Name: Nachweis von Virus- und Speichelproteinen eines Zikadenvektors im pflanzlichen Wirt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Speichelproteine und virale Proteine von Zikaden in Reispflanzen nachweisen. Diese Methode nutzt SDS-PAGE und Western Blotting zur Untersuchung von Pflanze-Insekt-Interaktionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31772124 und 31972239) und der Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014) unterstützt.

Die nicht-viruliferen adulten Zikaden wurden im Vector-borne Virus Research Center der Fujian Agriculture and Forestry University, China, vermehrt.
1. Aufzucht nichtviruliferer Insekten
<ol><li>Ziehen Sie die erwachsenen Tiere auf Reissetzlingen in einem Würfelkäfig auf, der 40 cm x 35 cm x 20 cm (Länge x Breite x Höhe) groß ist. Halten Sie eine Seite des Käfigs zur Belüftung mit einem insektensicheren Netz bedeckt.<ol><li>Halten Sie die Käfige mit Zikaden in einem Inkubator mit eingebautem Feuchtigkeitsregler bei 26 °C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75 % unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie einen Sauger, um alle erwachsenen Tiere vorsichtig aus ihrem Käfig in einen neuen Käfig zu bringen, der jede Woche frische Reissetzlinge enthält.<ol><li>Lassen Sie mehr als 200 Erwachsene sich paaren und Eier in den Reis legen.</li>
		<li>Bewahren Sie die alten Reissetzlinge auf, damit die Nymphen schlüpfen können. Diese neuen nichtviruliferen Nymphen werden in das 2-Instar-Stadium gebracht.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Viruserwerb und Sammlung viruliferer Insekten
<ol><li>Übertragen Sie die nichtviruliferen Nymphen im 2-Instar vorsichtig für 1-2 h in ein Glaskulturröhrchen (2,5 cm Durchmesser und 15 cm Höhe), um sie mit dem Absauger zu verhungern.<ol><li>Lassen Sie die Nymphen in einem Käfig frei, in dem sich eine RDV-infizierte Reispflanze befindet, die in einem Topf gewachsen ist.</li>
		<li>Lassen Sie die Nymphen 2 Tage lang von der infizierten Reispflanze fressen. Anmerkungen: Gießen Sie die Reispflanze vorsichtig und vermeiden Sie es, die Nymphen wegzuwaschen. Die Nymphen im 2-Instadium sind etwa 1,6-2 mm lang.</li>
	</ol></li>
	<li>Setzen Sie diese Nymphen vorsichtig in einen neuen Käfig um, der frische virenfreie Reissämlinge mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-75% unter einer Photoperiode von 16 h hell und 8 h dunkel enthält. Lassen Sie die Nymphen 12 Tage lang von der infizierten Reispflanze ernähren, um die zirkulative Übertragungszeit von RDV abzuschließen.</li>
</ol>3. Entnahme von Speichelproteinen mit Hilfe eines Futterkäfigs
<ol><li>Bereiten Sie fünf kleine rohrartige Futterkäfige (2,5 cm Durchmesser und 4 cm Höhe) vor, in denen ein Ende mit insektensicheren Netzen bedeckt ist.</li>
	<li>Sperren Sie 15-20 Zikaden in jeden Futterkäfig und decken Sie dann das andere Ende des Käfigs mit einer dünnen Schaumstoffmatte ab.<ol><li>Befestigen Sie einen Reiskeimling (5-6 cm hoch) mit Klebebändern zwischen dem Ende des Käfigs und einer Schaumstoffmatte. Stellen Sie sicher, dass sich die Zikaden im Futterkäfig von den Reissetzlingen ernähren können, die dem Inneren des Käfigs ausgesetzt sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Tauchen Sie die Wurzeln des Sämlings in Wasser, damit die Reispflanze am Leben bleibt. Lassen Sie die Zikaden 2 Tage lang davon ernähren.</li>
	<li>Nehmen Sie die Zikaden aus ihren Futterkäfigen und sammeln Sie die Reissetzlinge, von denen sie sich ernährt haben. Schneiden Sie die Teile der Sämlinge außerhalb des Käfigs ab und stellen Sie die Fraßregionen der Sämlinge wieder her. HINWEIS: Diese Probe kann maximal 3 Monate bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort zum Nachweis verwendet wird.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Lösen Sie 15,1 g Tris-Base, 94 g Glycin und 5 g SDS in 1 l sterilem Wasser auf, um 5xTris-Glycin-Puffer herzustellen. Verdünnen Sie 200 ml 5xTris-Glycin-Puffer mit 800 ml sterilem Wasser, um 1xTris-Glycin-Puffer herzustellen (siehe Tabelle 1 für die Pufferzusammensetzung).</li>
	<li>Lösen Sie 80 g NaCl, 30 g Tris-Base und 2 g KCl in 1 l sterilem Wasser auf, um 10xTris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) herzustellen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C für 15 min.</li>
	<li>Lösen Sie 8 g SDS, 4 ml ß-Mercaptoethanol, 0,02 g Bromphenolblau und 40 ml Glycerin in 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8) auf, um 4x Proteinprobenpuffer herzustellen.</li>
