Name: Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Lernen Sie die digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der murinen Netzhaut. Dieses Protokoll ermöglicht präzise absolute Quantifizierung für Gentherapie-Forschung.

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Wir danken Oezkan Keles, Josephine Jüttner und Prof. Botond Roska, Institut für Molekulare und Klinische Ophthalmologie Basel, Complex Viruses Platform für ihre Hilfe und Unterstützung bei der AAV-Produktion. Wir möchten uns auch bei Prof. Jean Bennett, Perelman School of Medicine, der University of Pennsylvania, für den AAV8/BP2-Stamm bedanken. Tierarbeiten werden in der Tieranlage der Technischen Universität Gebze durchgeführt. Dafür danken wir Leyla Dikmetas und Prof. Uygar Halis Tazebay für die technische Hilfe und Unterstützung bei der Tierhaltung. Wir danken auch Dr. Fatma Özdemir für ihre Anmerkungen zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch TUBITAK, Fördernummern 118C226 und 121N275, und Sabanci University Integration Grant unterstützt.

Alle experimentellen Protokolle wurden von der Ethikkommission der Sabanci Universität akzeptiert und die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Erklärung der "Association for Research in Vision and Ophthalmology" für die Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt
1. Kleine AAV-Produktion12
<ol><li>Kultivieren Sie HEK293T-Zellen unter Verwendung von 15-cm-Platten in vollständigen 10 ml DMEM / 10% FBS bis zu 70-80% Konfluenz.</li>
	<li>Die Transfektionsmischung ist mit 20 μg Hilfsplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg Kapsidplasmid und 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-Vektor und 136 μL PEI-Lösung (1 mg/ml) in 5 ml DMEM herzustellen.</li>
	<li>Die 5 ml hergestellte Transfektionsmischung in eine Zellkulturschale mit 10 ml Nährmedien geben und die transfizierten Zellen für 48-60 h bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium 48-60 h nach der Transfektion und verdauen Sie es mit DNase I in einer Endkonzentration von 250 U/ml für 30 min bei 37 °C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das aufgeschlossene Medium bei 4000 x g,4 °C für 30 min und filtrieren Sie es dann mit einem 0,22 μm Spritzenfilter in die vorbenetzte regenerierte Cellulosemembran für 100 kDa.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran bei 4000 x g,4 °C für 30 min und entsorgen Sie das Medium.</li>
	<li>Waschen und zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS, das 0,001% Pluronic F-68 enthält, dreimal bei 4000 x g,4 °C für 30 min. Verwerfen Sie den PBS bei jedem Schritt.</li>
	<li>Sammeln Sie konzentrierte AAVs aus dem oberen Teil der regenerierten Cellulosemembran und Aliquot für weitere Anwendungen.</li>
	<li>5 μL frisch hergestelltes AAV mit DNase I (0,2 HE/μl) für 15 min bei 37 °C zum Titerieren aufbereiten. Es folgt eine Inkubation von 10 min bei 95 °C, um sowohl die DNase I zu inaktivieren als auch die viralen Kapside abzubauen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10-fache serielle Verdünnung aus verdauten AAVs mit 0,05% Pluronic F-68 vor. Verwenden Sie AAV2-ITR- und WPRE-Primer für die Titration (Tabelle 1). Die Titer wurden berechnet, indem die dd-PCR-Ergebnisse mit den Verdünnungsfaktoren multipliziert wurden. Die Ergebnisse wurden in Genomkopie/ml (GC/ml) umgewandelt. HINWEIS: Die AAV-Konzentrationen für die AAV-Produktion in kleinem Maßstab werden voraussichtlich etwa 1 x 1012 GC/ml betragen. Dieses Protokoll gilt nicht für AAV-Stämme, die AAVs nicht effizient in Medien wie AAV213 freisetzen.</li>
</ol>2. Intravitreale Injektion von AAV
<ol><li>
Vorbereitung der Ausrüstung
	<ol>
<li>Bevor Sie beginnen, bereiten Sie 10 μL Mikrospritze mit einer 36 G stumpfen Nadel vor. Spülen Sie fünfmal mit 70% EtOH, fünfmal in ddH2O und schließlich fünfmal mit PBS.</li>
		<li>Laden Sie für jede Injektion die entsprechende Menge AAV in die Mikrospritze.</li>
