Name: On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie die On-Chip-Kristallisation von Proteinen auf Quarzsubstraten für die Röntgenbeugung bei Raumtemperatur. Diese Methode ermöglicht die automatisierte Datenerfassung ohne Kristallmanipulation.

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Die Nutzung von Advanced Photon Source, einer Office of Science User Facility, die vom Argonne National Laboratory für das US-Energieministerium betrieben wird, wurde durch den Vertrag DE-AC02-06CH11357 unterstützt. Der Einsatz von BioCARS wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer R24GM111072 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Die Nutzung von LS-CAT Sector 21 wurde von der Michigan Economic Development Corporation und dem Michigan Technology Tri-Corridor Grant 085P1000817 unterstützt. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse der University of Illinois in Chicago, der National Institutes of Health (R01EY024363) und der National Science Foundation (MCB 2017274) an XY unterstützt.

1. Gerätevormontage
<ol><li>Beschriften Sie den Außenring (30 mm Durchmesser) zur Probenidentifikation. Geben Sie ggf. den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das Datum an (Abbildung 1A). Legen Sie den äußeren Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche (Abbildung 1B), und legen Sie vorsichtig einen Quarzwafer in den Ring (Abbildung 1C). Dieser erste Quarzwafer dient als Eingangsfenster für die einfallenden Röntgenstrahlen.</li>
	<li>Gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl (Viskosität von 150 cSt) in eine Petrischale. Tauchen Sie eine Unterlegscheibe in das Öl, und stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Unterlegscheibe ordnungsgemäß geölt sind (Abbildung 1D). Entfernen Sie das überschüssige Öl, indem Sie die Unterlegscheibe auf eine saubere Oberfläche tupfen.</li>
	<li>Legen Sie die geölte Unterlegscheibe auf den ersten Quarzwafer (Abbildung 1E). HINWEIS: Tauchöl ist ein ausgezeichnetes Dichtmittel, das die Kristallisationskammer vor potenziellem Dampfverlust schützt. Richtig montierte Späne halten in der Regel wochenlang ohne sichtbare Trocknung. Dieser Vormontageschritt erfolgt unter Raumlicht. Bei lichtempfindlichen Proben müssen alle nachfolgenden Schritte, einschließlich Probenbeladung, Gerätelagerung und Beobachtung, unter Sicherheitslicht durchgeführt werden.</li>
</ol>2. Probenbeladung und Gerätemontage
<ol><li>Verwenden Sie eine Pipette, um die Proteinlösung und den Kristallisationspuffer auf dem ersten Quarzwafer gründlich zu mischen. Das Volumenverhältnis zwischen Proteinprobe und Puffer liegt typischerweise zwischen 2:1 und 1:2 (Abbildung 1F). Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung die maximale Kapazität der Kristallisationskammer, die durch die Größe und Dicke der Unterlegscheibe bestimmt wird, nicht überschreitet. Vermeiden Sie Luftblasen während des Mischens. HINWEIS: Die Zusammensetzung eines Kristallisationspuffers variiert von Experiment zu Experiment. Die Kristallisationsbedingungen finden Sie in Tabelle 1 .</li>
	<li>Platzieren Sie den zweiten Quarzwafer über der Mischlösung, wenn sich die Lösung auszubreiten beginnt (Abbildung 1G). Dieser zweite Quarzwafer dient als Austrittsfenster der gebeugten Röntgenstrahlen.</li>
	<li>Klopfen Sie den zweiten Quarzwafer leicht auf den Rand, um das Öl zu verteilen und gleichzeitig Luft herauszudrücken. Sichern Sie das Gerät, indem Sie einen Sicherungsring in den Außenring schrauben (Abbildung 1H). Verwenden Sie bei Bedarf ein Anzugswerkzeug (Abbildung 1I). Beachten Sie, dass eine übermäßige Straffung dazu führen kann, dass sich empfindliche Quarzwafer verformen oder sogar reißen.</li>
</ol>3. Gerätespeicherung und Kristallisationsoptimierung
<ol><li>Lagern Sie die montierten Geräte (Abbildung 1J) in einer Box bei Raumtemperatur oder in einem Inkubator mit Temperaturregelung. HINWEIS: Proteinkristalle können in wenigen Stunden bis Tagen nach dem Zusammenbau einer Kristallisationsvorrichtung auftreten. Typische Ergebnisse der On-Chip-Kristallisation sind für mehrere repräsentative Proteinproben dargestellt (Abbildung 2).</li>
	<li>Überwachen Sie das Kristallwachstum, indem Sie die Kristallisationsvorrichtung unter einem Mikroskop beobachten. Falls erforderlich, optimieren Sie die Kristallisationsbedingungen durch Iterationen der Abschnitte 1-3.</li>
</ol>4. Kalibrierung
HINWEIS: Die in den folgenden Abschnitten genannten Programme und Befehle werden in der inSituX-Software ausgeführt.
<ol><li>Installieren Sie einen dünnen Kristall aus dotiertem Yttrium-Aluminium-Granat auf dem Chiphalter (Abbildung 3). Installieren Sie den Strahlanschlag. Machen Sie Röntgenfluoreszenzbilder des direkten Strahls, indem Sie das Programm ausführen: burnmark.py <Gerät>.param Dabei ist <Gerät> ein vom Benutzer ausgewählter Name für das Kristallisationsgerät. <device>.param ist ein Dateiname, der gerätespezifische Steuerungsparameter enthält. Die Standardwerte werden schrittweise durch spezifische Werte entlang des Protokolls ersetzt. Eine Beispieldatei <device>.param wird in Zusatzdatei 1 gezeigt.</li>
	<li>Finden Sie die genaue Position des direkten Röntgenstrahls, indem Sie das Strahlprofilanpassungsprogramm ausführen: beam.py <Image brennen> -d <Gerät> wobei <Bild brennen> der Dateiname des Röntgenfluoreszenzbildes ist (Abbildung 4). HINWEIS: Dieses Programm berechnet die genauen direkten Strahlpositionen sowie die Strahlgröße. Die Strahlposition markiert das Translokationsziel für alle Kristalle desselben Geräts. Die Strahlgröße wird auch für die Zielplanung verwendet.</li>
</ol>5. Optisches Scannen
<ol><li>Setzen Sie eine Kristallisationsvorrichtung in den Chiphalter ein, und sichern Sie das Gerät mit einer Rändelschraube (Abbildung 3A).</li>
	<li>Montieren Sie den Chiphalter über einen kinematischen Mechanismus auf dem Translationstisch des Diffraktometers (Abbildung 3B).</li>
	<li>Installieren Sie eine geeignete Lichtquelle für die Aufnahme von Mikroaufnahmen aus dem optischen Fenster des Geräts. Weißlicht, IR-Licht oder anderes Licht der Wahl kann abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Proteinprobe sowie dem Zweck des Experiments verwendet werden.</li>
	<li>Führen Sie das Scanprogramm aus: scan.py <Gerät>.param Dieses Programm erfasst eine Reihe von Mikroaufnahmen, die automatisch auf bestimmte Benutzercomputer übertragen werden.</li>
	<li>Führen Sie das Kachelprogramm auf einem Benutzercomputer aus: tile.py <Gerät> -x <x> -y <y> wobei < x > und <y> die Anfangswerte für Spalten- bzw. Zeilenverschiebungen von Mikrobildern sind. Dieses Programm fügt alle Mikroaufnahmen zu einer Montage von 1-3 μm/Pixel Auflösung zusammen (Abbildung 5). HINWEIS: Die Schritte 5.4 und 5.5 dauern in der Regel einige Minuten. Die Gesamtzahl der Mikroaufnahmen reicht von einigen zehn bis zu hunderten, abhängig von der Scanfläche und der Vergrößerung.</li>
	<li>Führen Sie das Kristallfindungsprogramm aus: findX.py <Montage> -c <Länge> <Breite> -w <Keil> -x <Strahlgröße> wobei <Montage> das gekachelte Bild ist. Dieses Programm führt Kristallerkennung und Schussplanung durch. <Länge > und <Breite> geben die zu findende Kristallgröße an. Wenn der Benutzer kleinere Kristalle vermeiden möchte, kann <Breite> als Cutoff verwendet werden, indem eine Zahl eingestellt wird, die größer ist als die Größe unerwünschter kleiner Kristalle. <Keil> ist ein Winkelwert, der die Toleranz für Kristalle mit unregelmäßiger Form festlegt. <Balkengröße> bezieht sich auf die direkte Strahlgröße, die sich aus der obigen Profilverschraubung ergibt (Schritt 4.2; Abbildung 4). Außerdem kann ein Sollwert von Benutzern festgelegt werden, um gezielte Aufnahmen weiter zu verteilen. Diese Schlüsselparameter ermöglichen eine spezifische Kristallauswahl und Zielplanung (Abbildung 6).</li>
</ol>6. Röntgenbeugung
<ol><li>Entfernen Sie die Lichtquelle und installieren Sie den Strahlstopp. Stellen Sie einen geeigneten Detektorabstand ein. Folgen Sie dem Sicherheitsprotokoll der Beamline, um den Röntgenstall zu durchsuchen. Öffnen Sie den Röntgenverschluss und ggf. den Laserverschluss.</li>
	<li>Führen Sie das Datenerfassungsprogramm für die serielle Beugung aus: collect.py <device>.param -l <Lichtdauer> Dieser Befehl löst eine Datenerfassung aus, bei der alle geplanten Aufnahmen nacheinander nach einer vorprogrammierten Reihenfolge besucht werden. Jeder Zielkristall wird in die Strahlposition transloziert (Schritt 4.2). Bei jedem Stopp erfolgt die Röntgenbelichtung mit oder ohne Laserbeleuchtung in einer geplanten Zeitverzögerung. Film 1 zeigt eine automatisierte Datenerfassungssequenz , die mit einer Frequenz von 1 Hz betrieben wird. Routinemäßig werden Dutzende bis Hunderte von Beugungsbildern von einer einzigen Kristallisationsvorrichtung gesammelt (Film 2). HINWEIS: Abschnitt 4 Kalibrierung und Abschnitt 5 optischer Scan sind in der inSituX-Plattform enthalten und daher vollständig auf eine andere Beamline übertragbar. Abschnitt 6 Röntgenbeugung muss einige Details im Betrieb der Strahllinie beinhalten.</li>
</ol>

