Name: Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Lernen Sie die Bewertung zellulärer Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator. Diese Methode ermöglicht Echtzeitmessungen von ECAR und OCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit im lombardischen Labor wird vom NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 und ME200030) und der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt. Die Arbeit im Li-Labor wird vom NIH (NHLBI 5R01HL150707) unterstützt.

Alle Tierversuche mit Wirbeltieren wurden von den Vorschriften des Ausschusses für die Verwendung und Pflege von Tieren der University of Michigan genehmigt und in Übereinstimmung mit diesen durchgeführt.
1. Tag vor dem Assay (Gesamtzeit: ~10 min)
<ol><li>Hydratation der Sensorkartusche (Schrittzeit: ~10 min)<ol>
<li>Öffnen Sie das extrazelluläre Flux-Assay-Kit, und entfernen Sie die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe. Speichern Sie Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.</li>
		<li>Trennen Sie die Sensorkassette (den oberen grünen Teil mit Deckel) manuell von der Utility-Platte (untere 96-Well-Mikroplatte) und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte.</li>
		<li>Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 μL Kalibrant, das im Lieferumfang des Flow-Assay-Kits enthalten ist.</li>
		<li>Setzen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Gebrauchsplatte und stellen Sie sicher, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind.</li>
		<li>Legen Sie die montierte Sensorpatrone und die Gebrauchsplatte mit Kalibrant über Nacht in einen Nicht-CO2 37 °C Inkubator. Um eine Verdunstung des Kalibers zu verhindern, stellen Sie sicher, dass der Inkubator ordnungsgemäß befeuchtet ist. Wenn Sie einen normalen Ofeninkubator für Nicht-CO2 37 °C-Inkubationen verwenden, stellen Sie ein offenes Becherglas mit Wasser in den Inkubator, um ihn zu befeuchten. Falls verfügbar, verwenden Sie eine XF-Vorbereitungsstation für alle Nicht-CO2 37 °C-Inkubationen. HINWEIS: Alternativ kann die Sensorkartusche über Nacht mit 200 μL sterilem Reinstwasser pro Bohrung in einem Nicht-CO2 37 °C Inkubator hydratisiert werden. Ersetzen Sie Wasser durch 200 μL pro Bohrung von 37 °C vorgewärmtem Kalibrant, mindestens 45-60 Minuten, bevor Sie die Injektionsöffnungen am Tag des Assays laden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tag des Assays (Gesamtzeit: ~9 h 30 min)
HINWEIS: Die oben angegebene Gesamtzeit beinhaltet die kumulative Dauer der Schritte 2.1-2.4 zusätzlich zu Schritt 2.5 oder Schritt 2.6.
<ol><li>Herstellung von zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h 30 min) HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Biosicherheitskabine durch.<ol>
<li>Pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte werden 2,5 ml der Zellklebelösung (22,4 μg/ml, siehe Materialtabelle) hergestellt, indem 56 μg des Zellklebers in einem geeigneten Volumen filtersterilisiertes 0,1 M Natriumbicarbonat (pH 8,0) gelöst und sofort 1 N Natriumhydroxid bei halbem Volumen des verwendeten Zellklebstoffs zugegeben werden. Vortex oder Pipette auf und ab pipettieren, um zu mischen.</li>
		<li>Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte (im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten) und dosieren Sie 25 μL der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 min bei Raumtemperatur in der Haube.</li>
		<li>Entfernen und verwerfen Sie nach der Inkubation überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 μL sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte an der Luft, wobei der Deckel entfernt wurde, in der Kapuze für 30-45 min. HINWEIS: Zellkleberbeschichtete Zellkultur-Mikrotiterplatten können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Vorbeschichtete Mikrotiterplatten, die bei 4 °C gelagert werden, müssen vor dem Aussäen der Zellen auf Raumtemperatur in der Haube erwärmt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufbereitung von Assay-Medien (Schrittzeit: ~30 min)<ol>
<li>Erstellung von Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium<ol>
<li>Ergänzen Sie 100 mL Basismedium (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 200 mM L-Glutamin. HINWEIS: Die endgültige L-Glutaminkonzentration im Assay-Medium beträgt 2 mM.</li>
			<li>Das mit L-Glutamin versetzte Medium im Wasserbad auf 37 °C erwärmen.</li>
			<li>Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.</li>
