Name: Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 22 s
Description: Lernen Sie die Lipid-Monolayer-Methode zur Probenvorbereitung für elektronenkristallographische Untersuchungen. Diese Technik ermöglicht die zweidimensionale Kristallisation von peripheren und löslichen Proteinen für strukturbiologische Studien.

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Die Vorbereitung dieses Manuskripts wurde teilweise vom US Army Research Office (W911NF2010321) und den Startfonds der Arizona State University für P.-L.C unterstützt.

1. Teflonblock-Zubereitung
<ol><li>Bereiten Sie den Teflonblock aus chemikalienbeständigem PTFE-Harz (Polytetrafluorethylen) vor. Machen Sie Löcher auf dem Block mit einem allgemeinen Bohrer, gefolgt von den in Abbildung 1beschrifteten Abmessungen.</li>
</ol>2. Monolayer-Lipidpräparation
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 30- 45 Minuten
<ol><li>Lipid-Stoffaufbereitung<ol>
<li>Ein 0,01 mg/ml Lipidgemisch in 9:1 (v/v) Chloroform/Methanol wird unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform, 0,99 ml Methanol und 0,01 ml 10 mg/ml Lipiden vorbereitet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Teflonplattenzubereitung<ol>
<li>Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für 5 Minuten.</li>
		<li>15 Minuten mit heißem Wasser waschen.</li>
		<li>Mit destilliertem Wasser abspülen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Teflonplatte 30 Minuten lang in einem Trockener und halten Sie sie bei Nichtgebrauch unter Vakuum (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bildung von Lipidmonoschichten auf Pufferreservoir
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden
<ol><li>Bereiten Sie am Tag des Experiments eine Lipidmischung von 0,01 mg/ ml in einer 9:1-Mischung aus Chloroform/Methanol frisch vor.</li>
	<li>Legen Sie ein Typ-1-Filterpapier in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an.</li>
	<li>Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 μL des Puffers.</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig lipidische Mischung Tropfen für Tropfen (idealerweise 1 μL pro Tropfen) mit einer Hamilton-Spritze auf die Pufferoberfläche hinzu.</li>
	<li>Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser, um die Feuchtigkeit in der Petrischale zu halten.</li>
	<li>60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht Lipid auf der Oberfläche des Puffers sollte gebildet werden.</li>
</ol>4. Aufbringung eines EM-Gitters auf einer Lipid-Monoschicht
HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 1,5 Stunden
<ol><li>Legen Sie vorsichtig ein löchriges, kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, Kohlenstoffseite nach unten, auf die Oberseite jedes Pufferreservoirs.</li>
	<li>Injizieren Sie Proteine vorsichtig in die seitliche Injektionsbrunnen. Verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um 1 μM Protein als Ausgangspunkt. Optimieren Sie die Proteinkonzentration vor dem Experiment.</li>
	<li>60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Vorsichtig ca. 20-30 μL Puffer in den seitlichen Injektionsanschluss injizieren. Dadurch wird das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks erhöht.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gitter sofort mit einer Pinzette auf und heben Sie es vertikal vom Tröpfchen ab.</li>
	<li>Vorbereitung von Monolayer-Proben für negative Färbung oder Kryo-TEM-Bildgebung (Abbildung 2). Wenn die Proteine ein 2D-Array bilden, zeigt das Bildleistungsspektrum oder Das Fourier-Periodogramm Beugungsdichten bei den räumlichen Frequenzen basierend auf der Kristallsymmetrie. Wenn im Leistungsspektrum keine Beugungsflecken gezeigt werden, ist es unwahrscheinlich, dass die Proteine einen 2D-Kristall bilden.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Abdeckung der Lipidmonoschicht auf dem EM-Gitter mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM). Ein tiefer vergrößertes Elektronenbild ist hilfreich, um die Morphologie der bedeckten Monoschicht zu identifizieren. Normalerweise ist der Bildkontrast des mit einer Einschicht bedeckten Bereichs etwas geringer als der der unbedeckten Bereiche. Darüber hinaus hilft das berechnete 2D-Bildleistungsspektrum, den Standort des 2D-Kristallins zu identifizieren.</li>
</ol>

