Name: Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie ein zellulärer Reporter-Assay die Spleißeffizienz in HeLa-Zellen überwacht und Mutationseffekte analysiert. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung therapeutischer U1-snRNA-Strategien.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel an S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (institutional research grant 74-001-34-IRG) sowie an S.S. und W.M. aus dem Valley Research Partnership Program (P1-4009 und VRP77) unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Der Assay kann für die Spleißanalyse in anderen Zelllinien als HeLa angepasst werden, jedoch müssen Faktoren, die die Transfektionseffizienz beeinflussen, wie Zellkonfluenz und DNA-Menge, möglicherweise optimiert werden. Das Konstruktverhältnis von Reporter zu U1 ist ein weiterer kritischer Parameter, der möglicherweise in Abhängigkeit von den in anderen Zelltypen beobachteten Expressionsniveaus bestimmt werden muss. Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse; Daher wird die Verwendung von R...

Pre-mRNA-Spleißen ist ein wesentlicher Verarbeitungsschritt, der nicht-kodierende Introns entfernt und exakt Ligaten kodiert, die Exons kodieren, um reife mRNA zu bilden. Die Erkennung von Konsenssequenzen an Exon-Intron-Übergängen, die als 5′-Spleißstelle und 3′-Spleißstelle bezeichnet werden, durch Komponenten der Spleißmaschinerie leitet den Spleißprozess ein. Das U1 Small Nuclear Ribonucleoprotein (snRNP) erkennt die 5′-Spleißstelle durch Basenpaarung der U1-snRNA zur prä-mRNA1. Genetisch vererbte Mutationen, die 5′-Spleißstellensequenzen verändern, sind mit vielen Krankheiten assoziiert2,3. Es wird vorhergesagt, dass der Verlust des Basepairings von U1-snRNA mit den mutierten 5'-Spleißstellen ein aberrantes Spleißen verursacht, das die Translation des betroffenen Transkripts beeinträchtigen kann. Ein potenzieller therapeutischer Ansatz zur Korrektur der Spleißdefekte beinhaltet die Unterdrückung von Mutationen durch modifizierte U1-snRNA, die kompensatorische Nukleotidänderungen in ihrer 5'-Region trägt, die mit der 5'-Spleißstelle übereinstimmt. Solche modifizierten U1-snRNAs, auch als exonspezifische U1-snRNAs bezeichnet, haben sich als wirksam bei der Umkehrung von Spleißdefekten erwiesen, was zu einer erhöhten Proteinexpression aus der geretteten mRNA4,5,6,7,8 führt.
Hier beschreiben wir den U1 snRNP-Komplementierungsassay, einen reporterbasierten zellulären Spleißassay, der die Beurteilung der Wirkung von 5′-ss-Mutationen auf das Spleißen eines Exons ermöglicht und auch für die Entwicklung modifizierter U1-snRNAs verwendet werden kann, um die Rettung des Exon-Einschlusses zu ermöglichen. Wir bieten auch Protokolle zur Überwachung der gespleißten Reportertranskripte durch Primer-Erweiterung und RT-PCR und zur Bestimmung der Expression von modifizierten U1-snRNAs durch Primer-Erweiterung und RT-qPCR.