			<li>Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und halten Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Erstellung von mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium<ol>
<li>Ergänzen Sie 100 ml des Basismediums mit 0,45 g Glukose, 1 ml 200 mM L-Glutamin und 1 ml 100 mM Natriumpyruvat. HINWEIS: Das endgültige Assay-Medium enthält 25 mM Glukose, 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat.</li>
			<li>Erwärmen Sie Glukose, L-Glutamin und das mit Natriumpyruvat versetzte Medium bis 37 °C in einem Wasserbad.</li>
			<li>Stellen Sie den pH-Wert des warmen Mediums mit 1 N NaOH auf 7,4 ein.</li>
			<li>Filtersterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter und lagern Sie es bei 37 °C, bis es gebrauchsfertig ist.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Ernte von Maus-Linien-negativen HSPCs (Schrittzeit: ~3 h)<ol>
<li>Bereiten Sie den Assay-Puffer vor, indem Sie Hank's ausgewogene Salzlösung mit 4% fetalem Rinderserum ergänzen. Bereiten Sie den 1x-Anreicherungspuffer vor, indem Sie den 5x-Bestand mit sterilem destilliertem Wasser verdünnen. Halten Sie beide Puffer bis zum Gebrauch auf Eis.</li>
		<li>Euthanasieren Sie Mäuse auf humane Weise mit CO2, gefolgt von zervikaler Dislokation und entfernen Sie die Hinterbeine mit einer Schere. Entfernen Sie vorsichtig alle Gewebe von den Knochen und schneiden Sie die Enden von beiden Seiten des Femurs und der Tibia mit einer Schere. Spülen Sie Knochenmarkzellen aus dem Femur und der Tibia mit dem Assay-Puffer aus. Führen Sie die gespülten Zellen durch einen sterilen 70-μm-Filter, zentrifugieren Sie das Filtrat bei 200 × g für 5 min bei 4 ° C und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Die roten Blutkörperchen werden lysiert, indem das Zellpellet in 500 μL ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2)resuspendiert wird. Nach der Lyse für 1 min auf Eis waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer und zentrifugieren Sie bei 200 × g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Nach dem Waschen inkubieren Sie die Proben mit einem Cocktail aus biotinylierten Antikörpern, die gegen CD2 (1:200-Verdünnung), CD3 (1:200-Verdünnung), CD5 (1:200-Verdünnung), CD8 (1:200-Verdünnung), Ter-119 (1:200-Verdünnung), B220 (1:200-Verdünnung) und Gr-1 (1:800-Verdünnung) gerichtet sind, für 45 min auf Eis in einem Gesamtvolumen von 500 μL Assay-Puffer.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit 1 ml Assay-Puffer mit Zentrifugation wie oben.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben mit 20 μL Streptavidin-Nanokügelchen und 100 μL 1x Anreicherungspuffer auf Eis für 15 min.</li>
		<li>Waschen Sie die Proben mit 1 ml 1x Anreicherungspuffer mit Zentrifugation wie oben.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Proben in 2,5 ml 1x Anreicherungspuffer. Legen Sie sie für 5 min auf einen Trennmagneten. Sammeln Sie die Überstände separat in 15 ml konischen Röhrchen.</li>
		<li>Magnetgetrennte Proben in einem zusätzlichen 1-fachen Anreicherungspuffer von 2,5 ml suspendieren und für 5 min wieder auf den Trennmagneten legen. Überstände sammeln und kombinieren Sie die vorherigen Sammlungen in 15 ml konischen Röhrchen aus Schritt 2.3.9. HINWEIS: Die Überstände enthalten die liniennegativen Zellanteile.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die 15 ml konischen Röhrchen mit den negativ ausgewählten Zellen für 5 min bei 200 × g bei 4 °C.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellpellets in 1 ml Assay-Puffer und zählen Sie die Zellzahl mit trypan blue manuell oder über einen automatisierten Zellzähler wie eine Countess 3. HINWEIS: Nach dem oben beschriebenen Ansatz sollten ~ 6 ×10 6 liniennegative HSPCs leicht von den Hinterbeinen einer einzelnen Maus gereinigt werden. Wenn Reagenzien wie Assay-Puffer, 1x-Anreicherungspuffer und Lineage-spezifischer Antikörpercocktail am Tag vor dem Experiment hergestellt werden, dauert es ungefähr 2,5-3 Stunden, um HSPCs von 4 Mäusen anzureichern. Es würde zusätzliche 10 Minuten für jede Maus über diese Zahl hinaus dauern.</li>
	</ol></li>
	<li>Seeding-Zellen in zellklebebeschichteten Mikrotiterplatten (Schrittzeit: ~1 h)<ol>
<li>Zentrifugenzellen aus Schritt 2.3.12 bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet im entsprechenden Assay-Medium (Glykolyse-Stresstestmedium oder mitochondriales Stresstestmedium). Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.4.2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium bis zur Konzentration von 2,5 × 10 5 Zellen pro 50 μL oder5 × 106 pro ml.</li>