	<li>Mischen Sie 800 ml Tris-Glycin-Puffer mit 200 ml Methanol, um den Transferpuffer herzustellen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 ml 10xTBS-Lösung und 3 ml Tween 20 bis 900 ml steriles Wasser hinzu, um den TBS-Puffer mit Tween 20 (TBST)-Lösung herzustellen.</li>
</ol>5. Western Blot zum Nachweis des Speichels und der viralen Proteine
<ol><li>Mahlen Sie 0,1 g der Reisproben mit flüssigem Stickstoff, bis das Gewebe zu einem Pulver wird. Geben Sie 200 μL 4x Proteinprobenpuffer in die Probe und kochen Sie sie 10 Minuten lang. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.<ol><li>Entfernen Sie den Überstand und legen Sie ihn in eine neue Durchstechflasche. Laden Sie 10 μl der Probe in ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45-60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 V laufen. Anmerkungen: Die Rückstände nach der Zentrifugation können verworfen werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Eine 0,45 μm Nitrozellulosemembran und andere Sandwichmaterialien für 30 min in den Transferpuffer geben. Anmerkungen: Dieser Schritt kann durchgeführt werden, bevor das Gel seinen Lauf beendet hat.</li>
	<li>Legen Sie das Gel ein und übertragen Sie es 90-120 Minuten lang bei 100 V in den Transferpuffer.</li>
	<li>Nehmen Sie die Membran und legen Sie sie 20 Minuten lang in eine 7%ige fettfreie Trockenmilchblockierlösung in TBST-Lösung. Den spezifischen Antikörper gegen RDV P8 oder Vg in eine 7%ige Lösung fettfreier Trockenmilch in TBST geben. Inkubieren Sie mit dem Antikörper zur Färbung der Membran für 2 h oder über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST-Lösung, wobei Sie jedes Mal 5 Minuten waschen müssen.</li>
	<li>Fügen Sie das Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper zu 7% fettfreier Trockenmilch mit TBST hinzu. Mit dem Antikörper 60-90 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 5 Minuten mit TBST-Lösung.</li>
	<li>Verwenden Sie das ECL-Western-Kit für die Chemilumineszenzmethode. Mischen Sie die Detektionsreagenzien 1 und 2 im Kit im Verhältnis 1:1 in einem Röhrchen. Geben Sie das gemischte Reagenz auf die Membran und inkubieren Sie den Blot 5 Minuten lang.</li>
	<li>Lassen Sie das überschüssige Reagenz ab und machen Sie ein kolorimetrisches Bild des Chemilumineszenzbildes. Kombinieren Sie sie, um die Leiter mit den Proteinbändern zu sehen.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCranston%2C+PS+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).</li>
<li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper%2C+Nephotettix+cincticeps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li>
<li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs%2C+schizaphis+graminum+%28Homoptera%3A+aphididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li>
<li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid%27s+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li>
<li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs%3A+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li>
<li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Kansas+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li>
<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
<li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
<li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Agriculture%2C+Hokkaido+Imperial+University%22%5BJournal%5D)">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li>
<li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211(2015).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563(2017).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li>
<li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142(2020).</li>
<li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li>
<li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li>
<li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der Speichel, der direkt von den Speicheldrüsen der stechend-saugenden Insekten abgesondert wird, spielt eine entscheidende Rolle, da er das Wirtsgewebe vorverdaut und entgiftet und die lebensreichsübergreifenden biologischen Faktoren der Vektoren in den Wirt einbringt 1,3,4. Die weltverbandsübergreifenden biologischen Faktoren, einschließlich Elicitoren, Effektoren und kleiner RNA, sind entscheidend für die Kommunikation zwisch...