<ol><li>Brändén, G., Neutze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+time-resolved+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography.</a> Science. 373, (2021).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).</li>
<li>Schaffer, J. E., Kukshal, V., Miller, J. J., Kitainda, V., Jez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+X-rays%3A+an+overview+of+emerging+structural+biology+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Beyond X-rays: an overview of emerging structural biology methods.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (2), 221-230 (2021).</li>
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<li>Chapman, H. N., Caleman, C., Timneanu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+before+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Diffraction before destruction.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 369, 20130313(2014).</li>
<li>Kisselman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-CHIP%3A+an+integrated+platform+for+high-throughput+protein+crystallization+and+on-the-chip+X-ray+diffraction+data+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-CHIP: an integrated platform for high-throughput protein crystallization and on-the-chip X-ray diffraction data collection.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (6), 533-539 (2011).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combined+crystallization+plate+for+high-throughput+crystal+screening+and+in+situ+data+collection+at+a+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Novel combined crystallization plate for high-throughput crystal screening and in situ data collection at a crystallography beamline.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 77, 319-327 (2021).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67, 747-755 (2011).</li>
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<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+crystallography+reveals+early+signaling+events+in+ultraviolet+photoreceptor+UVR8%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Dynamic crystallography reveals early signaling events in ultraviolet photoreceptor UVR8.</a> Nature Plants. 1, 14006(2015).</li>
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</ol>

ZR ist der Erfinder der Crystal-on-Crystal-Chips auf dem US-Patent, das Renz Research, Inc. erteilt 9632042.

Die Proteinkristallographie in den frühen Jahren, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, hatte enorme Schwierigkeiten, Röntgenstrahlenschäden zu bekämpfen. Daher wurde es durch die robustere Kryokristallographie-Methode ersetzt, da Synchrotron-Röntgenquellen leicht verfügbar wurden20. Mit dem Aufkommen von Freie-Elektronen-Röntgenlasern wurde die Proteinkristallographie bei Raumtemperatur in den letzten Jahren wiederbelebt, wobei viele neue Entwicklungen von dem Wunsch angetrieben wurden, die ...