		<li>Pipette 50 μL der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur. Pipette 50 μL des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmesstöpfe. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette für die Zellbeschichtung, um Konsistenz zu gewährleisten.</li>
		<li>Erstellen Sie eine Zentrifugenbilanzplatte, indem Sie 50 μL Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen in der Platte bei 200 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Bremsen Sie nicht. Überführen Sie die Platte für 25-30 min in einen Nicht-CO2 37 °C Inkubator, um sicherzustellen, dass die Zellen vollständig angeschlossen sind. Bestätigen Sie visuell unter dem Mikroskop, dass die Zellen stabil auf der Mikrotiterplattenoberfläche haften. HINWEIS: Da ~ 6 × 106 lineage-negative HSPCs aus den Hinterbeinen einer einzelnen Maus geerntet werden können, werden HSPCs, die von 4 Mäusen (~ 2,4 × 107 Zellen) isoliert wurden, benötigt, um eine ganze 96-Well-Platte zu füllen, wenn das Ziel darin besteht, mehrere Interventionen ex vivo parallel zu screenen. Wenn es jedoch darum geht, die Auswirkungen einer genetischen Veränderung oder eines Eingriffs auf die metabolischen Parameter von HSPCs in vivo zu untersuchen, können HSPCs, die aus mehreren Paaren von Kontroll- und Testmäusen isoliert wurden, in mehreren technischen Replikaten parallel mit einer einzigen Platte analysiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung eines Glykolyse-Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)<ol><li>Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen<ol>
<li>Es werden 100 mM Glukose, 20 μM Oligomycin und 500 mM 2-DG-Lösungen in vorgewärmtem Glykolyse-Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt. HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 10 mM für Glukose, 2 μM für Oligomycin und 50 mM für 2-DG (siehe Tabelle 1).</li>
			<li>Entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Nicht-CO2 37 °C-Inkubator aus Schritt 1.1.5. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Kalibrant in der Gebrauchsplatte, indem Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant herausheben und auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant ersetzen.</li>
			<li>Platzieren Sie die A/D-Ladeführung flach (im extrazellulären Flux-Assay-Kit enthalten) auf der Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe "A" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse A zum Laden zur Verfügung stehen. Mit einer Mehrkanalpipette 20 μL 100 mM Glucoselösung in Port A dosieren.</li>
			<li>Ersetzen Sie die A/D-Ladeführung flach durch die B/C-Ladeführung flach und orientieren Sie sich so, dass sich der Buchstabe "B" in der oberen linken Ecke befindet, um sicherzustellen, dass nur Anschlüsse B zum Laden verfügbar sind. Mit einer Mehrkanalpipette 22 μL 20 μM Oligomycinlösung in Port B dosieren.</li>
			<li>Richten Sie die B/C-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben "C" in der oberen linken Ecke für Ladeanschlüsse C zu finden. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 25 μL 500 mM 2-DG-Lösung in Ports C.</li>
			<li>Entfernen und entsorgen Sie die Ladeführungsflats. HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.</li>
		</ol></li>
		<li>Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen<ol>
<li>Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.</li>
			<li>Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.</li>
			<li>Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion (Glukose, Oligomycin und 2-DG) die Anzahl der Messzyklen auf 3 und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min ein (siehe Tabelle 2). </li>
			<li>Entfernen Sie den Deckel von der mit Compounds beladenen und hydratisierten Sensorpatrone, die in Kalibrant in die Utility-Platte eingetaucht ist. Legen Sie es auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussanalysators und beginnen Sie den Lauf. HINWEIS: Der erste Schritt ist die Kalibrierung, die normalerweise ~ 20 Minuten dauert.</li>
			<li>Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den Zellen aus dem Nicht-CO 2 37 °C Inkubator aus Schritt 2.4.6 heraus, nachdem 25-30 min Inkubation vorbei ist. Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 μL des vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmediums (pH 7,4) pro Vertiefung hinzu, um das Mediumsvolumen in jeder Vertiefung auf 180 μL zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15-20 min in den Nicht-CO2 37 °C-Inkubator zurück. HINWEIS: Eine Gesamtinkubationszeit von 45-60 min nach der Zentrifugation wird bevorzugt.</li>