		<li>Bereiten Sie die chirurgische Nadel (Naht, Seide, 6/0), Klebeband, Pinzette und Schere vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intravitreale Injektion
	<ol>
<li>Tragen Sie vor der Narkose 1 Tropfen 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid (z. B. Mydfrin) mit Augentropfen auf, um die Pupillen zu erweitern.</li>
		<li>Anästhesieren Sie Mäuse mit Isofluran 5% (1 L/min) und fahren Sie während des Eingriffs mit 1,5% Isofluran (1 L/min) fort. Für die erste Induktion wird eine kleine Isoflurankammer verwendet.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch den Verlust des Aufrichtungsreflexes, des Entzugsreflexes und der Schwanzquetschreaktion.</li>
		<li>Tragen Sie vor dem Injektionsvorgang 0,3% Tobramycin und 0,1% ige sterile ophthalmologische Lösung mit Dexamethason auf jedes Auge auf. Die Anwendung von Augentropfen verhindert Trockenheit und übt entzündungshemmende und antibakterielle Wirkungen aus.</li>
		<li>Verwenden Sie den Operationshaken, um das obere Augenlid zu stabilisieren. Ziehen Sie sich leicht zurück, um den dorsalen Teil des Auges freizulegen. Kleben Sie den Haken an die Bank, um ihn in Position zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Bindehaut (weniger als 1 mm2)mit der gekrümmten Irisschere, um die Sklera des Auges unter dem Seziermikroskop freizulegen. Verwenden Sie eine frische und sterile Insulinspritze (30 G), um die Sklera zu punktieren.</li>
		<li>Führen Sie die Nadel der Mikrospritze mit einem Mikromanipulator durch dieselbe Punktion. Legen Sie die Nadelspitze hinter die Linse in die Mitte der Augenmuschel.</li>
		<li>Injizieren Sie 1 μL AAV2/BP2 und AAV2/PHP. S-Vektoren mit Konzentrationen von 1,63 x10 12 GC/ml und 1,7 x10 12 GC/ml gelangen langsam in den Glaskörper des Auges. Die Einspritzvolumenregelung erfolgt manuell. Lassen Sie die Nadel für 1 Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie die Nadel langsam zurück.</li>
		<li>Lassen Sie das Augenlid los und tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle topische Gelbehandlung mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason auf die Augenmuschel auf. Überwachen und bewerten Sie die Mäuse in den folgenden Tagen gemäß dem Scoresheet in Bezug auf Aussehen (helle Augen, gepflegtes Fell, Buckeln), Verhalten (Aktivität, Ruhigstellung, Selbstverstümmelung) und Körpergewicht auf einer Skala von 0 bis 3. Jede Bedingung hat eine Punktzahl von 0-3 und eine Gesamtpunktzahl von 3 oder höher ist ein Beendigungskriterium.</li>
		<li>Legen Sie die Tiere nach der Genesung in den Käfig.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Fluoreszenz- und Fundusbildgebung
<ol><li>Die Maus abseihen und die Pupille erweitern, indem Sie Tropfen von 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid in jedes Auge geben.</li>
	<li>Betäuben Sie das Tier mit dem oben genannten Verfahren mit Isofluran. Beurteilen Sie die Tiefe der Anästhesie sorgfältig, indem Sie die Pfoten kneifen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf die Bildgebungsstufe und überprüfen Sie die richtige Dilatation, indem Sie die Funduskamera überprüfen. Tragen Sie topisches Gel (0,2% Carbomer 980) auf die Oberfläche der Augen auf, um die Augen vor Austrocknung unter Narkose zu schützen und es als Kopplungsgel für die Bildgebung zu verwenden.</li>
	<li>Manipulieren Sie die Bildgebungsstufe so, dass sie sich an den Revolver des Objektivs anpasst. Passen Sie die Bühne nach Bedarf an, um das Mausauge zu zentrieren. Sobald das Auge zentriert ist, bewegen Sie das Ziel langsam, bis es Kontakt mit dem Auge hat.</li>
	<li>Führen Sie eine Fundus- und Fluoreszenzbildgebung an beiden Augen durch, um die tdTomato-Expression 1 Woche und 2 Wochen nach intravitrealer Injektion zu verfolgen (Abbildung 3B)14. Nehmen Sie Fundus- und Fluoreszenzbilder mit identischen Einstellungen zum Vergleich der Reporterexpression.</li>
</ol>4. Isolierung der Netzhaut