Aufgrund der ionisierenden Wirkung von Röntgenstrahlung war die Proteinkristallographie in den letzten drei Jahrzehnten weitgehend auf kryogene Bedingungen beschränkt. Daher ergibt sich das aktuelle Wissen über Proteinbewegungen während seiner Funktion weitgehend aus Vergleichen zwischen statischen Strukturen, die in verschiedenen Zuständen unter kryogenen Bedingungen beobachtet wurden. Kryogene Temperaturen behindern jedoch unweigerlich das Fortschreiten einer biochemischen Reaktion oder Interkonversion zwischen verschiedenen Konformationszuständen, während Proteinmoleküle arbeiten. Um die Proteinstrukturdynamik mit atomarer Auflösung direkt durch Kristallographie zu beobachten, sind robuste und routinemäßige Methoden zur Durchführung von Beugungsexperimenten bei Raumtemperatur erforderlich, was technische Innovationen in der Probenabgabe, Datenerfassung und posterioren Datenanalyse erfordert. Zu diesem Zweck haben die jüngsten Fortschritte in der seriellen Kristallographie neue Wege eröffnet, um die molekularen Bilder von Zwischenprodukten und kurzlebigen Strukturspezies bei Raumtemperatur 1,2,3 aufzunehmen. Im Gegensatz zu der in der konventionellen Kryokristallographie weit verbreiteten "Ein-Kristall-ein-Datensatz"-Strategie verfolgt die serielle Kristallographie eine Datenerfassungsstrategie, die der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie ähnelt. Konkret werden die experimentellen Daten in der seriellen Kristallographie in kleinen Fraktionen aus einer großen Anzahl von Einzelproben gesammelt, gefolgt von einer intensiven Datenverarbeitung, bei der Datenfraktionen ausgewertet und zu einem vollständigen Datensatz zur 3D-Strukturbestimmung zusammengeführt werden4. Diese "One-Crystal-One-Shot"-Strategie mildert effektiv die Röntgenstrahlungsschädigung von Proteinkristallen bei Raumtemperatur durch eine Beugung vor der Zerstörungsstrategie5.
Da die serielle Kristallographie eine große Anzahl von Proteinkristallen benötigt, um einen Datensatz zu vervollständigen, stellt sie viele biologische Systeme, in denen Proteinproben begrenzt sind und/oder eine empfindliche Kristallhandhabung erforderlich ist, vor große technische Herausforderungen. Eine weitere wichtige Überlegung ist, wie die Kristallintegrität in seriellen Beugungsexperimenten am besten erhalten werden kann. Die In-situ-Beugungsmethoden adressieren diese Bedenken, indem sie es Proteinkristallen ermöglichen, direkt von dort zu beugen, wo sie wachsen, ohne die Versiegelung der Kristallisationskammer 6,7,8,9 zu brechen. Diese handhabungsfreien Verfahren sind selbstverständlich kompatibel mit großflächiger serieller Beugung. Wir haben kürzlich über das Design und die Implementierung einer Kristallisationsvorrichtung für die In-situ-Beugung berichtet, die auf einem Crystal-on-Crystal-Konzept basiert - Proteinkristalle, die direkt auf monokristallinem Quarz11 gezüchtet werden. Dieses "Kristall-auf-Kristall"-Gerät bietet mehrere Vorteile. Erstens verfügt es über ein röntgen- und lichttransparentes Fenster aus einem monokristallinen Quarzsubstrat, das wenig Hintergrundstreuung erzeugt, was zu hervorragenden Signal-Rausch-Verhältnissen in Beugungsbildern von Proteinkristallen führt. Zweitens ist der einkristalline Quarz eine ausgezeichnete Dampfsperre, die Glas entspricht und somit eine stabile Umgebung für die Proteinkristallisation bietet. Im Gegensatz dazu neigen andere Kristallisationsvorrichtungen, die polymerbasierte Substrate verwenden, aufgrund der Dampfdurchlässigkeit zum Austrocknen, es sei denn, das Polymermaterial weist eine erhebliche Dicke auf, was folglich zu einer hohen Hintergrundstreuung beiträgt10. Drittens ermöglicht dieses Gerät die Abgabe einer großen Anzahl von Proteinkristallen an den Röntgenstrahl ohne jegliche Form von Kristallmanipulation oder -ernte, was für die Erhaltung der Kristallintegrität entscheidend ist11.
Um serielle Röntgenbeugungsexperimente mit den Crystal-on-Crystal-Geräten zu rationalisieren, haben wir einen Diffraktometer-Prototyp entwickelt, der ein einfaches Umschalten zwischen den optischen Scanning- und Röntgenbeugungsmodi12 erleichtert. Dieses Diffraktometer hat einen geringen Platzbedarf und wurde für die serielle Datenerfassung an zwei Beamlines der Advanced Photon Source (APS) am Argonne National Laboratory verwendet. Konkret haben wir BioCARS 14-ID-B für die Laue-Beugung und LS-CAT 21-ID-D für die monochromatische Oszillation verwendet. Diese Diffraktometer-Hardware ist nicht erforderlich, wenn eine Synchrotron- oder Röntgen-Freie-Elektronen-Laser-Beamline mit zwei Schlüsselfunktionen ausgestattet ist: (1) motorisierte Probenpositionierung mit einem Verfahrbereich von ±12 mm um den Röntgenstrahl in alle Richtungen; und (2) eine On-Axis-Digitalkamera