			<li>Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Utility-Platte durch die Assay-Mikroplatte (ohne Deckel), die die Zellen enthält. Drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten, die ~ 1,5 Stunden für den Abschluss des Assays benötigen.</li>
			<li>Nachdem die Messungen abgeschlossen sind, sammeln Sie die Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und entfernen Sie das Assay-Medium, ohne die Zellen zu stören. Einmal vorsichtig mit 250 μL 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, ohne die Zellen zu verdrängen.</li>
			<li>10 μL RIPA-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na-Desoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), ergänzt mit 1x Proteaseinhibitor-Cocktail, zu jeder Vertiefung geben und die Platte auf einem Shaker für 10 min rühren. Den ganzen Teller bei -80 °C einfrieren.</li>
			<li>Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.</li>
			<li>Abrufen und Analysieren der Daten. Öffnen Sie die Datendatei mit der Wave Desktop Software. Klicken Sie auf Normalisieren und fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein. Klicken Sie auf Übernehmen , um die Daten zu normalisieren. Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Alternativ können Sie die Daten in eine externe Anwendung exportieren. HINWEIS: Alternativ kann der gesamte Kern-DNA-Gehalt in jedem Bohrloch verwendet werden, um die Daten zu normalisieren. Ein fluoreszierender Farbstoff wie CyQuant, der an Nukleinsäure bindet, kann verwendet werden, um den gesamten Kern-DNA-Gehalt pro Bohrloch zu beurteilen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung eines mitochondrialen Stresstests mit dem extrazellulären Flussanalysator (Schrittzeit: ~3 h 30 min)<ol>
<li>Beschickungssensorpatrone mit Injektionsmassen<ol>
<li>Es werden 20 μM Oligomycin, 20 μM FCCP und 5 μM Rotenon + 5 μM Antimycin A-Lösungen in vorgewärmtem mitochondrialem Stresstest-Assay-Medium (pH 7,4) hergestellt. HINWEIS: Alle injizierenden Verbindungslösungen werden in 10-facher Konzentration hergestellt. Die Endkonzentrationen der Vertiefung betragen 2 μM für Oligomycin, 2 μM für FCCP und jeweils 0,5 μM für Rotenon und Antimycin A (siehe Tabelle 3).</li>
			<li>Entfernen Sie die hydratisierte Sensorpatrone aus dem 37 °C Inkubator aus Schritt 1.1.5 und entfernen Sie Luftblasen, wie zuvor in Schritt 2.5.1.2 beschrieben.</li>
			<li>Durch Ausführen der Schritte 2.5.1.3 bis 2.5.1.6 werden 20 μL 20 μM Oligomycin in Port A, 22 μL 20 μM FCCP in Port B und 25 μL einer Mischung aus 5 μM Rotenon und 5 μM Antimycin A in Port C abgegeben. HINWEIS: Es ist wichtig, dass jede Portreihe aller 96 Wells, einschließlich derjenigen der Hintergrundwellen, vollständig mit dem gleichen Volumen der injizierenden Verbindung geladen wird.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vorlagenerstellung, Kalibrierung und Messungen<ol>
<li>Erstellen oder laden Sie die Vorlage für den mitochondrialen Stresstest auf dem Controller. Geben Sie Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu. Weisen Sie die 4 Eckvertiefungen für Hintergrundmessungen zu.</li>
			<li>Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden.</li>
			<li>Für die Baseline-Messung und die Messungen nach jeder Injektion (Oligomycin, FCCP und Rotenon + Antimycin A) legen Sie die Anzahl der Messzyklen auf 3 fest und Mischen - Warten - Messzeiten auf 3 min - 0 min - 3 min (siehe Tabelle 4).</li>
			<li>Starten Sie den Lauf, um die Kalibrierung wie in Schritt 2.5.2.4 durchzuführen.</li>
			<li>130 μL des vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmediums (pH-Wert 7,4) werden wie in Schritt 2.5.2.5 zugegeben.</li>
			<li>Starten Sie die Messungen; Abrufen und Analysieren der Daten wie in den Schritten 2.5.2.6 bis 2.5.2.10. Exportieren Sie die analysierten Daten in den mitochondrialen Stresstestberichtsgenerator oder eine externe Anwendung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+role+in+stemness+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells.</a> Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).</li>
<li>Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).</li>
<li>Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+%28HSPCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs).</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).</li>
<li>Ito, K., Suda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+requirements+for+the+maintenance+of+self-renewing+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).</li>