<ol><li>Einschläfern von Tieren nach Fundus- und Fluoreszenzbildgebung durch CO2-Inhalation zur Netzhautentnahme nach 2 Wochen.</li>
	<li>Verschieben Sie den Augapfel mit Hilfe einer 13,5 cm Splitterzange nach vorne.</li>
	<li>Entfernen Sie die Linse zusammen mit dem übrig gebliebenen Glaskörper, indem Sie sanften Druck mit der Pinzette ausüben.</li>
	<li>Schneiden Sie die Verbindung des Augapfels zum Sehnerv mit einer präzise gekrümmten Pinzette ab und drücken Sie die Netzhaut vorsichtig mit der gleichen gekrümmten Pinzette zusammen.</li>
	<li>Übertragen Sie sezierte Netzhäute in ein Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Snap Freeze Retina, indem Sie die Röhrchen in den flüssigen Stickstoff legen.</li>
</ol>5. Genomische DNA-Isolierung von Gewebe
<ol><li>Isolieren Sie genomische DNA mit einem kommerzialisierten Proteinase K-Verdauungs-basierten genomischen Gewebe-DNA-Kit.</li>
	<li>Verdauen Sie die Netzhaut bei 55 °C, 200 x g für 30 min mit Proteinase K, die bereits im Kit enthalten ist.</li>
	<li>Führen Sie den RNase-Inkubationsschritt, die Waschschritte mit dem Waschpuffer I und II und schließlich den Elutionsschritt gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.</li>
	<li>Fügen Sie nach der letzten Wäsche einen zusätzlichen Schleuderschritt hinzu, um Den Restethanol zu entfernen.</li>
	<li>Messen Sie die Konzentration der genomischen DNA und lagern Sie die Proben bei -20 °C.</li>
</ol>6. Digitale Tröpfchen-PCR-Analyse von Netzhautproben von Mäusen zur Quantifizierung viraler Genome
<ol><li>Verdünnung genomischer DNAs aus injizierter Netzhaut in 0,05% pluronic F-68 Lösung, um eine Endkonzentration von 1 ng/μL für jede Probe zu erreichen.</li>
	<li>Führen Sie separate Reaktionen für WPRE und 18S mit zielspezifischen Primern mit einer Endkonzentration von 125 nM für jeden Primer durch.</li>
	<li>Führen Sie die Tröpfchengenerierung in einer 20 μL PCR-Reaktionsmischung durch, einschließlich 1 ng genomischer DNA, 125 nM-Primern und 2x Evagreen-Supermix.</li>
	<li>Laden Sie die Probenmischung in den mittleren Teil der Patrone, um Tröpfchen zu erzeugen.</li>
	<li>Nachdem die Probe in die Kartusche geladen wurde, geben Sie 70 μL des Tröpfchenerzeugungsöls in die untere Reihe der Kartusche.</li>
	<li>Setzen Sie die Dichtung auf die Patrone und legen Sie sie in den Tröpfchengenerator. Stellen Sie sicher, dass kein Spalt zwischen der Dichtung und der Kartusche besteht.</li>
	<li>Nehmen Sie vorsichtig etwa 40 μL Tröpfchen, die im oberen Brunnen erzeugt werden. Geben Sie die Tröpfchenlösung in die halbverzierte 96-Well-PCR-Reaktionsplatte.</li>
	<li>Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem PCR-Plattenversiegeler unter Verwendung von Aluminium-Dichtfolie.</li>
	<li>Legen Sie die PCR-Platte in einen 96-Well-Heißsiegel-Thermocycler. Verwenden Sie das PCR-Protokoll; 95 °C für 5 min, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 1 min, 4 °C für 5 min, 90 °C für 5 min und 4 °C unendlich halten. Wenden Sie bei jedem Zyklus eine Rampenrate von 2 °C/s an, um sicherzustellen, dass die Tröpfchen während des Zyklus für jeden Schritt die richtige Temperatur erreichen</li>
	<li>Legen Sie die PCR-Platte in den Tröpfchenleser ein, um die Tröpfchen mit der dd-PCR-Software zu quantifizieren. Eine Vorlage wird mit spezifischen Einstellungen für evagreen eingerichtet.</li>
	<li>Analysieren Sie die Daten mithilfe eines 1D-Diagrammdiagramms mit jeder Probe für die Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Tröpfchenzahl. Der Schwellenwert ist so angeordnet, dass die Tröpfchen oberhalb des Schwellenwerts als positiv und die darunter liegenden als negativ zugeordnet werden. Es folgt die Anwendung des Poisson-Algorithmus zur Bestimmung der Ausgangskonzentration der Ziel-DNA in Kopieneinheiten/μL. Das Verhältnis von WPRE zu 18S wird für die Messung der AAV-Transduktionseffizienz berechnet.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