für die Kristallbetrachtung unter Lichtbeleuchtung, die für untersuchte Proteinkristalle sicher ist. Das monokristalline Quarzgerät bildet zusammen mit einem tragbaren Diffraktometer und der Steuerungssoftware für optisches Scannen, Kristallerkennung und automatisierte In-situ-Datenerfassung die inSituX-Plattform für die serielle Kristallographie. Obwohl diese Entwicklung in erster Linie durch ihre dynamischen Kristallographie-Anwendungen mit einer polychromatischen Röntgenquelle motiviert ist, haben wir das Potenzial dieser Technologie zur Unterstützung monochromatischer Oszillationsmethoden10,12 demonstriert. Mit Automatisierung bietet diese Plattform eine serielle Datenerfassungsmethode mit hohem Durchsatz bei Raumtemperatur mit erschwinglichem Proteinverbrauch.
In diesem Beitrag beschreiben wir im Detail, wie man die On-Chip-Kristallisation in einem Nasslabor aufbaut und wie man serielle Röntgendatenerfassung an einer Synchrotron-Beamline mit der inSituX-Plattform durchführt.
Die Batch-Methode wird verwendet, um eine On-Chip-Kristallisation unter einer ähnlichen Bedingung wie die Dampfdiffusionsmethode für dieselbe Proteinprobe einzurichten (Tabelle 1). Als Ausgangspunkt empfehlen wir, Fällungsmittel in einer 1,2-1,5-fachen Konzentration für die Dampfdiffusionsmethode zu verwenden. Bei Bedarf kann die Chargenkristallisation durch Feingittersiebung weiter optimiert werden. Quarzwafer sind für Optimierungsversuche nicht notwendig; Stattdessen können Glasdeckgläser verwendet werden (siehe unten). Teilweise beladene Kristallisationsgeräte werden empfohlen, um Optimierungsversuche in kleinerem Maßstab durchzuführen. Eine Reihe von Proteinproben wurde erfolgreich auf solchen Geräten unter Verwendung der Batch-Methode10 kristallisiert (Tabelle 1).
Das Gerät selbst besteht aus folgenden Teilen: 1) einem äußeren Ring; 2) zwei Quarzwafer; 3) eine scheibenartige Unterlegscheibe aus Kunststoff oder Edelstahl; 4) einen Sicherungsring; 5) Mikroskop-Tauchöl als Dichtmittel (Abbildung 1). Das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung, die auf einen Chip geladen wird, hängt vom Zweck des Experiments ab. Die Kapazität der Kristallisationskammer kann durch Auswahl einer Unterlegscheibe unterschiedlicher Dicke und/oder Innendurchmesser eingestellt werden. Wir richten routinemäßig Kristallisationsgeräte mit einer Kapazität von 10-20 μL mit Scheiben von 50-100 μm Dicke ein. Ein typisches Gerät kann Zehntausende bis Tausende von Proteinkristallen produzieren, die für die serielle Datenerfassung geeignet sind (Abbildung 2).
Wenn die On-Chip-Kristallisation erfolgreich ist, werden Dutzende bis Hunderte oder sogar Tausende von Proteinkristallen auf jedem Quarzgerät erzeugt, die für die Röntgenbeugung bereit sind. An einer Synchrotron-Beamline wird eine solche Vorrichtung mittels eines kinematischen Mechanismus auf einem dreiachsigen Translationstisch des Diffraktometers montiert. Das Kristallisationsfenster eines montierten Gerätes wird optisch gescannt und in Dutzenden bis Hunderten von Mikroaufnahmen abgebildet. Diese Mikroaufnahmen werden dann zu einer hochauflösenden Montage zusammengefügt. Bei lichtempfindlichen Kristallen kann das optische Scannen unter Infrarotlicht (IR) durchgeführt werden, um eine unbeabsichtigte Photoaktivierung zu vermeiden. Eine Computer-Vision-Software wurde entwickelt, um zufällig auf dem Gerät verteilte Proteinkristalle zu identifizieren und zu lokalisieren. Diese Kristalle werden dann nach ihrer Größe, Form und Position eingestuft, um die Datenerfassungsstrategie in der seriellen Kristallographie zu informieren oder zu leiten. Zum Beispiel können einzelne oder mehrere Schüsse auf jedem Zielkristall lokalisiert werden. Benutzer konnten einen einzelnen Durchgang oder mehrere Routen durch gezielte Kristalle planen. Wir haben Software implementiert, um verschiedene Reiserouten zu berechnen. Zum Beispiel wird die kürzeste Route mit Algorithmen berechnet, die das Problem des Handlungsreisenden13 angehen. Für dynamische kristallographische Pump-Probe-Anwendungen können Zeitpunkt und Dauer von Laser- (Pump) und Röntgenaufnahmen (Sonde) gewählt werden. Eine automatisierte serielle Datenerfassung ist so programmiert, dass sie jeden Zielkristall nacheinander in den Röntgenstrahl transloziert.
Zu den wichtigsten Komponenten des insituX-Diffraktometers gehören: 1) ein Gerätehalter; 2) eine dreiachsige Übersetzungsstufe; 3) eine Lichtquelle für optisches Scannen; 4) ein Röntgenstrahlstopp; 5) Pumplaser, wenn lichtempfindliche Proteine untersucht werden; 6) Raspberry Pi Mikrocomputer mit einer IR-empfindlichen Kamera; 7) Steuerungssoftware zur Synchronisierung von Motoren, Kameras, Lichtquellen, Pumplaser und zur Schnittstelle mit Beamline-Steuerungen.