<li>Norddahl, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulating+mitochondrial+DNA+mutations+drive+premature+hematopoietic+aging+phenotypes+distinct+from+physiological+stem+cell+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-independent+methods+reveal+elevated+mitochondrial+mass+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodamine-123+staining+in+hematopoietic+stem+cells+of+young+mice+indicates+mitochondrial+activation+rather+than+dye+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux.</a> Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).</li>
<li>Filippi, M. D., Ghaffari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+maintenance+of+hematopoietic+stem+cells%3A+new+perspectives+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities.</a> Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+defects+modulate+differentiation+but+not+proliferation+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+metabolic+disorders+-+A+step+towards+mitochondria+based+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).</li>
<li>Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+hematopoiesis+and+hematological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases.</a> Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).</li>
<li>Nadanaciva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+drug-induced+mitochondrial+dysfunction+via+altered+cellular+respiration+and+acidification+measured+in+a+96-well+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%2C+Fourth+Edition%22">Bioenergetics, Fourth Edition</a>. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).</li>
<li>Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2-deoxy-D-glucose+as+a+chemotherapeutic+agent%3A+mechanism+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death.</a> British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Diese Methodenarbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik (Glykolyse und OxPHOS) in Maus-HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse. Dieses Gerät ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das gleichzeitig die ECAR und OCR lebender Zellen misst, bei denen es sich um Metriken der Glykolyse bzw. der mitochondrialen Atmung handelt. So kann es verwendet werden, um die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit zu beurteilen. Darüber hinaus bietet die 96-Well-Microplate-basierte Plattfo...

Hämatopoese ist der Prozess, bei dem verschiedene Arten von reifen Blutzellen mit hochspezialisierten Funktionen aus HSCs1 gebildet werden. HSCs sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und in verschiedene multipotente und linienspezifische Vorläuferpopulationen zu differenzieren. Diese Vorläufer produzieren letztendlich Zellen von lymphatischen, myeloischen, erythroiden und Megakaryozytenlinien. Um ihre Selbsterneuerungskapazität aufrechtzuerhalten, bleiben HSCs weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie, wie andere Gewebestammzellen, auf Glykolyse und nicht auf mitochondriales OxPHOS für die ATP-Produktion angewiesen sind 2,3. Der Eintritt in den Zellzyklus führt zu einer verbesserten Atmung und OxPHOS, was zu erhöhten Werten an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt, die sich nachteilig auf die HSC-Aufrechterhaltung und -Funktionauswirken 3. Eine wiederholte Zellteilung kann daher zu einer verminderten Selbsterneuerungskapazität von HSCs und letztlich zu deren Erschöpfung führen.
Bei der adulten Hämatopoese durchlaufen HSCs hauptsächlich eine asymmetrische Zellteilung, bei der eine der Tochterzellen das HSC-Potenzial behält und weiterhin auf den glykolytischen Stoffwechsel angewiesen ist. Die andere Tochterzelle wird zu einer primitiven Vorläuferzelle, die die Selbsterneuerungsfähigkeit verliert, sich aber vermehrt und schließlich zu differenzierten funktionellen hämatopoetischen Zellen führt4. Wenn HSCs differenzieren, um nachgeschaltete Vorläufer zu produzieren, wird angenommen, dass ein Wechsel von der Glykolyse zum mitochondrialen Stoffwechsel erfolgt, um die Energie und die Bausteine zu liefern, die zur Unterstützung dieses schnellen Übergangs benötigt werden5, wie die Beobachtungen nahelegen, dass HSCs inaktive mitochondriale Massebesitzen 6,7,8,9 . Im Gegensatz dazu ist die mitochondriale Aktivität (angezeigt durch verknüpfte ROS-Spiegel) bei der Abstammung gebundenen Vorläufer viel höher als bei HSCs 9,10,11. Metabolische Veränderungen, die während des frühesten Schritts der Hämatopoese auftreten, deuten daher auf eine direkte und entscheidende Rolle der Mitochondrien bei der Regulierung des HSC-Schicksals hin.