In diesem Protokoll haben wir zwei AAV-Vektoren mit unterschiedlichen Kapsidproteinen generiert und diese dann entsprechend titeriert. Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls besteht darin, ausreichende Mengen an AAVs zu erzeugen, die nach der Transduktion12,13eine nachweisbare Reporterexpression ergeben. 
Die Titerierung von AAVs ist auch ein wichtiger Faktor, um die Dosierung von AAV für intravitreale Injektionen anzupasse...

Adeno-assoziierte Viren (AAVs) werden heute häufig für eine Vielzahl von retinalen Gentherapiestudien verwendet. AAVs bieten eine sichere und effiziente Art der Genabgabe mit weniger Immunogenität und weniger Genomintegrationen. Der AAV-Eintritt in die Zielzelle erfolgt durch Endozytose, die eine Bindung von Rezeptoren und Co-Rezeptoren auf der Zelloberfläche erfordert1,2. Daher hängt die Transduktionseffizienz von AAVs für verschiedene Zelltypen hauptsächlich vom Kapsid und seinen Wechselwirkungen mit den Wirtszellrezeptoren ab. AAVs haben Serotypen und jeder Serotyp kann unterschiedliche Zell- / Gewebetropismen und Transduktionseffizienzen aufweisen. Es gibt auch künstliche AAV-Serotypen und -Varianten, die durch chemische Modifikation des Viruskapsids, Produktion von Hybridkasiden, Peptidinsertion, Kapsidmuffling, gerichtete Evolution und rationale Mutagenese erzeugt werden3. Selbst geringfügige Veränderungen der Aminosäuresequenz oder der Kapsidstruktur können einen Einfluss auf Wechselwirkungen mit Wirtszellfaktoren haben und zu unterschiedlichen Tropismen führen4. Neben Kapsidvarianten können andere Faktoren wie der Injektionsweg und die Batch-to-Batch-Variation der AAV-Produktion die Transduktionseffizienz von AAVs in der neuronalen Netzhaut beeinflussen. Daher sind zuverlässige Methoden für den Vergleich von Transduktionsraten für verschiedene Varianten notwendig.
Die Mehrheit der Methoden zur Bestimmung der AAV-Transduktionseffizienz beruht auf der Expression des Reportergens. Dazu gehören fluoreszierende Bildgebung, Immunhistochemie, Western Blot oder histochemische Analyse des Reportergenprodukts5,6,7. Aufgrund der Größenbeschränkung von AAVs ist es jedoch nicht immer möglich, Reportergene einzubeziehen, um die Transduktionseffizienz zu überwachen. Die Verwendung starker Promotoren wie dem hybriden CMV-Enhancer/Chicken Beta-Actin oder woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) als mRNA-Stabilisatorsequenz verkompliziert das Größenproblemweiter 8. Daher wird es auch von Vorteil sein, die Transduktionsrate von injizierten AAVs mit einer direkteren Methodik zu definieren.
Die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) ist eine leistungsstarke Technik zur Quantifizierung der Ziel-DNA aus winzigen Probenmengen. Die dd-PCR-Technologie hängt von der Verkapselung der Ziel-DNA und der PCR-Reaktionsmischung durch Öltröpfchen ab. Jede dd-PCR-Reaktion enthält Tausende von Tröpfchen. Jedes Tröpfchen wird als eigenständige PCR-Reaktion aufbereitet und analysiert9. Die Analyse von Tröpfchen ermöglicht die Berechnung der absoluten Kopienzahl von Ziel-DNA-Molekülen in jeder Probe mithilfe des Poisson-Algorithmus. Da die Transduktionseffizienz der AAVs mit der Kopienzahl von AAV-Genomen in der neuronalen Netzhaut korreliert, verwendeten wir die dd-PCR-Methode, um AAV-Genome zu quantifizieren.
Hier beschreiben wir eine dd-PCR-Methodik zur Berechnung der Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren aus retinaler genomischer DNA6,10. Erstens wurden AAVs, die tdTomato-Reporter exprimieren, unter Verwendung des Small-Scale-Protokolls generiert und durch die dd-PCR-Methode11titeriert. Zweitens wurden AAVs intravitreal in die neuronale Netzhaut injiziert. Um die Transduktionseffizienz zu demonstrieren, haben wir zunächst die tdTomato-Expression mit Fluoreszenzmikroskopie und ImageJ-Software quantifiziert. Es folgte die Isolierung genomischer DNA zur Quantifizierung von AAV-Genomen in injizierten Netzhäuten mittels dd-PCR. Der Vergleich der tdTomato-Expressionsniveaus mit den transduzierten AAV-Genomen, die durch die dd-PCR quantifiziert wurden, zeigte, dass die dd-PCR-Methode die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren genau quantifizierte. Unsere Protokolle zeigten eine detaillierte Beschreibung einer dd-PCR-basierten Methodik zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz. In diesem Protokoll zeigen wir auch die absolute Anzahl der AAV-Genome, die nach intravitrealen Injektionen transduziert werden, indem einfach der Verdünnungsfaktor nach der genomischen DNA-Isolierung und die dd-PCR-Ergebnisse verwendet werden. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine leistungsfähige Methode, die eine Alternative zur Reporterexpression wäre, um die Transduktionseffizienz von AAV-Vektoren in der Netzhaut zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>96-Well Semi-Skirted ddPCR Platten</td><td>BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj Mäusestamm</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6JRj</td><td>Mäuse</td></tr><tr><td>DG8 Dichtungen</td><td>BioRad</td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Tröpfchengenerierungsöl eva grün</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Tröpfchenleseröl</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Foliendichtungen für PX1 PCR Plattenversiegelung</td><td>BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>BD Medical</td><td>320933</td><td>Intravitreale Injektion</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td><td></td> N01AB06 <td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Microinjector MM33</td><td>World Precision Instruments</td><td>82-42-101-0000</td><td>Intravitreale Injektion</td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>Micron IV</td><td>Das Mikroskopiesystem basiert auf einer 3-CCD-Farbkamera, einem Framegrabber und handelsüblicher Software und ermöglicht es Forschern, die Netzhaut von Mäusen abzubilden.</td></tr><tr><td>Mydfrin (%2,5 Phenylephrinhydrochlorid)</td><td>Alcon</td><td>S01FB01</td><td>Pupillenerweiterung</td></tr><tr><td>Nanofil Spritze 10 &mu; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Intravitreale</td></tr><tr><td>Injektionsnadel RN G36, 25 mm, PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>Intravitreale Injektion</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Plasmid pHGT1-Adeno1</td><td>PlasmidFactory</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer System</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LÄNGE = 13,5 CM</td><td>endostall medizinisch</td><td>EJN-160-0155</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Spritzenvorsatzfilter</td> für die Netzhautisolierung <td>AISIMO</td><td>ASF33PS22S</td> AAV-Gewebe-Genomik-DNA-Kit <td></td></tr><tr><td></td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>gDNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Tobradex (0,3 % Tobramycin / 0,1 % Dexamethason)</td><td>Alcon</td><td>S01CA01</td><td>entzündungshemmendes / antibiotisches</td></tr><tr><td>Tropamid (% 0,5 Tropicamid)</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>Pupillenerweiterung</td></tr><tr><td>Turbonuclease</td><td>Accelagen</td><td>N0103L</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Viscotears (Carbomer 2 mg/g)</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>Gleitgel Augentropfen</td></tr></tbody></table>