<table><tbody><tr><td>Analysesoftware</td><td>Eigenentwickelte</td> Cer-dotierte Yttrium-Aluminium-Granate-Verbrauchsmaterialien <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ce:Y3Al5O12, YAG-Einkristallsubstrate</td></tr><tr><td>Chiphalter</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steuerungssoftware</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersionsöl</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16482</td><td>Typ A niedrig Viskosität 150</td></tr><tr><td>cSt inSituX-Plattform</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR-Lichtquelle</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LED1085L</td><td>LED mit Glaslinse, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V8</td></tr><tr><td>Außenring</td><td>Eigenentwickelte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher Scietific FB0875713</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Pipetman</td><td>F167380</td><td>P10</td></tr><tr><td>Pumplaser</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>LD785-SE400</td><td>785 nm, 400 mW und Oslash; 9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td></tr><tr><td>Raspberry Pi</td><td>Raspberry Pi Fundation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sicherungsring</td><td>Thorlabs Incorporated</td><td>SM1RR</td><td>SM1 Sicherungsring für &Oslash; 1" Linsentuben und Halterungen</td></tr><tr><td>Seedless Quarzkristall</td><td>University Wafers, Inc.</td><td>U01-W2-L-190514</td><td>25,4 mm Durchmesser Z-Schnitt 0,05 mm Dicke doppelseitig poliert 8 mm auf -X</td></tr><tr><td>Unterlegscheibe</td><td>Eigenentwickelter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röntgenstrahlanschlag</td><td>Eigenentwicklung</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