Der Vektor-Wirt-Übertragungsmodus von Arboviren, ein grundlegendes Problem, steht an der Grenze der biologischen Wissenschaft. Viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung werden horizontal durch Insektenvektoren übertragen1. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von Hemiptera-Insekten übertragen, darunter Blattläuse, Weiße Fliegen, Zikaden, Zikaden und Thripse. Diese Insekten verfügen über besondere Merkmale, die es ihnen ermöglichen, Pflanzenviren effizient zu übertragen1. Sie besitzen stechend-saugende Mundwerkzeuge und ernähren sich vom Saft von Phloem und Xylem und scheiden ihren Speichelaus 1,2,3,4. Mit der Entwicklung und Verbesserung von Techniken wird die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelkomponenten zu einem neuen Schwerpunkt intensiver Forschung. Zu den bekannten Speichelproteinen im Speichel gehören zahlreiche Enzyme, wie Pektinesterase, Cellulase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Polyphenoloxidase und Saccharase, unter anderem 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Zu den Proteinen im Speichel gehören auch Auslöser, die die Abwehrreaktion des Wirts auslösen und dadurch die Leistung von Insekten verändern, sowie Effektoren, die die Abwehr des Wirts unterdrücken, was die Fitness der Insekten verbessert, und Komponenten, die pathologische Reaktionen des Wirts hervorrufen14,15,16,17. Daher sind Speichelproteine wichtige Materialien für die Kommunikation zwischen Insekten und Wirten. Bei der Übertragung von Viren enthält der Speichel, der von den Speicheldrüsen stechend-saugender viruliferer Insekten abgesondert wird, auch virale Proteine. Virale Bestandteile nutzen den Speichelfluss, um sie vom Insekt an den Pflanzenwirt freizusetzen. Daher überbrückt der Speichel der Insekten die tritrophe Virus-Vektor-Wirt-Interaktion. Die Untersuchung der biologischen Funktion von Speichelproteinen, die von viruliferen Insekten sezerniert werden, hilft, die Beziehung zwischen Virus, Vektor und Wirt zu verstehen.
Für tierische Viren wird berichtet, dass der Speichel von Stechmücken die Übertragung und Pathogenität des West-Nil-Virus (WNV) und des Dengue-Virus (DENV) vermittelt. Das Speichelprotein AaSG34 fördert die Replikation und Übertragung des Dengue-2-Virus, während das Speichelprotein AaVA-1 die Übertragung von DENV und dem Zika-Virus (ZIKV) fördert, indem es die Autophagie aktiviert18,19. Das Speichelprotein D7 von Stechmücken kann die DENV-Infektion in vitro und in vivo durch direkte Interaktion mit den DENV-Virionen und dem rekombinanten DENV-Hüllprotein20 hemmen. In Pflanzenviren induziert das Begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) das Speichelprotein Bsp9 der Weißen Fliege, das die WRKY33-vermittelte Immunität des pflanzlichen Wirts unterdrückt, um die Präferenz und Leistung der Weißen Fliege zu erhöhen und schließlich die Übertragung von Viren zu erhöhen21. Da die Studien zur Rolle von Speichelproteinen von Insekten in pflanzlichen Wirten hinter denen tierischer Wirte zurückgeblieben sind, ist ein stabiles und zuverlässiges System zum Nachweis der Speichelproteine in pflanzlichen Wirten dringend erforderlich.
Das als Reiszwergvirus (RDV) bekannte Pflanzenvirus wird von der Zikade Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) mit hoher Effizienz und persistent vermehrend übertragen22,23. Zuerst wurde berichtet, dass RDV durch einen Insektenvektor übertragen wird und in Asien eine schwere Erkrankung von Reis verursacht24,25. Das Virion ist ikosaedrisch und doppellagig kugelförmig, und die äußere Schicht enthält das äußere KapsidproteinP8 22. Die zirkulative Übertragungszeit von RDV in N. cincticeps beträgt 14 Tage 26,27,28,29,30. Wenn das RDV in den Speicheldrüsen ankommt, werden Virionen über einen Exozytose-ähnlichen Mechanismus in die im Speichel gespeicherten Hohlräume in den Speicheldrüsen freigesetzt23. Das Vitellogenin (Vg) ist die Vorstufe des Dotterproteins, die für die Entwicklung der Eizellen bei weiblichen Insekten unerlässlichist 31,32,33. Die meisten Insektenarten haben mindestens ein Vg-Transkript von 6-7 kb, das für ein Vorläuferprotein von etwa 220 kDa kodiert. Die Proteinvorstufen von Vg können in der Regel in große (140 bis 190 kDa) und kleine (<50 kDa) Fragmente gespalten werden, bevor sie in den Eierstock gelangen18,19. Frühere proteomische Analysen zeigten das Vorhandensein der von Vg abgeleiteten Peptide im sezernierten Speichel der Zikade Recilia dorsalis, obwohl ihre Funktion unbekannt ist (unveröffentlichte Daten). Es wird neu berichtet, dass Vg, das oral von Zikaden abgesondert wird, als Effektor fungiert, um die Abwehrkräfte von Pflanzen zu schädigen34. Es ist nicht bekannt, ob das Vg von N. cincticeps auch mit Speichelfluss an den Pflanzenwirt abgegeben werden kann und dann in der Pflanze eine Rolle spielen könnte, um die pflanzliche Abwehr zu stören. Um herauszufinden, ob N. cincticeps Speichelproteine wie Vg nutzt, um die pflanzliche Abwehr zu hemmen oder zu aktivieren, besteht der erste Schritt darin, Proteine zu identifizieren, die während der Fütterung an die Pflanze abgegeben werden. Das Verständnis der Methode zur Identifizierung der in der Pflanze vorhandenen Speichelproteine ist möglicherweise unerlässlich, um die Funktion von Speichelproteinen und die Wechselwirkungen zwischen Hemiptera und Pflanzen zu erklären.