digitale tropfen-pcr-methode zur quantifizierung der aav-transduktionseffizienz in der murinen netzhaut

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Viele Labore für netzhautzellbiologie verwenden heute routinemäßig Adeno-assoziierte Viren (AAVs) für Gen-Editing und regulatorische Anwendungen. Die Effizienz der AAV-Transduktion ist in der Regel kritisch, was sich auf die gesamten experimentellen Ergebnisse auswirkt. Eine der Hauptdeterminanten für die Transduktionseffizienz ist der Serotyp oder die Variante des AAV-Vektors. Derzeit sind verschiedene künstliche AAV-Serotypen und -Varianten mit unterschiedlichen Affinitäten zu Wirtszelloberflächenrezeptoren verfügbar. Für die retinale Gentherapie führt dies zu unterschiedlichen Transduktionswirkungsgraden für verschiedene retinale Zelltypen. Darüber hinaus können der Injektionsweg und die Qualität der AAV-Produktion auch die retinale AAV-Transduktionseffizienz beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Effizienz verschiedener Varianten, Chargen und Methoden zu vergleichen. Die digitale Tröpfchen-PCR-Methode (dd-PCR) quantifiziert die Nukleinsäuren mit hoher Präzision und ermöglicht die durchführung einer absoluten Quantifizierung eines bestimmten Ziels ohne Standard oder Referenz. Mit hilfe der dd-PCR ist es auch möglich, die Transduktionseffizienzen von AAVs durch absolute Quantifizierung der AAV-Genomkopienzahlen innerhalb einer injizierten Netzhaut zu bewerten. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Quantifizierung der Transduktionsrate von AAVs in Netzhautzellen mittels dd-PCR zur Verfügung. Mit geringfügigen Modifikationen kann diese Methodik auch die Grundlage für die Kopienzahlquantifizierung der mitochondrialen DNA sowie für die Bewertung der Effizienz der Basenbearbeitung sein, die für mehrere Netzhauterkrankungen und Gentherapieanwendungen von entscheidender Bedeutung ist.

Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ist eine schnelle und effiziente Methode, die Vektoren für intravitreale Injektionen liefert (Abbildung 1). Die AAV-Produktion im kleinen Maßstab ergibt in der Regel Titer im Bereich von 1 x 1012 GC/ml, was ausreicht, um die Reporterexpression in der Netzhaut nachzuweisen (Abbildung 2). Die Titerierung von AAV mittels dd-PCR liefert konsistente Ergebnisse. ITR2- und WPRE-spezifische Primer werden routinemäßig verw...

Dieses Protokoll zeigt, wie die AAV-Transduktionseffizienz in der Netzhaut der Maus mittels digitaler Tröpfchen-PCR (dd-PCR) in Verbindung mit AAV-Produktion im kleinen Maßstab, intravitrealer Injektion, retinaler Bildgebung und retinaler genomischer DNA-Isolierung quantifiziert werden kann.

Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für große AVV-Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden. Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren.Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der digitalen Tröpfchen-PCR und liefert einfache Ergebnisse. In diesem Video zeigen wir, wie die AAV-Transduktion in der Netzhaut der Maus mit der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode quantifiziert werden kann, die extrem empfindlich ist und eine absolute Quantifizierung der Ziel-DNA durchführt. Wir haben diese Methode hauptsächlich für großflächige Konstrukte entwickelt, die es uns nicht erlauben, ein Reportergen wie CRISPR-basierte Konstrukte zu verwenden.Mit dieser Methode können wir einfach die Transduktionsrate von AAVs in der Netzhaut quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Sensitivität und absoluten Quantifizierung der PCR mit zwei Tröpfchen und liefert einfache Ergebnisse. Aufgrund der Effizienz der digitalen Tröpfchen-PCR-Methodik wechseln bereits mehrere Labore von der quantitativen Real-Time-PCR zur digitalen Tröpfchen-PCR oder AAV-Titrierung.Diese Methode kann auch eine Grundlage für die mitochondriale DNA-Quantifizierung in der Netzhaut sowie die Überprüfung der Effizienz der CRISPR-basierten Mutationskorrektur für die Gentherapie in der Netzhaut der Maus liefern. Bereiten Sie eine Transfektionsmischung mit AAV-Hilfsplasmid, AAV-Kapsidplasmid, AAV-Vektor und PI-Lösung in fünf Millilitern vor. Die fünf Milliliter vorbereitete Transfektionsmischung in Nährmedien geben.Transfizierte Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sammeln Sie das Medium 48 bis 60 Stunden nach der Transfektion. Das Medium mit DNAs in einer Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius aufbereiten und bei 4.000 g vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren.Benetzen Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS vor. Filtern Sie das Medium mit 0,22 Mikrometer Spritzenfilter in die vorbenetzte regenerierte Cellulosemembran für 100 Kilo Dalton. Die regenerierte Cellulosemembran bei 4.000 G vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren und das Medium entsorgen.Waschen und zentrifugieren Sie die regenerierte Cellulosemembran mit PBS, das 0,001% pluronic F68 enthält, dreimal bei 4000 G vier Grad Celsius für 30 Minuten. Sammeln Sie konzentrierte AAVs aus dem oberen Teil der regenerierten Cellulosemembran und verteilen Sie sie für die weitere Verwendung. Hier haben wir gezeigt, wie man eine kleinere AAV-Produktion herstellt.Nach der Überprüfung dieses Protokolls sollten Sie in der Lage sein, AVVs zu erstellen, die ausreichen, um den Reporterausdruck in der Netzhaut zu sehen. Sie können auch dem Protokoll für die digitale PCR folgen, um die produzierten AAVs titeren zu können. Tragen Sie vor der Narkose einen Tropfen 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen auf, um die Pupillen zu erweitern.Betäuben Sie Mäuse mit Isofluran und überprüfen Sie die Reflexe. Tragen Sie vor dem Injektionsvorgang 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason sterile ophthalmologische Lösung Augentropfen auf jedes Auge auf. Verwenden Sie den Operationshaken, um das obere Augenlid zu stabilisieren.Ziehen Sie sich leicht zurück, um den dorsalen Teil des Auges freizulegen. Kleben Sie den Haken an das Band, um ihn in Position zu halten. Entfernen Sie die Bindehaut mit der gebogenen Irisschere, um die Sklera des Auges freizulegen.Verwenden Sie eine frische und sterile 30G Insulinspritze, um die Sklera zu punktieren. Führen Sie die Nadel der Mikrospritze mit einem Mikromanipulator durch dieselbe Punktion. Platzieren Sie die Nadelspitze hinter der Linse in der Mitte der Augenmuschel.Injizieren Sie einen Mikroliter AAV-Lösung langsam in den Glaskörper des Auges. Lassen Sie die Nadel für eine Minute an Ort und Stelle und ziehen Sie die Nadel langsam zurück. Tragen Sie eine entzündungshemmende und antibakterielle topische Gelbehandlung mit 0,3% Tobramycin und 0,1% Dexamethason auf die Augenmuschel auf.Tragen Sie einen Tropfen 0,5% Tropicamid auf. Und 2,5% Phenylephrinhydrochlorid mit Augentropfen vor der Anästhesie, um die Pupillen zu erweitern. Tragen Sie Carbamid zwei Milligramm pro Gramm topisches Gel auf die Oberfläche der Augen auf.Stellen Sie