<table><tbody><tr><td>Deionisiertes Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-751628</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Pulverpackung</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS), Australische Quelle, hitzeinaktiviertes</td><td>Omega</td><td>Scientific FB-22</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, Standardlösung 1,0N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567-16A</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure, zertifiziert ACS Plus, 36,5 bis 38,0 %</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-PES-Flaschenaufsatzfilter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FB12566510</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz Dihydrat</td><td>Amresco</td><td>0105-2,5KG</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsin (10x), kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Bioreagenz</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Bioreagenz</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Dinatrium Hydrogen-Phosphat-Heptahydrat</td><td>Fisher Bioreagenz</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Fisher Bioreagenz</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsmedium - Opti-MEM&trade; I Reduziertes Serummedium, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsreagenz - Lipofectamine&trade; 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (ca. 0,75 % Ethanol als Konservierungsmittel/Molekularbiologie)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, absolut (200 proof), Molekularbiologie Qualität, Fisher BioReagenzien</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, Molekularbiologie Qualität, Fisher BioReagenzien</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2618-212</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen (5 mg/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Zol RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Blei, 1 mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG035C001MC</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Größenausschluss Beands - Sephadex&reg; G-25</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2580-10G</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Säulen mit Größenausschluss</td><td>USA Scientific</td><td>1415-0600</td><td></td></tr><tr><td>pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>New England Biolabs</td><td>N3032S</td><td></td></tr><tr><td>Marker mit niedrigem Molekulargewicht, 10-100 nt</td><td>Affymetrix</td><td>76410 100 UL</td><td></td></tr><tr><td>Rnase inaktivierende Reagenzien - RNaseZAP&trade;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 mM pro Stück)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT&etrade; Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Transkriptase - M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28025013</td><td>zur Primerverlängerung</td></tr><tr><td>verwendet Taq-DNA-Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>Random Hexamers (50 &; Mikro; M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Mix - SYBR&trade; Wählen Sie den Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&trade; III Reverse Transkriptase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td>zur cDNA-Herstellung</td></tr><tr><td>verwendet Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>5X Erststrangpuffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>Formamid (&ge; 99,5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td>Testbericht Sicherheitsdatenblätter</td></tr><tr><td>Bromphenolblaues Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-5G</td><td></td></tr><tr><td>Xylol Cyanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2650-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base (weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Molekularbiologie)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure (kristallin/ Elektrophorese)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid: Bis-Acrylamid 19:1 (40% Lösung/Elektrophorese)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP1406-1</td><td>Test Sicherheitsdatenblätter</td></tr><tr><td>Harnstoff (farblose bis weiße Kristalle oder kristallines Pulver/Mol Biol.)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumperoxodissulfat (APS) &ge; 98%, Pro-Pure, Proteomics-Qualität</td><td>VWR</td><td>M133-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) &ge; 99%, Ultrapure</td><td>VWR</td><td>0761-25ML</td><td>Review Sicherheitsdatenblätter</td></tr><tr><td>Einstellbare Plattengelsysteme, Expedeon</td><td>VWR</td><td>ASG-400</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel Wrap & Trade; Glasplatten-Sets, 16,5 x 14,5 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-125NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertikal Gel Wrap&Trade; Glasplatten-Sets, 16,5 x 22,0 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-200NR</td><td></td></tr><tr><td>Vertikal Gel Wrap&Handel; Glasplatten-Sets, 16,5 x 38,7 cm</td><td>VWR</td><td>NGP-400NR</td><td></td></tr><tr><td>GE Speicher Phosphor Siebe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE28-9564</td><td></td></tr><tr><td>Taifun & trade; FLA 7000 Biomolekularer Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9610-73 AB</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter LS6500 Flüssigszintillationszähler</td><td>GMI</td><td>8043-30-1194</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch-Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Echtzeit-PCR-Systeme</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein reporterbasierter zellulärer assay zur Überwachung der spleißeffizienz