In dem hier vorgestellten Protokoll wird N. cincticeps als Beispiel verwendet, um eine Methode zur Untersuchung des Vorhandenseins von Speichelproteinen im pflanzlichen Wirt bereitzustellen, die durch Insektenfraß eingeführt werden. Das Protokoll beschreibt in erster Linie die Sammlung und den Nachweis von Speichelproteinen und ist hilfreich für weitere Untersuchungen an den meisten Hemipteren.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>für das 5-fache; Tris-Glycin-Puffer und 10-fach; TBS-Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>für das 5-fache Tris-Glycin-Puffer-Vorbereitung</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Für das 5-fache; Tris-Glycin-Puffer-Vorbereitung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>für 10 mal; TBS Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>für 10 mal TBS Puffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Xiya Reagenz</td><td>B14492</td><td>Für 4&&fache; Proteinprobenpuffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Für 4&fach Proteinprobenpuffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>Glycerinol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Für 4&; Proteinprobenpuffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Für die Vorbereitung von Transferpuffern</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Für die TBST-Zubereitung</td></tr><tr><td>fettfreie Trockenmilch</td><td>Becton.Dickinso and Company</td><td>252038</td><td>Für Membranblockierung, Antikörperverdünnung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Erkennung des primären Andtibody</td></tr><tr><td>ECL Western Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Chemilumineszenzsubstrat</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membran</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Für Proteintransfer</td></tr><tr><td>Puffer und Lösungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Zusammensetzung</td><td></td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>&nbsp; 5& mal; Tris-Glycin-Puffer</td><td>15,1 g Tris-Base 94 g Glycin 5 g SDS in 1 L sterilem Wasser</td><td></td><td>&nbsp; Stammlösung</td></tr><tr><td>1&mal; Tris-Glycin-Puffer</td><td>200 mL von 5&fach; Tris-Glycin-Puffer 800 mL steriles Wasser</td><td></td><td>Arbeitslösung, für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10&mal; Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) Puffer</td><td>80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterilem Wasser</td><td></td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>TBS mit Tween 20 (TBST) Lösung</td><td>100 mL 10 x TBS-Lösung 3 mL Tween 20 900 mL steriles Wasser</td><td></td><td>Arbeitslösung</td></tr><tr><td>4-fach; Proteinprobenpuffer</td><td>8 g SDS 4 mL &szlig;-Mercaptoethanol 0,02 g Bromphenolblau 40 mL Glycerin in 40 mL 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)</td><td></td><td>Zur Proteinextraktion</td></tr><tr><td>Transferpuffer</td><td>800 mL Tris-Glycin-Puffer 200 mL Methanol</td><td></td><td>Für protein transfer</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Für die Vorbereitung von 4x Proteinprobenpuffern</td></tr><tr><td>Inkubator mit konstanter Temperatur</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Für die Aufzucht von Zikaden</td></tr><tr><td>Elektrophorese</td><td>Tanon Wissenschaft & Verifizierter Lieferant - Technology Co., Ltd.</td><td>Tanon EP300</td><td>Für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Elektrophoretische Transferkernmodule</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>Für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Für 4x Proteinprobenpuffer Vorbereitung</td></tr><tr><td></td><td>Glycin Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Für 5x Tris-Glycin Puffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Anerkennung des primären andtibody</td></tr><tr><td>Hochpass-Gewebeschleifinstruments</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Zum Mahlen von Pflanzengeweben</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Für 10x TBS Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Für die Vorbereitung von Transferpuffern</td></tr><tr><td>Mini-Nasswärmeübertragungstrog</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>Für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Für 10x TBS Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Nitrozellulosemembran</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Für Proteintransfer</td></tr><tr><td>fettfreie Trockenmilch</td><td>Becton.Dickinso and Company</td><td>252038</td><td>Für Membranblockierung, Antikörperverdünnung</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Chemilumineszenzsubstrat</td></tr><tr><td>Proteinfarbmessgerät</td><td>GE Healthcare bio-sciences AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Zum Nachweis von Proteinen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Für 5x Tris-Glycin-Puffer-Präparat</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Für 5x Tris-Glycin-Puffer und 10-fach; TBS Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber SCIENCE& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Für die TBST-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Vertikaler Plattenelektrophoresetank</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td><td>Für SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Zum Kochen der Proteinproben</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Xiya Reagenz</td><td>B14492</td><td>Für die Vorbereitung von 4x Proteinprobenpuffern</td></tr></tbody></table>