den Mausständer nach Bedarf ein, um das Mausauge zu zentrieren. Führen Sie eine Fundus- und Fluoreszenzbildgebung an beiden Augen durch, um die TdTomato-Expression eine Woche und zwei Wochen nach der intravitrealen Injektion zu verfolgen. Euthanasie der Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation vor dem Eingriff.Verschieben Sie den Augapfel mit Hilfe einer 13,5 Zentimeter großen Splitterzange nach vorne. Entfernen Sie die Linse zusammen mit dem übrig gebliebenen Glaskörper. Schneiden Sie die Verbindung des Augapfels zum Sehnerv mit einer präzise gekrümmten Pinzette ab und drücken Sie die Netzhaut vorsichtig mit der gleichen gekrümmten Pinzette zusammen.Isolieren Sie genomische DNA mit einem kommerzialisierten Proteinase-K-Digest-Film-basierten genomischen DNA-Kit für Gewebe. Verdauen Sie die Netzhaut bei 55 Grad Celsius 200 G für 30 Minuten mit Proteinase K.Lyse Netzhaut vollständig und folgen Sie dem Sprotocol des Herstellers. In diesen Protokollen haben wir eine intravitreale Injektion von Fundusblütenbildgebung sowie eine Netzhaut- und genomische DNA-Isolierung gezeigt.Dies sind sehr kritische Verfahren für die Netzhaut, und wenn Sie dieses Protokoll befolgen, sollten Sie in der Lage sein, die produzierten AAVs zu injizieren und ihr Expressionsprofil zu verfolgen. Und diese Transduktionseffizienz durch die Quantifizierung von AAV-Genomen in retinaler genomischer DNA. Hier können Sie die grundlegende Anwendung der digitalen Tröpfchen-PCR sehen, bei der Sie eine absolute Quantifizierung des AAV-Genoms vornehmen können, das in den Netzhautzellen transduziert.Verdünnung genomischer DNAs aus injizierter Netzhaut in 0,05% pluronischer F 68-Lösung, um eine Endkonzentration von einem Nanogramm pro Mikroliter für jede Probe zu erreichen. Führen Sie Tröpfchengenerierung in einer 20 Mikroliter PCR-Reaktionsmischung durch, einschließlich eines Nanogramms genomischer DNA 125 Nanomolar-Primer und 2X immergrüner Supermischung. Laden Sie die Probenmischung zur Tröpfchenerzeugung in den mittleren Teil der Kartusche.Anschließend werden 70 Mikroliter Tröpfchenerzeugungsöl in die untere Reihe der Kartusche gegeben. Setzen Sie die Dichtung auf die Patrone. Stellen Sie sicher, dass kein Spalt zwischen der Dichtung und der Kartusche besteht.Legen Sie es dann in den Tröpfchengenerator. Nehmen Sie vorsichtig etwa 40 Mikroliter Tröpfchen, die in der oberen Glocke erzeugt werden. Geben Sie die Tröpfchenlösung in die halbseitige 96-Well-PCR-Reaktionsplatte.Versiegeln Sie die PCR-Platte mit einem PCR-Plattenversiegeler unter Verwendung von Aluminium-Dichtfolie. Legen Sie die PCR-Platte in den 96-Well heißversiegelten Thermocycler. Verwenden Sie das im Artikel angegebene ddPCR-Protokoll.Legen Sie die PCR-Platte in den Tröpfchenleser, um die Daten zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, grundlegende digitale PCR-Techniken durchzuführen. Sie können auch beanspruchte Zellen mit geringen Materialmengen verwenden, was ideal für die digitale PCR-Technik ist.Sie sollten jedoch die Ziel-DNA-Menge sorgfältig anpassen, um die Grenze der digitalen Tröpfchen-PCR nicht zu überschreiten. Hier ist das Flussdiagramm für das experimentelle Verfahren. Wir führten eine AAV-Produktion im kleinen Maßstab durch, gefolgt von der AAV-Titerierung.Dann führten wir eine intravitreale Injektion durch. Anschließend quantifizierten wir die Fluoreszenzintensität durch Fundusfluoreszenzbildgebung. Dann isolierte sich die Netzhaut der Maus und extrahierte genomische DNA aus der Netzhaut für ddPCR.Die Titerierung von AAV ist auch entscheidend, um die AAV-Transduktion korrekt quantifizieren zu können. ddPCR hängt von der Erzeugung von Tröpfchen ab, die das Ziel-AAV-Genom verdünnt haben. Repräsentative ddPCR-Ergebnisse zeigen positive und negative Tröpfchen für das AVV-Genom.Positiv über dem Schwellenwert und negativ ist darunter. Nach der Multiplikation mit den Verdünnungsfaktoren wurde festgestellt, dass der Titer der AAVs 10 zu den 12 in Genomkopien pro Milliliter betrug. Um die AAV-Tranduktionseffizienz korrekt zu quantifizieren, wurden mehrere Netzhäute injiziert.Injizierte Tiere wurden abgebildet und die mittlere Fluoreszenzintensität wurde berechnet. Nach zwei Wochen wurde die Netzhaut isoliert. Und ddPCR wurde mit WPRE und 18 S Primern durchgeführt.Die Fluoreszenzintensität der injizierten AAV-Netzhaut korrelierte mit AAV-Genomberechnungen, was die Leistungsfähigkeit der Methodik zeigt. Hier haben wir verschiedene Techniken gezeigt, einschließlich der intravitrealen Injektion der AAV-Vorbereitung im kleinen Maßstab.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Um die Permeabilität der Blut-Netzhaut-Schranke und die innere Grenzmembranintegrität in Tiermodellen für Netzhauterkrankungen zu untersuchen, haben wir mehrere Adeno-assoziierte Virus (AAV) Varianten als Werkzeuge zur Markierung von retinalen Neuronen und Gliazellen verwendet. Die virusvermittelte Reportergenexpression wird dann als Indikator für die Permeabilität der Netzhautbarriere verwendet.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