<ol><li>Raunser, S., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+crystallography+as+a+technique+to+study+the+structure+on+membrane+proteins+in+a+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment.</a> Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).</li>
<li>Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+beta-sheets+and+side-chain+clusters+in+two-dimensional+periodic+arrays+of+streptavidin+on+phospholipid+monolayers+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography.</a> Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).</li>
<li>Braun, T., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Encyclopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electron crystallography.</a> Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).</li>
<li>Wang, H. -W., Wang, J. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-electron+microscopy+and+X-ray+crystallography+complement+each+other%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22Transmission+electron+microscopy%22">Transmission electron microscopy</a>. , Springer. New York, NY. (2016).</li>
<li>Abeyrathne, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.15+Analysis+of+2-D+Crystals+of+Membrane+Proteins+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Biophysics%22%5BJournal%5D)">1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy.</a> Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).</li>
<li>Muller, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lipid-Protein+Interactions+and+Lipid-Mediated+Modulation+of+Membrane+Protein+Function+through+Molecular+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation.</a> Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).</li>
<li>Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+Interactions+between+Aquaporins+and+Membrane+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 1322(2016).</li>
<li>Hite, R. K., Chiu, P. -L., Schuller, J. M., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+lipid+head+groups+on+double-layered+two-dimensional+crystals+formed+by+aquaporin-0%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0.</a> PloS One. 10 (1), 0117371(2015).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determinants+of+water+permeation+through+aquaporin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural determinants of water permeation through aquaporin-1.</a> Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).</li>
<li>Schenk, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+4.5+A+structure+of+human+AQP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The 4.5 A structure of human AQP2.</a> Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).</li>
<li>Gonen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-protein+interactions+in+double-layered+two-dimensional+AQP0+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals.</a> Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).</li>
<li>Hiroaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+aquaporin-4+structure+on+array+formation+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).</li>
<li>Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-0+membrane+junctions+reveal+the+structure+of+a+closed+water+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore.</a> Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).</li>
<li>Chiu, P. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+prokaryotic+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1+at+16+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution.</a> Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+structural+changes+in+the+cyclic+nucleotide-modulated+potassium+channel+MloK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1.</a> Nature Communications. 5, 3106(2014).</li>
<li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).</li>
<li>Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+and+sparse+matrix+screening+for+growing+two-dimensional+crystals+for+electron+crystallography%3A+methods+and+examples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).</li>
<li>Pal, S. Chapter 6 - Structure analysis and visualization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPal%2C+S+%22Fundamentals+of+Molecular+Structural+Biology%22">Fundamentals of Molecular Structural Biology</a>. , 119-147 (2020).</li>
<li>Frey, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+protein+crystallization+via+metal-ion+coordination+by+naturally+occurring+surface+histidines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).</li>
<li>Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+histidine-tagged%2C+HIV-1+reverse+transcriptase+promoted+by+a+novel+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid.</a> Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).</li>
<li>Vénien-Bryan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+response+regulator+HupR+from+Rhodobacter+capsulatus.+Electron+microscopy+of+two-dimensional+crystals+on+a+nickel-chelating+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid.</a> Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).</li>
<li>Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L'Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+cholera+toxin+B-pentamer+bound+to+receptor+GM1+pentasaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).</li>
<li>Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+9+A+two-dimensional+projected+structure+of+cholera+toxin+B-subunit-GM1+complexes+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography.</a> Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).</li>
<li>Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitaxial+growth+of+protein+crystals+on+lipid+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers.</a> Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).</li>
<li>Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+structure+of+membrane-bound+annexin+V+at+8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution.</a> Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).</li>
<li>Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cholera+toxin+penetrating+a+lipid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane.</a> Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).</li>
<li>Celia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+model+of+Escherichia+coli+gyrase+B+subunit+crystallized+in+two-dimensions+on+novobiocin-linked+phospholipid+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films.</a> Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).</li>
<li>Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+holoenzyme+determined+by+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography.</a> Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).</li>
<li>Schultz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+the+yeast+RNA+polymerase+A.+Electron+microscopy+of+lipid-bound+molecules+and+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).</li>
<li>Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystals+of+carboxysome+shell+proteins+recapitulate+the+hexagonal+packing+of+three-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+a+publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals.</a> Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).</li>
<li>Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+HIV-1+capsid+proteins+on+a+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+BIOLOGICAL+CHemistry%22%5BJournal%5D)">Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer.</a> The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).</li>
<li>Barklis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+membrane-bound+retrovirus+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins.</a> The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).</li>
<li>Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+purification%3A+a+rapid+method+for+isolating+protein+complexes+for+single-particle+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).</li>
<li>Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).</li>
<li>Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+prospective+applications+of+metal+ion-protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Current and prospective applications of metal ion-protein binding.</a> Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).</li>
<li>Dietrich, J., nien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDietrich%2C+J+%22Strategies+for+Two-dimensional+Crystallization+of+Proteins+Using+Lipid+Monolayers%22">Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers</a>. , Imperial College Press. (2005).</li>
<li>Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Crystallization+Procedure%2C+from+Protein+Expression+to+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation.</a> BioMed Research International. 2015, 693869(2015).</li>
<li>De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+large+and+highly+ordered+2D+crystals+of+a+K%2B+channel%2C+structural+role+of+lipidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment.</a> Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).</li>
<li>Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+by+dialysis+for+structural+studies+of+membrane+proteins+by+the+cryo-EM+method+electron+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography.</a> Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).</li>
<li>Rémigy, H. -W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+reconstitution+and+crystallization+by+controlled+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution.</a> FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).</li>
<li>Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Crystallization+of+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedic+Reference+of+Genomics+and+Proteomics+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins.</a> Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).</li>
<li>Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Lebeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+crystallization+of+a+membrane+protein+on+a+detergent-resistant+lipid+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer.</a> Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Eine Lipidmonoschicht ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Wachstum großer 2D-Kristalle für Strukturstudien biologischer Makromoleküle erleichtert. Um eine intakte Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche erfolgreich vorzubereiten, wird dringend empfohlen, die Lipide am Tag des Experiments frisch aufzubereiten, da eine Oxidation der Lipid-Acylkette zu einer Packungsstörung in der Monoschicht führen und die resultierende Kristallbildung beeinträchtigen könnte. Gekaufte Lipide in Pulverform sollten mit einer M...