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

Während der Genexpression beinhaltet der entscheidende Schritt des Pre-mRNA-Spleißens die genaue Erkennung von Spleißstellen und die effiziente Montage von spleißosomalen Komplexen, um Exons zu verbinden und Introns vor dem zytoplasmatischen Export der reifen mRNA zu entfernen. Die Spleißeffizienz kann durch das Vorhandensein von Mutationen an Spleißstellen, den Einfluss transaktiver Spleißfaktoren oder die Aktivität von Therapeutika verändert werden. Hier beschreiben wir das Protokoll für einen zellulären Assay, der zur Überwachung der Spleißeffizienz eines bestimmten Exons angewendet werden kann. Der Assay verwendet einen anpassungsfähigen Plasmid-kodierten 3-Exon/2-Intron-Minigen-Reporter, der in Säugetierzellen durch transiente Transfektion exprimiert werden kann. Nach der Transfektion wird die gesamte zelluläre RNA isoliert, und die Effizienz des Exon-Spleißens in der Reporter-mRNA wird entweder durch Primer-Extension oder semi-quantitative Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) bestimmt. Wir beschreiben, wie die Auswirkungen von krankheitsassoziierten 5'-Spleißstellenmutationen bestimmt werden können, indem sie in den Reporter eingeführt werden; und wie die Unterdrückung dieser Mutationen durch Co-Transfektion mit einem U1-Konstrukt für kleine kernare RNA (snRNA) erreicht werden kann, das kompensatorische Mutationen in seiner 5'-Region trägt, die mit den 5'-Spleißstellen an Exon-Intron-Verbindungen in prä-mRNAs übereinstimmt. Somit kann der Reporter für das Design therapeutischer U1-Partikel verwendet werden, um die Erkennung von mutierten 5'-Spleißstellen zu verbessern. Das Einfügen von cis-wirkenden regulatorischen Stellen, wie Spleißverstärker- oder Schalldämpfersequenzen, in den Reporter kann auch verwendet werden, um die Rolle von U1 snRNP in der Regulierung zu untersuchen, die durch einen bestimmten alternativen Spleißfaktor vermittelt wird. Schließlich können Reporter-exprimierende Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert werden, um die Wirkung potenzieller Therapeutika auf konstitutives prä-mRNA-Spleißen oder auf Exons mit mutierten 5'-Spleißstellen zu bestimmen. Insgesamt kann der Reporter-Assay angewendet werden, um die Spleißeffizienz unter einer Vielzahl von Bedingungen zu überwachen, um grundlegende Spleißmechanismen und Spleiß-assoziierte Krankheiten zu untersuchen.

Der Spleißreporter Dup51, ein Drei-Exon-Zwei-Intron-Minigen, wurde aus dem menschlichen β-Globin-Gen abgeleitet und zuvor beschrieben (Abbildung 1A)11,12 . Wir schufen einen mutierten Reporter, Dup51p, durch die Einführung von Usher-Syndrom-assoziierten 5'-Spleißstellenmutationen, die im Exon 3 des Protocadherin 15 (PCDH15) Gens13 auftreten. Die 5'-Spleißstellensequenz an der Exon-2-Intron-2-Verbindun...

