><td>R& D-System</td><td>137-PS</td><td>Rekombinantes humanes P-Selectin/CD62P Fc-Chimärenprotein,</td></tr><tr><td>CF-Protein, Streptavidin</td><td>Cedarlan</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pumpenspritze</td><td>Harvard-Gerät</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Ward' s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Spritze Hamilton</td><td>81520</td><td>Spritzen mit PTFE-Luer-Lock, 5 mL</td></tr><tr><td>Spritzennadeln</td><td>BD</td><td>305115</td><td>Precision Glide 26 G, 5/8 Zoll Länge</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch, Adapter</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>Formulierung 3350, Innendurchmesser 1/32"; Außendurchmesser 3/32"</td></tr><tr><td>Schlauch, Polyethylen</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) Innendurchmesser 0,38 mm; Außendurchmesser 1,09 mm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

abbildung der molekularen adhäsion im zellrollen durch adhäsion footprint assay

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Die rollende Adhäsion, die durch selektinvermittelte Wechselwirkungen erleichtert wird, ist eine hochdynamische, passive Motilität bei der Rekrutierung von Leukozyten an der Entzündungsstelle. Dieses Phänomen tritt in postkapillaren Venolen auf, wo der Blutfluss Leukozyten in einer rollenden Bewegung auf die Endothelzellen drückt. Stabiles Walzen erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Bildung von Adhäsionsbindungen und deren mechanisch angetriebener Dissoziation, so dass die Zelle während des Walzens in Strömungsrichtung an der Oberfläche befestigt bleibt. Im Gegensatz zu anderen Adhäsionsprozessen, die in relativ statischen Umgebungen ablaufen, ist die Rolladhäsion hochdynamisch, da sich die Rollelzellen mit mehreren zehn Mikrometern pro Sekunde über Tausende von Mikrometern bewegen. Konventionelle mechanoologische Methoden wie die Zugkraftmikroskopie sind daher aufgrund der kurzen Zeitskala und der erforderlichen hohen Sensitivität ungeeignet, um die einzelnen Adhäsionsereignisse und die damit verbundenen molekularen Kräfte zu messen. Hier beschreiben wir unsere neueste Implementierung des Adhäsions-Footprint-Assays zur Abbildung des P-Selektins: PSGL-1-Wechselwirkungen in der rollenden Adhäsion auf molekularer Ebene. Diese Methode verwendet irreversible DNA-basierte Spannungsmessstreifenbinder, um eine permanente Historie molekularer Adhäsionsereignisse in Form von Fluoreszenzspuren zu erzeugen. Diese Spuren können auf zwei Arten abgebildet werden: (1) Zusammenfügen von Tausenden von beugungsbegrenzten Bildern, um ein großes Sichtfeld zu erzeugen, das die Extraktion des Adhäsionsfußabdrucks jeder rollenden Zelle über Tausende von Mikrometern Länge ermöglicht, (2) Durchführen von DNA-PAINT, um hochauflösende Bilder der Fluoreszenzspuren in einem kleinen Sichtfeld zu rekonstruieren. In dieser Studie wurde der Adhäsions-Footprint-Assay verwendet, um HL-60-Zellen zu untersuchen, die bei verschiedenen Scherspannungen rollen. Dabei konnten wir die räumliche Verteilung der P-Selektin:PSGL-1-Wechselwirkung abbilden und durch fluoreszenzintensität Einblick in ihre molekularen Kräfte gewinnen. Damit liefert diese Methode die Grundlage für die quantitative Untersuchung der verschiedenen Zell-Oberflächen-Wechselwirkungen, die an der Rolladhäsion auf molekularer Ebene beteiligt sind.

Das obige Protokoll beschreibt das experimentelle Verfahren des Adhäsion Footprint Assays. Der allgemeine Experimentablauf ist in Abbildung 1 dargestellt, von der Durchflusskammeranordnung (Abbildung 1A) über die Oberflächenfunktionalisierung (Abbildung 1B) bis hin zu den Experiment- und Bildgebungsschritten (Abbildung 1C).
Abbildung 2 ist ein re...