on-chip-kristallisation und großflächige serielle beugung bei raumtemperatur

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemische Reaktionen und biologische Prozesse können am besten verstanden werden, indem gezeigt wird, wie Proteine zwischen ihren funktionellen Zuständen übergehen. Da kryogene Temperaturen unphysiologisch sind und die Proteinstrukturdynamik verhindern, abschrecken oder sogar verändern können, ist eine robuste Methode für routinemäßige Röntgenbeugungsexperimente bei Raumtemperatur sehr wünschenswert. Das Crystal-on-Crystal-Gerät und die dazugehörige Hard- und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind so konzipiert, dass sie eine In-situ-Röntgenbeugung bei Raumtemperatur für Proteinkristalle unterschiedlicher Größe ohne Probenmanipulation ermöglichen. Hier stellen wir die Protokolle für die wichtigsten Schritte von der Gerätemontage, On-Chip-Kristallisation, optischem Scannen, Kristallerkennung bis hin zur Röntgenaufnahmeplanung und automatisierten Datenerfassung vor. Da diese Plattform keine Kristallgewinnung oder andere Probenmanipulation erfordert, können Hunderte bis Tausende von Proteinkristallen, die auf Chip gezüchtet werden, programmierbar und mit hohem Durchsatz in einen Röntgenstrahl eingebracht werden.

Mehrere repräsentative Datensätze wurden in den letzten Jahren veröffentlicht 10,12 zusammen mit den kristallographischen Ergebnissen und wissenschaftlichen Erkenntnissen aus einer Vielzahl von Proteinproben, einschließlich Photorezeptorproteinen und Enzymen, zum Beispiel einem pflanzlichen UV-B-Photorezeptor UVR8, einer lichtgetriebenen DNA-Reparaturphotolyase PhrB10, einem neuartigen Fern-Rotlicht-Sensorprotein aus einer multidomänensensorischen Histidinkinase ...