Elektronenbeugung durch 2D-Kristalle oder spiralförmige Arrays von Proteinen können in günstigen Fällen Sub-Nanometer-Auflösungen erreichen1,2,3. Von besonderem Interesse sind rekonstituierte 2D-Membranproteinarrays oder Kristalle in ihren nahezu nativen Umgebungen1. Da ein Kristall als Signalverstärker fungiert, der die Dichte der strukturellen Faktoren bei bestimmten räumlichen Frequenzen erhöht, ermöglicht die Elektronenkristallographie die Sondierung eines Ziels mit einer kleineren Größe bei hohen Auflösungen, z. B. kleinen Molekülen, als bei Einzelpartikel-Kryo-EM. Der Elektronenstrahl kann durch ein geordnetes 2D-Array von Proteinen gebeugt werden, wodurch ein Beugungsmuster oder ein Gitterbild erzeugt wird, je nachdem, wo die Bildebene auf demDetektor aufgezeichnetwird 4 . Die gebeugten Intensitäten können dann extrahiert und verarbeitet werden, um eine 2D-Projektionsstruktur des Kristalls zu rekonstruieren. Elektronen haben einen größeren Streuquerschnitt als Röntgenstrahlen und ihre Streuung folgt größtenteils dem Rutherford-Modell, das auf der Coulomb-Wechselwirkung zwischen den Elektronen und den geladenen Atomen imMolekül basiert 5. Die Dicken von 2D-Membrankristallen betragen in der Regel weniger als 100 nm, geeignet für die Elektronenübertragung ohne dynamische Streuung innerhalb der Probe6. Elektronenkristallographische Studien haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um hochauflösende Strukturinformationen von Membranproteinen und Lipid-Protein-Interaktionen zu untersuchen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
Eine Lipidmonoschicht ist eine einzelne Lipidschicht, die aus Phospholipiden besteht, die dicht an einer Luft-Wasser-Grenzfläche6gepackt sind und die 2D-Array-Bildung für lösliche Proteine oder periphere Membranproteine unterstützen können18. Abhängig von der Dichte der Lipide und ihrem lateralen Druck können die Lipidmoleküle ein geordnetes 2D-Array an der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, wobei ihre acylketten auf die Luft ausgedehnt sind und hydrophile Kopfgruppen in der wässrigen Lösung1,6,19freigelegt werden . Die Lipidkopfgruppe kann über elektrostatische Interaktion mit Proteinen interagieren oder modifiziert werden, um ein Affinitäts-Tag bereitzustellen, um eine bestimmte Proteindomäne zu binden. Zum Beispiel wird das DOGS-NTA-Ni (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2-Ni2+ ) häufig bei der Bildung einer Lipidmonoschicht verwendet, um die Proteine mit einem Poly-Histidin-Tag20,21,22zu binden . Auch das Choleratoxin B kann ein bestimmtes Pentasaccharid von Gangliosid GM1 in einer Lipidmonoschicht für Strukturstudienbinden 23,24. Durch die Verankerung der Proteine auf den Lipidkopfgruppen kann die Lipidmonoschicht die Bildung der dünnen 2D-Arrays für hochauflösende elektronenkristallographische Studien unterstützen. Die Lipid-Monolayer-Technik wurde in der Elektronenkristallographie für Strukturstudien von Proteinen wie Streptavidin2,25, Annexin V26, Choleratoxin27, E. coli gyrase B Untereinheit28, E. coli RNA Polymerase25,29,30, Carboxysomenschalenproteine31 und die Kapsidproteine des HIV-132 und Moloney murinen Leukämievirus verwendet 33. Aufgrund der Stabilität und chemischen Eigenschaften der Lipidmonoschicht wurden verschiedene Anwendungen für die Probenvorbereitung für die Kryo-EM-Bildgebung untersucht34. Für die Bildung von Protein-Arrays ist jedoch eine Optimierung erforderlich.
Hier geben wir ausführliche Details zur allgemeinen Herstellung von Lipidmonoschichten für die Kryo-EM-Bildgebung und einige Überlegungen, die die Qualität der gebildeten Monoschichten beeinflussen könnten.