Dysfunktionale Mitochondrien, die unter verschiedenen Stressbedingungen wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit auftreten 12, können die HSC-Selbsterneuerungskapazität beeinträchtigen und ein Ungleichgewicht in der HSC / Vorläuferdifferenzierung induzieren, indem sie übermäßige Mengen an ROS produzieren, die ATP-Produktion beeinträchtigen und / oder andere Stoffwechselprozesse verändern9,12,13 . Störungen in der metabolischen Homöostase bei der HSC/Vorläufer-Differenzierung könnten die Hämatopoese signifikant beeinflussen und möglicherweise zur Entwicklung hämatogischer Anomalien beitragen13. Angesichts der kritischen Einflüsse von Glykolyse und mitochondrialem OxPHOS auf die HSC-Stammheit und -Differenzierung ist es von Interesse, sowohl metabolische Parameter unter normalen als auch unter Stressbedingungen zu untersuchen. Wertvolle Einblicke in die glykolytische und mitochondriale Funktion von HSCs und Vorläuferzellen können durch die Bewertung ihrer ECAR und OCR gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind.
Der extrazelluläre Flussanalysator von Seahorse ist ein leistungsstarkes Gerät, das mit zwei Sonden pro Bohrung ausgestattet ist, um ECAR und OCR in lebenden Zellen gleichzeitig zu messen und somit zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in Echtzeit als Reaktion auf verschiedene Substrate oder Inhibitoren verwendet werden kann. Die mit dem Analysator verwendete Assay-Kartusche enthält Injektionsanschlüsse, um bis zu vier Medikamente für die automatisierte Injektion während des Assays aufzunehmen. Ein Schema eines typischen Glykolyse-Stresstests ist in Abbildung 1A dargestellt. Der Assay beginnt mit der Messung von ECAR von Zellen, die in Glykolyse-Stresstestmedium inkubiert werden, das Glutamin, aber nicht Glucose oder Pyruvat enthält. Dies stellt eine Versauerung dar, die aufgrund nicht-glykolytischer Aktivitäten der Zellen auftritt, und wird als nicht-glykolytische Versauerung berichtet. Es folgt die Injektion von Glukose in einer gesättigten Konzentration. Über die Glykolyse wird Glukose in der Zelle in Pyruvat umgewandelt, das im Zytoplasma weiter metabolisiert wird, um Laktat zu produzieren, oder in Mitochondrien, um CO 2 und Wasser zu produzieren.
Die Umwandlung von Glukose in Laktat verursacht eine Nettoproduktion und anschließende Freisetzung von Protonen in das extrazelluläre Medium, was zu einem raschen Anstieg des ECAR14,15,16 führt. Diese glukosestimulierte Veränderung der ECAR wird als Glykolyse unter basalen Bedingungen berichtet. Die zweite Injektion besteht aus Oligomycin (einem Inhibitor der ATP-Synthase, auch bekannt als Komplex V17), das die mitochondriale ATP-Produktion hemmt. Während der Oligomycin-vermittelten OxPHOS-Hemmung regulieren die Zellen die Glykolyse maximal, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Dies führt zu einem weiteren Anstieg der ECAR, der die maximale glykolytische Kapazität der Zellen offenbart. Die Differenz zwischen der maximalen glykolytischen Kapazität und der basalen Glykolyse wird als glykolytische Reserve bezeichnet. Schließlich wird 2-DG injiziert, was zu einem signifikanten Rückgang der ECAR führt, in der Regel in der Nähe von nicht-glykolytischen Säuerungsgraden. 2-DG ist ein Glukoseanalogon, das kompetitiv an die Hexokinase bindet, was zu einer Hemmung der Glykolyse18 führt. Somit bestätigt die 2-DG-induzierte Abnahme der ECAR weiter, dass die Glykolyse tatsächlich die Quelle von ECAR ist, die nach Glukose- und Oligomycin-Injektionen beobachtet wurde.
