On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Dieses Protokoll demonstriert die Proteinkristallisation auf einem chipähnlichen Gerät in der Röntgenbeugungsdatensammlung. Dieses Gerät wird als Kristall-auf-Kristall bezeichnet, da Proteinkristalle auf einem einzigen Quarzkristall wachsen. Nach erfolgreichem Wachstum von Proteinkristallen auf solchen Geräten werden Tausende von Beugungsbildern von jedem Gerät bei Raumtemperatur gesammelt, ohne die Proteinkristalle zu berühren.

Die Röntgenbeugung bei Raumtemperatur ist sehr wichtig für die Untersuchung der Proteinfunktion mit vielen Konformationszuständen. Diese informativen Proteinveränderungen oder Proteinaktionen können eingefroren werden und sind daher in der Kryokristallographie nicht nachweisbar. Mit diesen Geräten können lichtinduzierte Signalprozesse und Redoxänderungen untersucht werden.

Nur eine Handvoll Geräte liefert vollständige und redundante Datensätze. Um mit der Gerätevormontage zu beginnen, beschriften Sie den äußeren Ring für die Probenidentifikation. Geben Sie den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das gewünschte Datum an.

Legen Sie dann den beschrifteten Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche und legen Sie einen Quarzwafer in den äußeren Ring. Als nächstes gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl in eine Petrischale und tauchen Sie eine Unterlegscheibe in das Öl, um sicherzustellen, dass beide Seiten der Unterlegscheibe gut beschichtet sind. Entfernen Sie überschüssiges Öl, indem Sie die Unterlegscheibe auf eine saubere Oberfläche tupfen.

Legen Sie dann die geölte Unterlegscheibe auf den ersten Quarzwafer. Mischen Sie die Proteinlösung und den Kristallisationspuffer auf dem ersten Quarzwafer mit einer Pipette. Versuchen Sie, Luftblasen beim Mischen zu vermeiden.

Das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung sollte die maximale Kapazität der Kristallisationskammer, die durch die Größe und Dicke der Unterlegscheibe bestimmt wird, nicht überschreiten. Legen Sie den zweiten Quarzwafer über die Mischlösung. Die Lösung wird sich spontan ausbreiten.

Klopfen Sie dann den zweiten Quarzwafer leicht auf den Rand, um das Öl zu verteilen und gleichzeitig Luft herauszudrücken. Sichern Sie das Gerät, indem Sie einen Sicherungsring in den Außenring schrauben. Verwenden Sie bei Bedarf ein Anzugswerkzeug.

Vermeiden Sie ein übermäßiges Anziehen, da sich empfindliche Quarzwafer dadurch verformen oder reißen können. Lagern Sie die montierten Geräte in einer Box bei Raumtemperatur oder in einem temperaturgesteuerten Inkubator. Nach einigen Stunden oder Tagen legen Sie das Kristallisationsgerät unter ein Mikroskop und überwachen Sie das Kristallwachstum.

Optimieren Sie ggf. die Kristallisationsbedingungen wie im Manuskript beschrieben. Installieren Sie zur Kalibrierung einen dünnen YAG-Kristall auf dem Chiphalter und installieren Sie dann den Strahlanschlag. Öffnen Sie als Nächstes die Insitux-Software und führen Sie das angegebene Programm aus, um Röntgenfluoreszenzbilder des direkten Strahls aufzunehmen, wobei das Gerät ein vom Benutzer ausgewählter Name für das Kristallisationsgerät und das Gerät ist.

param ist der Dateiname, der gerätespezifische Steuerungsparameter enthält. Finden Sie dann die genaue Position des direkten Röntgenstrahls, indem Sie das Strahlprofilanpassungsprogramm ausführen, wobei das Brennbild der Dateiname des Röntgenfluoreszenzbildes ist. Für das optische Scannen eine Kristallisationsvorrichtung in den Chiphalter legen und mit einer Rändelschraube befestigen.

Montieren Sie dann den Chiphalter über einen kinematischen Mechanismus auf dem Translationstisch des Diffraktometers. Abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Proteinprobe und dem Zweck des Experiments installieren Sie eine weiße oder infrarote Lichtquelle, um Mikroaufnahmen aus dem optischen Fenster des Geräts aufzunehmen. Sobald das Setup fertig ist, führen Sie das Scanprogramm aus, indem Sie den angegebenen Befehl für das Scannen in Bewegung an der Strahllinie eingeben.

Führen Sie dann das Kachelprogramm auf einem Benutzercomputer aus, wobei x der Anfangswert für die Spalte und y der Anfangswert für Schurkenverschiebungen von Mikrobildern ist. Das Programm fügt alle Mikroaufnahmen in eine Montage von ein bis drei Mikrometern Pixelauflösung. Nachdem Sie die Mikrobilder zusammengefügt haben, geben Sie den angegebenen Befehl ein, um das Kristallsuchprogramm auszuführen.

Dieses Programm führt Kristallerkennung und Schussplanung durch und die Schlüsselparameter in diesem Programm ermöglichen eine spezifische Kristallauswahl und Zielplanung. Entfernen Sie die Lichtquelle und positionieren Sie den Strahlstopp. Führen Sie dann das Datenerfassungsprogramm für die serielle Beugung aus.

Der vorgeschlagene Befehl löst die Datenerfassung aus, indem die geplanten Aufnahmen in einer vorprogrammierten Reihenfolge besucht werden. Jeder Zielkristall wird in die Strahlposition transloziert. Bei jedem Stopp erfolgt die Röntgenbelichtung entweder mit oder ohne Laserbeleuchtung in einer geplanten Zeitverzögerung.

In der Studie wurden die Kristallisationsbedingungen zwischen Dampfdiffusion und einer On-Chip-Charge verglichen. Vier Fallstudien zur On-Chip-Kristallisation und repräsentative Datensätze, die direkt von Quarzgeräten gesammelt wurden, werden hier demonstriert. Die dynamischen Kristallographie-Experimente zeigten lichtinduzierte Veränderungen im fernroten Photorezeptorprotein, indem sie Daten von 4.352 Kristallen im Dunkeln und 8.287 Kristallen nach Lichtbeleuchtung verglichen.

Der dunkle Datensatz aus der seriellen In-situ-Laue-Beugung führte zu besser aufgelösten Elektronendichten, was eine zuverlässige Modellbildung eines Bilin-Chromophors in einer All-Z-Vorzeichenkonformation ermöglichte. Die lichtinduzierten Differenzkarten haben konzertierte Bewegungen im zentralen Beta-Blatt gezeigt, was auf die Bedeutung der Pi-Pi-Stapelung zwischen den Pyrrolringen des Chromophors und mehreren aromatischen Resten hindeutet. Diese Plattform heißt Insitux.

Der einzigartige Vorteil dieser Plattform ist, dass man keine Kristallmanipulation durchführen muss, sobald die Kristallisation abgeschlossen ist. Es ist notwendig, viele Datensätze unter wechselnden Bedingungen zu sammeln, um die Proteinbewegungen zu erfassen. Und das wird mit Insitux möglich, weil es eine großflächige Datenerfassung von Tausenden von Proteinkristallen bei Raumtemperatur ermöglicht.

Mit dieser neuen Fähigkeit, einschließlich der Kristallographie, können die lichtempfindlichen Systeme im Inneren des Geräts ausgelöst und das lichtinerte System untersucht werden, wenn das Kristall-auf-Kristall-Gerät in Ausflüsse umgewandelt wird.