<table><tbody><tr><td>14:0 PC (DMPC)</td><td>Avanti Lipids</td><td>850345</td><td>1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL</td></tr><tr><td>Bulb für kleine Pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator-Vakuum</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td></td></tr><tr><td>EM Gitter</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>CF413-50</td><td>CF-1.2/1.3-4C 1.2 &micro; m Loch, 1,3 &Mikro; m space</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1001-090</td><td>Durchmesser 90 mm</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (25 & Mikro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>80465</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (250 &Mikro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (5 & Mikro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (500 &Mikro; L)</td><td>Hamilton Company</td><td>203080</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1775-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm &fach 15 mm</td></tr><tr><td>Teflonblock</td><td>Grainger</td><td>55UK05</td><td>60 & micro; L Vertiefungen mit seitlichen Injektionsöffnungen, manuell hergestellt</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>78325</td><td>Verschiedene Ausführungen</td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>VWR</td><td>97043-996</td><td></td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung mit einer lipid-monolayer-methode für elektronenkristallographische untersuchungen

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Die Elektronenkristallographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur hochauflösenden Strukturbestimmung. Makromoleküle wie lösliche oder Membranproteine können unter günstigen Bedingungen zu hochgeordneten zweidimensionalen (2D) Kristallen gezüchtet werden. Die Qualität der gezüchteten 2D-Kristalle ist entscheidend für die Auflösung der finalen Rekonstruktion mittels 2D-Bildverarbeitung. Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als unterstützende Schicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation integraler Membranproteine angewendet werden, erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen, um Waschmittel- und Dialysebedingungen zu bestimmen, um die Aufteilung auf die Monoschicht zu fördern. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipidmonoschicht, so dass die polaren Lipidkopfgruppen in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben und die unpolaren Acylketten, Schwänze sich in die Luft aufteilen, die Oberflächenspannung brechen und die Wasseroberfläche abflachen. Die geladene Natur oder die charakteristischen chemischen Bestandteile der Kopfgruppen bieten eine Affinität für Proteine in Lösung und fördern die Bindung für die Bildung von 2D-Arrays. Eine neu gebildete Monoschicht mit dem 2D-Array kann leicht in ein Elektronenmikroskop (EM) auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter übertragen werden, das zum Heben und Unterstützen des kristallinen Arrays verwendet wird. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Bildgebung.