Abbildung 1B zeigt den Schaltplan für einen typischen mitochondrialen Stresstest. Der Assay beginnt mit der OCR-Basismessung der Zellen, die in mitochondrialem Stresstestmedium, das Glukose, Glutamin und Pyruvat enthält, inkubiert werden. Nach basalen OCR-Messungen wird Oligomycin in diesen Assay injiziert, das den Komplex V hemmt und dadurch den Elektronenfluss durch die Elektronentransportkette (ETC) reduziert17. Folglich wird die OCR als Reaktion auf die Oligomycin-Injektion reduziert, und diese Abnahme der OCR ist mit der mitochondrialen ATP-Produktion verbunden. Die zweite Injektion besteht aus Carbonylcyanid-4 (Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP), einem Protonophor und einem Entkoppler des mitochondrialen OxPHOS17. FCCP kollabiert den mitochondrialen Protonengradienten, indem es den Fluss von Protonen durch die mitochondriale innere Membran ermöglicht. Aufgrund der FCCP-Injektion wird der Elektronenfluss durch das ETC unterdrückt, und Komplex IV verbraucht Sauerstoff auf dem maximalen Niveau. Der Unterschied zwischen maximaler OCR und basaler OCR wird als freie Atemkapazität bezeichnet, die ein Maß für die Fähigkeit der Zelle ist, auf einen erhöhten Energiebedarf unter Stressbedingungen zu reagieren. Schließlich wird eine Mischung aus zwei ETC-Inhibitoren (Rotenon, ein Komplex-I-Inhibitor, und Antimycin A, ein Komplex-III-Inhibitor17) injiziert, wodurch der Elektronenfluss vollständig abgeschaltet wird, und die OCR sinkt auf ein niedriges Niveau. OCR, gemessen nach Rotenon und Antimycin A-Injektion entspricht einer nicht-mitochondrialen OCR, die durch andere Prozesse in den Zellen angetrieben wird. Die nicht-mitochondriale OCR ermöglicht die Berechnung der Basalatmung, des Protonenlecks und der maximalen Atmung.
Die Basalatmung stellt den Unterschied zwischen der Baseline-OCR und der nicht-mitochondrialen OCR dar. Protonenleck bezieht sich auf den Unterschied zwischen OCR nach Oligomycin-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR. Die maximale Atmung stellt den Unterschied zwischen OCR nach FCCP-Injektion und nicht-mitochondrialer OCR dar. Die Kopplungseffizienz wird als Prozentsatz der ATP-Produktionsrate zur Basalatmungsrate berechnet. Dieses Methodenpapier enthält ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in liniennegativen HSPCs mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XFe96. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von Mauslinien-negativen HSPCs, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen verschiedener Medikamente, die in extrazellulären Flussassays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m Filter</td><td>Corning</td><td>430626</td><td>Wird zum Filtrieren und Sterilisieren des Assay-Mediums</td></tr><tr><td>verwendet 100 mM Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Bestandteil des mitochondrialen Stresstest-Assay-Mediums</td></tr><tr><td>15 mL konische Falcon-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>352096</td><td>Wird während der HSPC-Ernte und zur Herstellung von Assay-Wirkstofflösungen</td></tr><tr><td>verwendet 200 mM L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Bestandteil des Glykolyse-Stresstests und des mitochondrialen Stresstests Assay-Medien</td></tr><tr><td>2-Desoxy-D-Glukose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>3. Medikamenteninjektion während des Glykolyse-Stresstests</td></tr><tr><td>5x Anreicherungspuffer (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480017</td><td>Wird für Waschungen während der HSPC-Ernte verwendet</td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-3</td><td>Bestandteil der ACK-Lyse Puffer</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>3. Medikamenteninjektion während des mitochondrialen Stresstests</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC Protein Assay Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td>Wird gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>2. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Zellkleber. Wird zur Beschichtung von Zell-Mikrotiterplatten</td></tr><tr><td>verwendet Countes 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td>Komponente des ACK-Lysepuffers und des RIPA-Lysepuffers</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Wird als Zellsieb während der HSPC-Ernte</td></tr><tr><td>verwendet Gibco Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>26400044</td><td>Wird zur Herstellung von Assay-Puffer während der HSPC-Ernte</td></tr><tr><td>verwendet Gibco HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175095</td><td>Wird zur Herstellung von Assay-Puffer während der HSPC-Ernte</td></tr> verwendet <tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Bestandteil des mitochondrialen Stresstest-Assay-Mediums und der ersten Injektion des Glykolyse-Stresstests</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>2. Arzneimittelinjektion während des Glykolyse-Stresstests und 1. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td>Wird zum Waschen von Zellen nach dem Assay zur Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>verwendet Kaliumbicarbonat (KHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P235-500</td><td>Bestandteil des ACK-Lysepuffers</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC)</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Lieferung in Form von Tabletten. Eine Tablette wurde in 10 ml RIPA-Puffer aufgelöst, um 1x PIC herzustellen.