Dieses Manuskript beschreibt einen einfach Dot Blot Assay für die Quantifizierung der Adeno-assoziierte Virus (AAV) Titer und deren Anwendung zur Untersuchung der Rolle von Montage-aktivierende Proteine (AAPs), eine neuartige Klasse von nichttragenden virale Proteine in allen AAV Serotypen, bei der Förderung der Versammlung des Capsids verwandt und heterologen AAV-Serotypen abgeleitet.

Eine Quantitative Dot Blot Assay für AAV Titration und seine Verwendung für funktionale Bewertung von Adeno-assoziierten Virus Assembly-aktivierende Proteine

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung der Neuritenmorphogenese in postnatalen Maus-Netzhautexplantationen mittels konfokaler Zeitraffinalmikroskopie vor. Wir beschreiben einen Ansatz zur spärlichen Markierung und Erfassung von retinalen Zelltypen und deren Feinprozessen unter Verwendung rekombinanter adenoassoziierter Virusvektoren, die membrangerichtete fluoreszierende Proteine in einer Cre-abhängigen Weise exprimieren.

Zeitraffer-Bildgebung neuronaler Arborisation mittels spärlicher adenoassoziierter Virusmarkierung genetisch zielgerichteter Netzhautzellpopulationen

Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.

Eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen AAV mit einem kolorimetrischen zellbasierten Assay

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Entwicklung und Validierung guter Laborpraktiken bei der konformen Detektion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in menschlichen Tränen durch digitale Polymerase-Tröpfchenkettenreaktion zur Unterstützung der klinischen Entwicklung von Gentherapievektoren vor.

Ein validierbarer digitaler Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktions-Assay für den Nachweis von Adeno-assoziierten viralen Vektoren in Bioshedding-Studien an Tränen

Im Folgenden stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Injektion von seitlichen Schwanzvenen aus der Maus zur systemischen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei adulten Mäusen vor. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle von häufig verwendeten Assays zur Beurteilung der AAV-Transduktion.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Subretinale Injektionen sind eine unverzichtbare Technik für die präklinische Entwicklung von Therapeutika für Photorezeptor- und RPE-Erkrankungen. Wir beschreiben eine optimierte transsklerale subretinale Injektionstechnik bei Mäusen, die die intraoperativen Erfolgsraten verbessert und Netzhautschäden minimiert.

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In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

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Digitale Tropfen-PCR-Methode zur Quantifizierung der AAV-Transduktionseffizienz in der Murinen Netzhaut

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