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Dieses Protokoll demonstriert die Proteinkristallisation auf einem chipähnlichen Gerät in der Röntgenbeugungsdatensammlung. Dieses Gerät wird als Kristall-auf-Kristall bezeichnet, da Proteinkristalle auf einem einzigen Quarzkristall wachsen. Nach erfolgreichem Wachstum von Proteinkristallen auf solchen Geräten werden Tausende von Beugungsbildern von jedem Gerät bei Raumtemperatur gesammelt, ohne die Proteinkristalle zu berühren.Die Röntgenbeugung bei Raumtemperatur ist sehr wichtig für die Untersuchung der Proteinfunktion mit vielen Konformationszuständen. Diese informativen Proteinveränderungen oder Proteinaktionen können eingefroren werden und sind daher in der Kryokristallographie nicht nachweisbar. Mit diesen Geräten können lichtinduzierte Signalprozesse und Redoxänderungen untersucht werden.Nur eine Handvoll Geräte liefert vollständige und redundante Datensätze. Um mit der Gerätevormontage zu beginnen, beschriften Sie den äußeren Ring für die Probenidentifikation. Geben Sie den Projektnamen, die Gerätenummer, die Kristallisationsbedingung und das gewünschte Datum an.Legen Sie dann den beschrifteten Ring kopfüber auf eine saubere Oberfläche und legen Sie einen Quarzwafer in den äußeren Ring. Als nächstes gießen Sie eine kleine Menge Mikroskop-Tauchöl in eine Petrischale und tauchen Sie eine Unterlegscheibe in das Öl, um sicherzustellen, dass beide Seiten der Unterlegscheibe gut beschichtet sind. Entfernen Sie überschüssiges Öl, indem Sie die Unterlegscheibe auf eine saubere Oberfläche tupfen.Legen Sie dann die geölte Unterlegscheibe auf den ersten Quarzwafer. Mischen Sie die Proteinlösung und den Kristallisationspuffer auf dem ersten Quarzwafer mit einer Pipette. Versuchen Sie, Luftblasen beim Mischen zu vermeiden.Das Gesamtvolumen der Kristallisationslösung sollte die maximale Kapazität der Kristallisationskammer, die durch die Größe und Dicke der Unterlegscheibe bestimmt wird, nicht überschreiten. Legen Sie den zweiten Quarzwafer über die Mischlösung. Die Lösung wird sich spontan ausbreiten.Klopfen Sie dann den zweiten Quarzwafer leicht auf den Rand, um das Öl zu verteilen und gleichzeitig Luft herauszudrücken. Sichern Sie das Gerät, indem Sie einen Sicherungsring in den Außenring schrauben. Verwenden Sie bei Bedarf ein Anzugswerkzeug.Vermeiden Sie ein übermäßiges Anziehen, da sich empfindliche Quarzwafer dadurch verformen oder reißen können. Lagern Sie die montierten Geräte in einer Box bei Raumtemperatur oder in einem temperaturgesteuerten Inkubator. Nach einigen Stunden oder Tagen legen Sie das Kristallisationsgerät unter ein Mikroskop und überwachen Sie das Kristallwachstum.Optimieren Sie ggf. die Kristallisationsbedingungen wie im Manuskript beschrieben. Installieren Sie zur Kalibrierung einen dünnen YAG-Kristall auf dem Chiphalter und installieren Sie dann den Strahlanschlag. Öffnen Sie als Nächstes die Insitux-Software und führen Sie das angegebene Programm aus, um Röntgenfluoreszenzbilder des direkten Strahls aufzunehmen, wobei das Gerät ein vom Benutzer ausgewählter Name für das Kristallisationsgerät und das Gerät ist.param ist der Dateiname, der gerätespezifische Steuerungsparameter enthält. Finden Sie dann die genaue Position des direkten Röntgenstrahls, indem Sie das Strahlprofilanpassungsprogramm ausführen, wobei das Brennbild der Dateiname des Röntgenfluoreszenzbildes ist. Für das optische Scannen eine Kristallisationsvorrichtung in den Chiphalter legen und mit einer Rändelschraube befestigen.Montieren Sie dann den Chiphalter über einen kinematischen Mechanismus auf dem Translationstisch des Diffraktometers. Abhängig von der Lichtempfindlichkeit der Proteinprobe und dem Zweck des Experiments installieren Sie eine weiße oder infrarote Lichtquelle, um Mikroaufnahmen aus dem optischen Fenster des Geräts aufzunehmen. Sobald das Setup fertig ist, führen Sie das Scanprogramm aus, indem Sie den angegebenen Befehl für das Scannen in Bewegung an der Strahllinie eingeben.Führen Sie dann das Kachelprogramm auf einem Benutzercomputer aus, wobei x der Anfangswert für die Spalte und y der Anfangswert für Schurkenverschiebungen von Mikrobildern ist. Das Programm fügt alle Mikroaufnahmen in eine Montage von ein bis drei Mikrometern Pixelauflösung. Nachdem Sie die Mikrobilder zusammengefügt haben, geben Sie den angegebenen Befehl ein, um das Kristallsuchprogramm auszuführen.Dieses Programm führt Kristallerkennung und Schussplanung durch und die Schlüsselparameter in diesem Programm ermöglichen eine spezifische Kristallauswahl und Zielplanung. Entfernen Sie die Lichtquelle und positionieren Sie den Strahlstopp. Führen Sie dann das Datenerfassungsprogramm für die serielle Beugung aus.Der vorgeschlagene Befehl löst die Datenerfassung aus, indem die geplanten Aufnahmen in einer vorprogrammierten Reihenfolge besucht werden. Jeder Zielkristall wird in die Strahlposition transloziert. Bei jedem Stopp erfolgt die Röntgenbelichtung entweder mit oder ohne Laserbeleuchtung in einer geplanten Zeitverzögerung.In der Studie wurden die Kristallisationsbedingungen zwischen Dampfdiffusion und einer On-Chip-Charge verglichen. Vier Fallstudien zur On-Chip-Kristallisation und repräsentative Datensätze, die direkt von Quarzgeräten gesammelt wurden, werden hier demonstriert. Die dynamischen Kristallographie-Experimente zeigten lichtinduzierte Veränderungen im fernroten Photorezeptorprotein, indem sie Daten von 4.352 Kristallen im Dunkeln und 8.287 Kristallen nach Lichtbeleuchtung verglichen.Der dunkle Datensatz aus der seriellen In-situ-Laue-Beugung führte zu besser aufgelösten Elektronendichten, was eine zuverlässige Modellbildung eines Bilin-Chromophors in einer All-Z-Vorzeichenkonformation ermöglichte. Die lichtinduzierten Differenzkarten haben konzertierte Bewegungen im zentralen Beta-Blatt gezeigt, was auf die Bedeutung der Pi-Pi-Stapelung zwischen den Pyrrolringen des Chromophors und mehreren aromatischen Resten hindeutet. Diese Plattform heißt Insitux.Der einzigartige Vorteil dieser Plattform ist, dass man keine Kristallmanipulation durchführen muss, sobald die Kristallisation abgeschlossen ist. Es ist notwendig, viele Datensätze unter wechselnden Bedingungen zu sammeln, um die Proteinbewegungen zu erfassen. Und das wird mit Insitux möglich, weil es eine großflächige Datenerfassung von Tausenden von Proteinkristallen bei Raumtemperatur ermöglicht.Mit dieser neuen Fähigkeit, einschließlich der Kristallographie, können die lichtempfindlichen Systeme im Inneren des Geräts ausgelöst und das lichtinerte System untersucht werden, wenn das Kristall-auf-Kristall-Gerät in Ausflüsse umgewandelt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