nachweis von virus- und speichelproteinen eines zikadenvektors im pflanzlichen wirt

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insektenvektoren übertragen horizontal viele Pflanzenviren von landwirtschaftlicher Bedeutung. Mehr als die Hälfte der Pflanzenviren wird von hemipterischen Insekten übertragen, die stechend-saugende Mundwerkzeuge haben. Während der Virusübertragung überbrückt der Insektenspeichel den Virus-Vektor-Wirt, da der Speichel Viren vektoriert und die Insektenproteine die Immunantwort von Pflanzen von Insekten in pflanzliche Wirte auslösen oder unterdrücken. Die Identifizierung und funktionelle Analyse von Speichelproteinen wird zu einem neuen Schwerpunkt im Forschungsfeld der Arbovirus-Wirt-Interaktionen. Dieses Protokoll bietet ein System zum Nachweis von Proteinen im Speichel von Zikaden mit Hilfe des pflanzlichen Wirts. Als Beispiel dient der mit dem Reiszwergvirus (RDV) infizierte Zikadenvektor Nephotettix cincticeps. Das Vitellogenin und das Hauptprotein P8 des äußeren Kapsids P8 von RDV, das durch den Speichel von N. cincticeps vektorisiert wird, können gleichzeitig in der Reispflanze nachgewiesen werden, von der sich N. cincticeps ernährt. Diese Methode eignet sich für die Untersuchung der Speichelproteine, die nach dem Fressen von Insekten vorübergehend im pflanzlichen Wirt zurückgehalten werden. Es wird angenommen, dass dieses Nachweissystem der Untersuchung von Interaktionen zwischen Hemipteran-Virus-Pflanze oder Hemipteran-Pflanze zugute kommen wird.