Eine auf dem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ohne Färbung visualisiert werden. Die Monoschichtpräsenz ist an der Kontrastdifferenz zur Fläche ohne Probe im Strahlengang zu erkennen. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren lokalen Kontrast als solche ohne Abdeckung, da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist und eine hellere Beleuchtung zeigt (Abbildung 3).
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Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als Stützschicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation angewendet werden, wie einige integrale Membranproteine. Erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen zur Bestimmung der Waschmittel- und Dialysebedingungen, um die Partitionierung in die Lipidmonoschicht zu fördern.An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipid-Monoschicht, so dass die polaren Kopfgruppen des Lipids in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben. Und die unpolaren Acylschwänze der Lipidverteilung zur Luft-Wasser-Grenzfläche, die die Oberflächenspannung bricht und die Wasseroberfläche abflacht. Die Ladungsnatur die charakteristischen chemischen Anteile der Lipidkopfgruppen liefern die Affinität für Proteine in Lösung.Förderung der Bindung und im Prinzip der 2D-Array-Bildung. Alle 2D-Kristalle, die auf einer Lipidmonoschicht gebildet werden, können leicht in das Elektronenmikroskop auf einem kohlenstoffbeschichteten EM-Gitter übertragen werden, das zum Anheben und Unterstützen des kristallinen Arrays auf der Lipidschicht verwendet wird. Wir haben in diesem Manuskript eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene Elektronenmikroskopie-Bildgebung beschrieben.Lipid-Monolayer-Vorbereitung. Lipidstockzubereitung, herstellung einer Lipidmischung von 0,01 mg pro ml in 9:1 Volumen zu Volumen Chloroform, Methanol. Unter Verwendung von 8,91 ml Chloroform und 0,99 ml Methanol und 0,1 ml einer Lipidlösung von 10 mg pro ml.Zubereitung von Teflonplatten. Beschallen Sie eine Teflonplatte in einem Methanolbad für fünf Minuten. Mit heißem Wasser für 15 Minuten waschen und dann mit destilliertem Wasser abspülen.Trocknen Sie die Teflonplatte in einer getrockneten 30 Minuten und bewahren Sie sie bis zum Gebrauch unter Vakuum auf. Bildung von Lipid-Monoschicht auf Pufferreservoir. Die geschätzte Betriebszeit beträgt eineinhalb Stunden.Legen Sie ein Filterpapier vom Typ eins in eine Petrischale und ordnen Sie den Teflonblock auf dem Filterpapier an. Füllen Sie die Vertiefungen der Teflonplatte mit 60 Mikrolitern Puffer. Fügen Sie vorsichtig flüssigkeitsmischung auf die Pufferoberfläche Tropfen für Tropfen hinzu.Idealerweise ein Mikroliter pro Tropfen mit einer Hamilton-Spritze. Befeuchten Sie das Filterpapier mit destilliertem Wasser und halten Sie die Feuchtigkeit in der Petrischale. Bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubieren, das Chloroform sollte verdampfen und eine Monoschicht aus Lipid auf der Oberfläche der Puffer gebildet werden.Auftragen eines EM-Gitters auf eine Lipid-Monoschicht. Geschätzte Betriebszeit eineinhalb Stunden. Platzieren Sie vorsichtig ein kohlenstoffbeschichtetes EM-Gitter ohne Glühen, das Kohlenstoff von der Seite nach unten auf die Oberfläche jedes Pufferbehälters ableitet.Injizieren Sie vorsichtig Proteine in den seitlichen Injektionsbrunnen, verwenden Sie die endgültigen Proteinkonzentrationen in der Vertiefung um ein Mikromolar. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Injizieren Sie vorsichtig etwa 20 bis 30 Mikroliter Puffer in den Injektionsanschluss der Stelle, um das Gitter über die Oberfläche des Teflonblocks anzuheben.Auf diese Weise können Sie das Gitter mit einer Pinzette aufnehmen und vertikal vom Tropfen abheben. Repräsentative Ergebnisse. Eine auf einem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter dem Transmissionselektronenmikroskop ohne Kontrastfärbung sichtbar gemacht werden.Das Vorhandensein von Monoschichten kann an der Kontrastdifferenz zu dem Bereich ohne Probe in diesem Strahlengang erkannt werden. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren Kontrast als Bereiche ohne Abdeckung. Da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist, zeigt er eine hellere Beleuchtung.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Lipid-Monolayer-Methode aufgrund ihrer Einfachheit die Möglichkeit bietet, Proteinstrukturen zu untersuchen. Es kann einen alternativen Ansatz bieten, um den Prozess der 2D-Kristallisation zu erleichtern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

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Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

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