In diesem Papier wird das Herstellungsprotokoll von mikrofluidischen Chips erläutert, das für die Proteinkristallisation auf dem Chip mit der Dialysemethode und in situ Röntgenbeugungsexperimenten entwickelt wurde. Der Mikroherstellungsprozess ermöglicht es, eine semipermeable regenerierte Zellulosedialysemembran mit einem beliebigen Molekulargewichts-Cut-off zwischen zwei Schichten des Chips zu integrieren.

Kristallisation von Proteinen auf Chip durch Mikrodialyse für In Situ-Röntgenbeugungsstudien

Es wird ein vielseitiges mikrofluidisches Gerät beschrieben, das die Kristallisation eines Enzyms mittels der Gegendiffusionsmethode, das Einbringen eines Substrats in die Kristalle durch Einweichen und die 3D-Strukturbestimmung des Enzyms:Substrat-Komplex durch eine serielle Analyse von Kristallen im Inneren des Chips bei Raumtemperatur ermöglicht.

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Wir beschreiben Verfahren zur Herstellung und Abgabe von Membranprotein-Mikrokristallen in lipidischer kubischer Phase für die serielle Kristallographie an Röntgen-Freie-Elektronen-Lasern und Synchrotronquellen. Diese Protokolle können auch für die Einarbeitung und Abgabe von löslichen Proteinmikrokristallen verwendet werden, was zu einem erheblich reduzierten Probenverbrauch im Vergleich zur Flüssiginjektion führt.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Automatisierte Systeme und Protokolle für die routinemäßige Vorbereitung einer großen Anzahl von Bildschirmen und Nanoliter Kristallisation Tröpfchen für Dampf-Diffusion-Experimente sind beschrieben und diskutiert.

Automatische Protokolle für makromolekulare Kristallisation am MRC Laboratory of Molecular Biology

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um produzieren große Mengen an rekombinanten RNA in Escherichia coli Co zum Ausdruck bringen, eine Chimäre RNA, die die RNA in ein Viroid-Gerüst und eine Pflanze enthält tRNA-Ligase. Das Hauptprodukt ist ein kreisförmigen Molekül, das erleichtert die Reinigung zur Homogenität.

Großtechnische Produktion von rekombinanten RNAs auf einem kreisförmigen Gerüst mit einem Viroid-abgeleitete System bei Escherichia coli

Lernen Sie die On-Chip-Kristallisation von Proteinen auf Quarzsubstraten für die Röntgenbeugung bei Raumtemperatur. Diese Methode ermöglicht die automatisierte Datenerfassung ohne Kristallmanipulation.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

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