Abbildung 1 veranschaulicht alle Schritte dieses Protokolls: die Aufzucht von Insekten, den Viruserwerb, die Sammlung von Speichelproteinen über die Reisfütterung und den Western-Blot. Die Ergebnisse der Western Blots zeigten, dass in den Proben von Futterreis und Speicheldrüsen von Insekten auf der Membran, die mit Antikörpern gegen Vg inkubiert wurden, spezifische und erwartete Banden von etwa 220 kDa beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu wurde in der nicht fütternden Reisprobe kei...

Dieses Protokoll demonstriert, wie der pflanzliche Wirt verwendet werden kann, um Speichelproteine von Zikaden und pflanzliche virale Proteine zu detektieren, die von Zikadenvektoren freigesetzt werden.

Nachweis von Virus- und Speichelproteinen eines Zikadenvektors im pflanzlichen Wirt

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Dieses Protokoll bietet eine Technik zum Nachweis der Speichelproteine von Zikaden und Pflanzenwirten, um die Funktion dieser Proteine in den Pflanzenwirten weiter zu untersuchen. Diese Technik ist einfach durchzuführen und das System ist stabil und replizierbar. Diese Methode könnte auch bei der Detektion von Speichelproteinen anderer Hemiptera und pflanzlicher Wirte hilfreich sein.Ziehen Sie zunächst die erwachsenen Zikaden auf Reissetzlingen in einem 40 x 35 x 20 Zentimeter großen Würfelkäfig auf. Halten Sie eine Seite des Käfigs zur Belüftung mit einem insektensicheren Netz bedeckt. Stellen Sie die Käfige mit den Zikaden in einen Inkubator mit eingebautem Feuchtigkeitsregler bei 26 Grad Celsius und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 bis 75 % unter einer Fotoperiode von 16 Stunden hell und acht Stunden dunkel.Verwenden Sie einmal pro Woche einen Absauger, um alle Erwachsenen vorsichtig aus ihrem Käfig in einen neuen Käfig mit frischen Reissetzlingen zu bringen. Lassen Sie mehr als 200 Erwachsene sich paaren und Eier in den Reis legen. Bewahren Sie die alten Reissetzlinge auf, damit die Nymphen schlüpfen können, und ziehen Sie diese neuen nicht-viruliferen Nymphen in das zweite Stadium auf.Übertragen Sie die nicht-viruliferen Nymphen im zweiten Stadium vorsichtig mit dem Aspirator für ein bis zwei Stunden in ein Glaskulturröhrchen, damit sie verhungern. Lassen Sie dann die Nymphen in einen Käfig mit einer mit dem Reiszwergvirus infizierten Reispflanze frei, die in einem Topf angebaut wird, und lassen Sie die Nymphen zwei Tage lang von der infizierten Reispflanze fressen. Setzen Sie diese Nymphen nach zwei Tagen vorsichtig in einen neuen Käfig um, der frische virusfreie Reiskeimlinge enthält, und lassen Sie die Nymphen 12 Tage lang von den virusfreien Reissämlingen fressen, um die zirkulative Übertragungszeit des Reiszwergvirus abzuschließen.Um die Speichelproteine zu sammeln, bereiten Sie fünf kleine röhrenartige Futterkäfige vor, die an einem Ende mit insektensicheren Netzen bedeckt sind. Nachdem Sie 15 bis 20 Zikaden in jedem Futterkäfig eingesperrt haben, decken Sie das andere Ende des Käfigs mit einer dünnen Schaumstoffmatte ab. Befestigen Sie einen Reissetzling zwischen dem Ende des Käfigs und einer Schaumstoffmatte mit Klebebändern und stellen Sie sicher, dass sich die Zikaden im Futterkäfig von den Reissetzlingen ernähren können, die dem Inneren des Käfigs ausgesetzt sind.Tauchen Sie die Sämlingswurzeln in Wasser, damit die Reispflanze am Leben bleibt, und lassen Sie die Zikaden sich zwei Tage lang davon ernähren. Nehmen Sie die Zikaden nach zwei Tagen aus ihren Futterkäfigen und sammeln Sie die Reissetzlinge ein, von denen sich die Zikaden ernährt haben. Schneiden Sie die Sämlinge außerhalb des Käfigs ab und stellen Sie die Fraßregionen der Sämlinge wieder her.Bereiten Sie 1x Tris-Glycin-Puffer vor, indem Sie 200 Milliliter des vorbereiteten 