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Dieses Protokoll hilft, die Verbindung zwischen molekularer Kraft und Zellrollenverhalten herzustellen und ermöglicht es, die rollende Adhäsion auf molekularer Ebene räumlich abzubilden und zu quantifizieren. Diese Technik ermöglicht es, individuelle Adhäsionsereignisse während des eigentlichen Zellrollens zu untersuchen, so dass wir die physiologisch relevante molekulare Adhäsionskraft direkt messen können. Die Oberflächenvorbereitung mit der entsprechenden Konzentration und Inkubationszeit in jedem Schritt ist entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Oberflächenfunktionalisierung zu erreichen.Die Qualität der Biokonjugationen und die richtigen Bedingungen sind ebenfalls entscheidend. Die visuelle Demonstration ist entscheidend, um Forschern zu helfen, dieses Protokoll zu replizieren. Insbesondere die Schritte wie die Montage der Durchflusskammer und die Nachbearbeitung von Bildern werden von einer visuellen Demonstration stark profitieren.Beginnen Sie, indem Sie eine kleine Menge Epoxidharz auf beiden Seiten des doppelseitigen Klebebandes mit einer Rasierklinge dünn verteilen. Schneiden Sie das epoxidbeschichtete Klebeband mit einem Laser ab, um vier Kanäle zu erzeugen. Erstellen Sie den Flow-Chip, indem Sie das Epoxidband zwischen einem Vier-Loch-Schlitten und einem PEG-Deckglas einklemmen.Üben Sie mit einer Pipettenspitze sanften Druck entlang der Länge der Kanäle aus, um eine gute Abdichtung zu erzeugen, und härten Sie das Epoxidharz dann für mindestens eine Stunde aus. Richten Sie den Chip so aus, dass die Öffnung jedes Kanals in der Mitte des Adapters positioniert ist. Platzieren Sie dann zwei transparente Acryl-Abstandhalter auf dem Chip.Üben Sie festen Druck in der Mitte des Blocks aus und schrauben Sie an den Enden jedes Abstandhalters. Schrauben Sie die Einlässe in die Gewindelöcher auf der anderen Seite der Halterung und überwachen Sie den Dichtungszustand durch den transparenten Acrylblock. 200 Mikroliter Waschpuffer in die Kammer strömen, um nach Leckagen zu suchen.Wenn sich Blasen im Kanal bilden, drücken Sie aggressiv weitere 200 Mikroliter Waschpuffer, um die Blasen zu entfernen. Geben Sie 40 Mikroliter BSA in die Durchflusskammer, um eine unspezifische Bindung zu verhindern, und inkubieren Sie für 10 Minuten in der Feuchtigkeitskammer. Nach der Inkubation 40 Mikroliter bei Tween 20 in die Durchflusskammer geben und erneut 10 Minuten inkubieren, um die unspezifische Bindung weiter zu reduzieren.Dann waschen Sie den Kanal mit 200 Mikrolitern Waschpuffer, um alle Passivierungsmittel zu entfernen. Für die Funktionalisierung der Kammeroberfläche fügen Sie 40 Mikroliter Streptavidin in die Durchflusskammer hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten, dann waschen Sie die Kammer mit 200 Mikrolitern Waschpuffer. Geben Sie nun 40 Mikroliter hybridisiertes Protein G-TGT in die Durchflusskammer und inkubieren Sie für 20 Minuten.Nach dem Waschen mit Waschpuffer 40 Mikroliter Protein G-TGT oberer Strang hinzufügen und 20 Minuten inkubieren, um jeden unhybridisierten TGT-Bodenstrang auf der Oberfläche zu vervollständigen, und dann mit Waschpuffer waschen. Zum Schluss 40 Mikroliter P-Selectin-Fc in die Durchflusskammer geben und vor dem Waschen mit Waschpuffer 60 Minuten inkubieren. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Glasspritze mit dem Rollpuffer und klopfen Sie auf die Seiten der Spritze, um die Blasen zu lösen und herauszudrücken, während sie in Richtung der Spitze schweben.Nachdem Sie eine sterile Nadel in ein 200 Millimeter großes Stück Polyethylenschlauch eingeführt haben, verbinden Sie die Nadel mit der Glasspritze. Befestigen Sie die Spritze an der Spritzenpumpe und neigen Sie die Spritzenpumpe so, dass die Kolbenseite angehoben ist, um zu verhindern, dass Luftblasen in den Kanal gelangen. Setzen Sie das Ende des Rohrs in den Einlass der Durchflusskammer ein.Setzen Sie ein Ende eines weiteren 200-Millimeter-Stücks des Polyethylenschlauchs in den Auslass ein und tauchen Sie das andere Ende in ein Abfallbecherglas. Nehmen Sie ein bis zwei Milliliter der Zellsuspensionsprobe und zentrifugieren Sie sie, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 500 Mikrolitern des Rollpuffers.Trennen Sie den Schlauch vorsichtig von den Einlässen und dem Auslass und pipettieren Sie 40 Mikroliter der Zellsuspension in die Durchflusskammer. Schließen Sie den Schlauch wie zuvor beschrieben wieder an, um sicherzustellen, dass keine Blasen in den Strömungskanal eingeführt werden. Beginnen Sie das Zellwalzexperiment, indem Sie die Spritzenpumpe mit den gewünschten Durchflussraten starten.Beobachten Sie das Rollen von Zellen mit einem Dunkelfeldmikroskop mit einem 10-fachen Objektiv. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen aus dem Kanal, indem Sie den Rollpuffer mit 100 Millilitern pro Stunde infundieren, bis die Oberfläche zellfrei ist. Um die lokalen Spuren durch DNA-PAINT abzubilden, fügen Sie dem Kanal 40 Mikroliter DNA-PAINT-Imager-Strang hinzu, der im DNA-PAINT-Puffer hergestellt wurde.Führen Sie eine totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der im Textmanuskript genannten Bedingungen durch. Lokalisieren und rendern Sie die hochauflösenden Bilder. Um die langen Spuren durch permanente Beschriftung abzubilden, fügen Sie den permanenten Imager-Strang hinzu und inkubieren Sie für 120 Sekunden im T50M5-Puffer.Dann waschen Sie den Kanal, indem Sie 200 Mikroliter Waschpuffer infundieren. Nehmen Sie ein Bild mit ausgeschaltetem Anregungslaser auf, um Hintergrundrauschen der Kamera zu erhalten. Stellen Sie eine große Fläche in einem Gittermuster mit TIRF-Mikroskopie dar.Programmieren Sie das Mikroskop so, dass es über die Fläche von 400 mal 50 Bildern scannt, und teilen Sie die Rohdaten mit dem Programm ImageJ in einzelne TIP-Dateien mit jeweils maximal 10.000 Bildern auf. Reduzieren Sie alle Bilder mit dem Beleuchtungsprofil und verwenden Sie das MIST-Plugin, um die Bilder zusammenzusetzen. Das Ergebnis für die Charakterisierung der Protein-G-ssDNA-Biokonjugation zeigte ein Verhältnis von fast eins zu eins von Protein G zu ssDNA, wobei das Protein G Maleimid ssDNA und Imidazol-Elutionspufferspektren aus der orthogonalen Basis für die Anpassung an das Produktspektrum der Biokonjugation vorliegen.Native PAGE wurde verwendet, um die Biokonjugation zu bestätigen, die die hellgrünen Bänder zeigt, die mit dem monomeren Protein G-Band zusammenfallen, was auf eine erfolgreiche Konjugation und einen guten Ertrag hinweist. Das TIRF-Beleuchtungsprofil, das von einer Singlemode-Faser eingeführt wird, ist im Allgemeinen in der Mitte des Sichtfeldes heller und an den Rändern dunkler. Um die ungleichmäßige Ausleuchtung auszugleichen und die Bilder für die quantitative Analyse abzuflachen, wurde das Beleuchtungsprofil durch Mittelung tausender Einzelbilder ermittelt.Abgeflachte Bilder wurden erzeugt, indem das Kamerarauschen sowohl von Roh- als auch von Beleuchtungsprofilen subtrahiert und dann durch das Beleuchtungsprofil normalisiert wurde. Raw Stitching zeigte klare periodische Muster, die den unkorrigierten Bildern entsprachen, während das gleiche Sichtfeld, das aus abgeflachten Bildern zusammengefügt wurde, einen flachen Hintergrund erzeugte. Ein Ramp-up-Strömungsprofil wurde verwendet, um den Bereich der Scherspannung zu bestimmen, was zu Zellwalz- und Fluoreszenzspuren führte, unter denen ein typischer Einzelzell-Adhäsions-Footprint zu sehen war.Suboptimale und optimale Ergebnisse von fluoreszierenden Spuren mit unzureichendem Kontrast, übermäßiger Spurdichte, optimaler Spurdichte und Kontrast sowie Beugungsbegrenzter und DNA-PAINT-Bildgebung werden gezeigt. Eine Inkubationszeit von mehr als 60 Minuten gewährleistet eine Oberflächenfunktionalisierung und eine ordnungsgemäße Kammerkonstruktion verhindert den Durchgang von Blasen, die die funktionalisierte Oberfläche beschädigen. Dieses Verfahren eignet sich für die quantitative Analyse der molekularen Kraft, die an der Walzadhäsion beteiligt ist, und ermöglicht es den Forschern, das Walzverhalten der verschiedenen Zelltypen zu verstehen.Diese Technik ermöglicht es den Forschern, neue Fragen zu schnellen Adhäsionsereignissen zu untersuchen, die zu einer weiteren Weiterentwicklung der Einzelmolekül- und Mechanobiologieforschung führen.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Protokoll zu beobachten und zu analysieren Zellrollen Trajektorien auf asymmetrische Rezeptor-gemusterten Substrate. Die resultierenden Daten sind nützlich für das Engineering von Rezeptor-gemusterten Substrate für Label-freie Zelle Trennung und Analyse.

Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese Studie verwendet eine Multi-Well-Platte mikrofluidischen System, deutlichen Erhöhung des Durchzellroll Studien unter physiologisch relevanten Scherströmung. Angesichts der Bedeutung der Zellvoll in der Mehrschrittzellen Homing Kaskade und die Bedeutung der Referenzzelle nach systemischer Abgabe exogener Populationen von Zellen in Patienten, bietet dieses System als Screening-Plattform zellbasierte Therapie verbessern Potential.

Systematische Analyse von In-vitro- Zellroll Mit einer Multi-Well-Platte mikrofluidischen System

Statischen Adhäsionsassay ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Wechselwirkungen zwischen T-Lymphozyten und andere Zelltypen zu modellieren. Interaktionen werden durch Injizieren markierten T-Zellen in Vertiefungen, die mit Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, während ein Plattenlesegerät verwendet wird, um die Anzahl der anhaftenden Zellen zu quantifizieren folgenden seriellen Waschungen erzeugt.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

Mechanische Steifigkeit in der Tumor-Mikroumgebung spielt eine entscheidende Rolle bei der malignen Verhalten durch Erhöhung invadopodia Aktivität und Actomyosin Kontraktilität. Verwendung Polyacrylamidgelen (PAAs), kann invadopodia und Zugkraft-Assays verwendet werden, die invasive und kontraktilen Eigenschaften von Krebszellen in Reaktion zu untersuchen, um die Steifigkeit Matrix.

Polyacrylamidgelen für Invadopodia und Traction Force-Assays auf Krebszellen

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.

Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

Lernen Sie den Adhäsion Footprint Assay zur Untersuchung molekularer Kräfte bei der Zelladhäsion. Diese Methode ermöglicht die räumliche Kartierung und Quantifizierung von Rolladhäsion auf molekularer Ebene.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

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