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Dieses Protokoll beschreibt einen zellulären Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz unter Verwendung eines anpassungsfähigen Management-Reporters. Dieser Reporter-Assay kann verwendet werden, um die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Mutationen in den Exxon- oder Spleißstellen zu untersuchen und eine Therapie, insbesondere ein Partikel, zu entwickeln, um die Erkennung von mutierten bis fünf Punkt-Spleißstellen zu verbessern. Die Passage in Hela-Zellen saugt das verbrauchte Medium ab und inkubiert die Zellen mit drei Millilitern von 0,2 5% Auslösungen in einem Millimolaren EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.Nach der Inkubation an sieben Milliliter frischem DMEM wird die Zellsuspension in ein 10-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellen. Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter frischem DMEM und platten Sie die Zellen auf einer neuen Gewebekulturschale bei 20% Konfluenz für vorübergehende Transsfektionen.Zählen Sie die Hela-Zellen mit einem sauberen Hämozytometer-Objektträger und bereiten Sie eine Suspension mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis zur fünften Zelle pro Milliliter vor, säen Sie einen Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag saugen Sie das verbrauchte Medium ab und geben Sie 800 Mikroliter frisches DMEM mit Serum auf die Platte. Bereiten Sie die Transfektionsmischungen vor und wirbeln Sie sie für 15 Sekunden.Dann zentrifugieren Sie die Mischungen und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach der Inkubation alle 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in eine Vertiefung der 12 Well Hela Zellplatte geben, um ein Endvolumen von einem Milliliter pro Vertiefung zu erreichen, und die Platte bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden inkubieren. Die vorbereiteten Markierungsreaktionen sind inkubierend.Resuspend die 25 Kilo Dalton Molekulargewicht Cutoff Size Ausschlussperlen durch sanftes Wirbeln für 10 Sekunden. Als nächstes werden 600 Mikroliter der resuspendierten Perlen in eine Einweg-Minisäule gegeben, in ein 1,5-Milliliter-Auffangrohr gelegt und der Perlenbestand auf vier Grad Celsius zurückgeführt. Zentrifugieren Sie die Säule und verwerfen Sie den Durchfluss durch sie hindurch.Dann waschen Sie die Perlen zweimal, indem Sie 300 Mikroliter RNA-freies Wasser in die Säule geben. Nach der zweiten Wäsche die Minisäule in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und die Kinase-Reaktionsmischung in die Säule geben. Zentrifugieren Sie die Säule und sammeln Sie den Durchfluss, der die P32-markierten Oligonukleotide enthält.Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den Helizellen extrahiert wurde, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 6,55 Mikroliter zu erhöhen. Als nächstes fügen Sie 0,9 Mikroliter hinzu, einen Master-Mix zu jedem PCR-Röhrchen, das die RNA-Proben enthält, und inkubieren Sie die Röhrchen zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und dann eine Minute auf Eis. Als nächstes bei 2,55 Mikrolitern, einem Master-Mix zwei, zu jedem Röhrchen, das die RNA enthält, und Master-Mix eins, und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten.Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einen Thermocycler gegeben und zuerst bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und dann bei 70 Grad Celsius für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden jeder Probe 10 Mikroliter 2X Formamid-RNA-Beladungsfarbstoff hinzugefügt und die Fragmente nach UIA-Seite getrennt. Percy DNA-Synthese.Fügen Sie zwei Mikrogramm RNA, die aus den transezierten Hela-Zellen extrahiert wurden, in 200 Mikroliter Mikrozentrifugenröhrchen hinzu und fügen Sie RNAs freies Wasser hinzu, um das Volumen auf niedrige 11 Mikroliter aufzufüllen. Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter hinzu, mischen Sie einen zu jeder Probe und inkubieren Sie zuerst bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten, dann auf Eis für eine Minute. Als nächstes fügen Sie sieben Mikroliter hinzu, mischen Sie zwei zu jeder Tube und inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten und 70 Grad Celsius für 15 Minuten.Als nächstes verdünnen Sie für die PCR die C-DNA-Reaktion, um eine Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter zu erhalten, und übertragen Sie einen Mikroliter jeder CDNA-Probe auf neue PCR-Röhrchen. Fügen Sie 10,5 Mikroliter der Mastermischung zu jedem Röhrchen hinzu, das CDNA enthält, und führen Sie die PCR durch. Verwendung eines Thermocyclers Nach Abschluss der PCR.Fügen Sie jedem Röhrchen 12,5 Mikroliter 2X Formamid-DNA-Beladungsfarbstoff hinzu. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius und führen Sie eine UIA-Seite durch. Pipettieren Sie fünf Mikroliter verdünnter CDNA in einzelne Vertiefungen einer 96-Well qpcr-Platte dreifach.Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Echtzeit-PCR-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, versiegeln Sie die Platten mit einem optischen Film und zentrifugieren Sie, um die Reaktionen am Boden der Wells zu sammeln, und führen Sie dann die qpcr durch, während Sie die Schwellenwert-Quantifizierungszykluswerte des Zielamplikons sammeln. Bevor Sie die Marker und Proben laden, spülen Sie die Bohrlöcher mit FSME-Puffer aus, um den abgesetzten Harnstoff zu entfernen. Laden Sie dann 10 Mikroliter jeder Probe pro Vertiefung und lassen Sie das Gel zwei bis drei Stunden lang mit 300 bis 500 Volt laufen, oder bis das Xylol den Boden erreicht.Nach der Elektrophorese die Glasplatten aus dem Elektrophoreseapparat entfernen und die beiden Platten vorsichtig trennen, so dass das Gel flach auf beiden Glasoberflächen liegt, dann das Gel auf ein Filterpapier übertragen und mit einer Plastikfolie abdecken, wobei das Gel mit einem Geltrockner 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius vakuumgetrocknet wird. Legen Sie dann das getrocknete Gel in eine Phosphor-Bildgebungskassette für die Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Wenn er in Hela-Zellen exprimiert wird, drückt der Schneidereporter dup 51 minnijean das reife Transkript in voller Länge aus, in dem Exxon two effizient gespleißt wird. Die fünf Prime-Spleißstellenmutationen und dup 51 P reduzieren die Exxon-Zwei-Einschließung von 95 auf 30%, was zur Bildung eines kürzeren Transkripts führt.Die Co-Expression von dup 51 P mit U15A SNRNA rettet Exxon zwei Spleißungen und stellt die Bildung des Transkripts in voller Länge wieder her. Im Gegensatz dazu hat die Co-Expression mit wilden U1- oder U15G-Varianten nicht den gleichen Effekt auf das dup 51P-Spleißen. Der Nachweis von U15A-Variantentranskripten verwendet primär das U1-Sieben- bis 26-Oligon-Nukleotid, das 20 Nukleotide lang ist, und Basenpaare in der Nähe des Adenins an der fünften Position der U1-SNRNA.In Gegenwart von DATP allein ermöglicht U1 sieben bis 26 die Integration von zwei bis drei Nukleotiden für die endogene Wildtyp-U1-SNRNA, was zu einem 22 oder 23 Nukleotid langen Produkt führt. Für U15A- und U15G-Varianten endet die Erweiterung nach Zugabe eines einzelnen Adenosins, das ein 21-Nukleotidprodukt erzeugt. Nach Der Normalisierung auf U2-SNRNA-Expression wurden transfizierte U1-Wildtyp-Varianten U1 5g und U15A drei- bis fünffach über der endogenen SNRNA exprimiert.Die Qualität der extrahierten RNA ist entscheidend für die Spleißanalyse. Daher wird die Verwendung von RNA-freiem Wasser und die Dekontamination von Diensten mit RNAs-Inaktivierungsmitteln dringend empfohlen. Das hier beschriebene Berichtssystem kann angewendet werden, um die Rolle von U1 SN-RNAs bei Spleißvorschriften für die Umkehrung der Wirkung von Flash-Preis-Spleißmutationen für das Gen-Silencing unter Verwendung modifizierter U1SN-RNAs zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Protokoll für die Vorbereitung der robuste, kleine HeLa Kernextrakten beschrieben wird. Dieses Protokoll ist wertvoll für Tests, die Verwendung von kleinen Populationen von Zellen, wie Zellen mit Medikamenten oder RNAi behandelt erfordern. Verfahren sollte für eine Vielzahl von Genexpressions und anderen Zelltypen, einschließlich Zellen des Patienten.

Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Tandem-Spleißereignisse treten an Stellen auf, die weniger als 12 Nukleotide voneinander entfernt sind. Die Quantifizierung der Verhältnisse solcher Spleißvarianten ist mit einem absolut quantitativen PCR-Ansatz möglich. Dieses Manuskript beschreibt, wie Spleißvarianten des Gens STAT3 quantifiziert werden können, bei denen zwei Spleißereignisse zu Serin-701-Einschluss/-Ausschluss und α/β C-Termini führen.

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

SINEUPs sind synthetische antisense nicht-kodierende RNAs, die enthalten eine Bindung (BD) und ein Effektor-Domäne (ED) und Übersetzung bis zu regulieren Ziel mRNA. Hier beschreiben wir Nachweismethoden für SINEUPs in kultivierten Zelllinien, Analyse ihrer Tätigkeit zur Förderung der Übersetzung von Western-Blot und eine halbautomatische Hochdurchsatz imaging-System.

Zellbasierte Assays der SINEUP nicht-kodierende RNAs, die speziell mRNA Übersetzung verbessern können

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

Der ACT1-CUP1-Assay, ein Kupferwachstumsassay, ermöglicht eine schnelle Ablesung des Precursor-Messenger-RNA-Spleißens (pre-mRNA) und des Einflusses mutierter Spleißfaktoren auf die spleißöosomale Funktion. Diese Studie bietet ein Protokoll und hebt die Anpassungsmöglichkeiten hervor, um die interessierende Spleißfrage zu beantworten.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Wir präsentieren Protokolle zur Bewertung der Kompetenz des Doppelstrangbruch-Reparaturwegs in Zellen unter Verwendung einer Reihe von lumineszenzbasierten extrachromosomalen Reportersubstraten.

Bewertung der Reparaturaktivität von DNA-Doppelstrangbrüchen mit Hilfe von Hochdurchsatz- und quantitativen Lumineszenz-basierten Reporter-Assays

Erfahren Sie, wie ein zellulärer Reporter-Assay die Spleißeffizienz in HeLa-Zellen überwacht und Mutationseffekte analysiert. Diese Methode ermöglicht die Entwicklung therapeutischer U1-snRNA-Strategien.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

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