5-fach-Puffers mit 800 Millilitern sterilem Wasser verdünnen. Bereiten Sie dann 10x TBS-Puffer vor und autoklavieren Sie die Lösung bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Als nächstes bereiten Sie den 4-fachen Proteinprobenpuffer vor.Bereiten Sie dann den Transferpuffer vor, indem Sie 800 Milliliter des Tris-Glycin-Puffers mit 200 Millilitern Methanol mischen. Zum Schluss bereiten Sie die TBST-Lösung vor, indem Sie 100 Milliliter 10x TBS und drei Milliliter Tween 20 bis 900 Milliliter steriles Wasser hinzufügen. Um die Speichel- und Virusproteine nachzuweisen, mahlen Sie 0,1 Gramm der Reisproben mit flüssigem Stickstoff, bis das Gewebe zu einem Pulver wird.Dann 200 Mikroliter des 4x Proteinprobenpuffers in die Probe geben und 10 Minuten kochen lassen. Zentrifugieren Sie die Proben und übertragen Sie den Überstand in ein neues Fläschchen. Laden Sie 10 Mikroliter der Probe auf ein SDS-PAGE-Gel und lassen Sie es 45 bis 60 Minuten lang in Tris-Glycin-Puffer bei 150 Volt laufen.Während das Gel läuft, legen Sie eine 0,45-Mikron-Nitrozellulosemembran und andere Sandwich-Vorräte für 30 Minuten in den Transferpuffer. Nach dem Lauf das Gel einschließen und für 90 bis 120 Minuten bei 100 Volt in den Transferpuffer geben. Nachdem der Blotting abgeschlossen ist, legen Sie die Membran in eine 7%ige fettfreie Trockenmilchblockerlösung in TBST und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang.Danach fügen Sie einen Antikörper gegen das Reiszwergvirus P8 oder Vitellogenin hinzu und inkubieren die Membran für zwei Stunden oder über Nacht. Waschen Sie die Membran nach der Inkubation dreimal mit TBST mit einer fünfminütigen Inkubation zwischen jedem Waschgang. Fügen Sie dann Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG als sekundären Antikörper hinzu und inkubieren Sie die Membran für 60 bis 90 Minuten.Verwenden Sie das ECL Western-Kit für die Chemilumineszenz-Detektion in gemischten Detektionsreagenzien eins und zwei im Kit in einem Verhältnis von eins zu eins. Legen Sie die Membran auf das gemischte Reagenz und inkubieren Sie den Blot fünf Minuten lang. Lassen Sie das überschüssige Reagenz ab und machen Sie ein chemilumineszierendes und kolorimetrisches Bild der Membran.Kombinieren Sie die Bilder, um letzteres mit Proteinbanden zu sehen. Western-Blot-Analysen zum Nachweis von Vitellogenin zeigten spezifische und erwartete Banden von etwa 220 Kilodalton bei der Fütterung von Reispflanzen und Speicheldrüsen der Insekten. Im Gegensatz dazu wurde bei den nicht fressenden Pflanzen keine Bande beobachtet, was darauf hindeutet, dass Vitellogenin im Pflanzenwirt als Speichelprotein freigesetzt wurde.Die Western-Blot-Analyse zum Nachweis des P8-Proteins des Reiszwergvirus zeigte eine spezifische und erwartete Bande von etwa 46 Kilodalton in Futterpflanzen und viruliferen Insektenkörpern. Im Gegensatz dazu wurde bei nicht-fressenden Pflanzen und nicht-viruliferen Zikadenkörpern keine Bande beobachtet, was beweist, dass die viralen Proteine auch in den fressenden Pflanzen nachgewiesen werden konnten. Die Virusbelastung in den Zikaden, der Nachweiszeitpunkt und die Wiederholungen sollten bei der Durchführung dieses Protokolls berücksichtigt werden.Diese Methode kann auch zur Untersuchung von Stechmücken angewendet werden, die Arboviren übertragen.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Blattläuse sind effektiver Überträger von Pflanzenviren. Blattlaus Mikroinjektion von Virus, das Verfahren wir Ihnen zeigen, heute, ist eine Technik, so dass die Forscher Viren direkt in die hemocoel der Blattlaus injizieren, unter Umgehung des Darms, einer der 2 größten Hindernisse für eine Übertragung des Virus in einer zirkulativen Weise. Die gleiche Technik wird auch verwendet, um dsRNA für RNAi zu injizieren.

Testen der physiologische Barrieren für die virale Transmission in Blattläuse mit Mikroinjektion

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Wir beschreiben hier ein einfaches Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren zur Lokalisierung von Viren und Bakterien in Insekten-und Pflanzengeweben. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung von mRNA in ganze Berg und mikroskopische Abschnitte erweitert werden.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Pflanze interzelluläre Verbindungen, die Plasmodesmata (Pd), spielen zentrale Rollen im Werk Physiologie und Pflanzenvirus Interaktionen. Entscheidend für den Pd-Transport sind Signale, die Proteine zu Pd direkte sortieren. Unser Wissen über diese Sequenzen ist jedoch noch in den Kinderschuhen. Wir beschreiben eine Strategie zur te-Lokalisierung-Signalen in Pd gezielt Proteine zu identifizieren.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Hier präsentieren wir ein Protokoll der Host-Gewebeverteilung, Übertragungsmodus und Wirkung auf den Wirt Eignung eines densovirus innerhalb Lepidoptera-Spezies zu untersuchen, die Baumwollkapselwurm. Dieses Protokoll kann auch für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen anderen oral übertragenen Viren und ihren Insekten Wirten verwendet werden.

Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle, um 1) Virus-codierte Immunmodulatoren zu identifizieren, die Förderung von Arboviren Replikation und (2) Eukaryotische Host Faktoren, die Arboviren Replikation zu beschränken. Diese Fluoreszenz und Lumineszenz-basierten Methoden können Forscher schnell quantitative Ablesung von Arboviren Replikation in einfachen Tests mit geringen Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.

Screening und Identifizierung von RNA-Silencing Suppressoren von sezernierten Effektoren von Pflanzenpathogenen

Dieses Protokoll zur Immunfluoreszenzmarkierung sowohl von Pflanzenvirusproteinen als auch von Vektorinsektenproteinen in herausgeschnittenen Insektendärmen kann verwendet werden, um Interaktionen zwischen Virus- und Vektorinsekten, Insektenproteinfunktionen und molekulare Mechanismen, die der Virusübertragung zugrunde liegen, zu untersuchen.

Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.

Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.

Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

Erfahren Sie, wie Sie Speichelproteine und virale Proteine von Zikaden in Reispflanzen nachweisen. Diese Methode nutzt SDS-PAGE und Western Blotting zur Untersuchung von Pflanze-Insekt-Interaktionen.

Nachweis von Virus- und Speichelproteinen eines Zikadenvektors im pflanzlichen Wirt

Weitere Videos entdecken