</td></tr><tr><td>Ratten-Biotin Antimaus-B220, Klon-ID: RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103203</td><td>Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte</td></tr> verwendet <tr><td>Ratten-Biotin Antimaus-CD2, Klon-ID: RM2-5</td><td>Biolegend</td><td>100103</td><td>Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte</td></tr> verwendet <tr><td>Ratten-Biotin Antimaus-CD3, Klon-ID: 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100243</td><td>Wird für die Abstammungsdepletion während der HSPC-Ernte</td></tr> verwendet <tr><td>Rattenbiotin Antimaus-CD5, Klon ID: 53-7.3</td><td>Biolegend</td><td>100603</td><td>Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Entnahme</td></tr> verwendet <tr><td>Ratten-Biotin Antimaus-CD8, Klon-ID: 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100703</td><td>Wird für die Abstammungsarmierung während der HSPC-Entnahme verwendet Ratten-Biotin</td></tr><tr><td>Antimaus-Gr-1, Klon-ID: RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108403</td><td>Wird für die Abstammungsarmierung während der HSPC-Ernte</td></tr> verwendet <tr><td>Ratten-Biotin Antimaus-Ter-119, Klon-ID: TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116203</td><td>Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Ernte verwendet</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>3. Arzneimittelinjektion während des mitochondrialen Stresstests</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 extrazellulärer Flussanalysator</td><td>Seahorse Biosciences jetzt Agilent</td><td></td><td>Für ECAR- und OCR-Messungen in Echtzeit.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Wird zur Herstellung von Zelladhäsivlösung für die Beschichtung von Mikrotiterplatten</td></tr><tr><td>verwendet Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Bestandteil des RIPA-Lysepuffers</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Bestandteil des RIPA-Lysepuffers</td></tr><tr><td>Natriumfluorid (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td>Bestandteil des RIPA-Lysepuffers</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Hergestellte 1 N Lösung. Wird zur pH-Normalisierung</td></tr><tr><td>verwendet Streptavidin-Nanobeads (MojoSort)</td><td>Biolegend</td><td>480015</td><td>Wird für die Erschöpfung der Abstammungslinie während der HSPC-Ernte verwendet</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>BP153</td><td>Bestandteil des RIPA-Lysepuffers</td></tr><tr><td>XF-Basismedium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Basismedium zur Herstellung von Glykolyse-Stresstests und mitochondrialen Stresstest-Assaymedien</td></tr><tr><td>XF-Vorbereitungsstation</td><td>Seepferdchen Biowissenschaften</td><td></td><td>Wird für Nicht-CO2 37 &deg; C-Inkubationen</td></tr><tr><td>XFe96 extrazelluläres FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100 oder 102601-100</td><td>Enthält Assay-Kartuschen mit Utility-Platten, Ladeleitflächen zum Laden von Medikamenten auf die Assay-Kartusche, XF-Kalibrierlösung und XF-Zellkultur-Mikrotiterplatte</td></tr></tbody></table>

bewertung der zellulären bioenergetik in hämatopoetischen stamm- und primitiven vorläuferzellen der maus mit dem extrazellulären flussanalysator

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Im stationären Zustand bleiben hämatopoetische Stammzellen (HSCs) weitgehend ruhig und es wird angenommen, dass sie überwiegend auf Glykolyse angewiesen sind, um ihren energetischen Bedarf zu decken. Unter Stressbedingungen wie Infektionen oder Blutverlust werden HSCs jedoch proliferativ und produzieren schnell nachgeschaltete Vorläuferzellen, die sich wiederum weiter differenzieren und schließlich reife Blutzellen produzieren. Während dieses Übergangs- und Differenzierungsprozesses verlassen HSCs die Ruhephase und durchlaufen schnell einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung (OxPHOS). Verschiedene Stresszustände wie Alterung, Krebs, Diabetes und Fettleibigkeit können sich negativ auf die mitochondriale Funktion auswirken und somit die metabolische Reprogrammierung und Differenzierung von HSCs und Vorläufern während der Hämatopoese verändern. Wertvolle Einblicke in die glykolytischen und mitochondrialen Funktionen von HSCs und Vorläufern unter Normal- und Stressbedingungen können durch die Beurteilung ihrer extrazellulären Versauerungsrate (ECAR) und Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gewonnen werden, die Indikatoren für die zelluläre Glykolyse bzw. die mitochondriale Atmung sind. 
Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Messung von ECAR und OCR in Mausknochenmark-abgeleiteten liniennegativen Zellpopulationen bereitgestellt, die sowohl hämatopoetische Stamm- als auch primitive Vorläuferzellen (HSPCs) umfassen, mit dem extrazellulären Flussanalysator. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Isolierung von liniennegativen Zellen aus dem Knochenmark der Maus, erklärt die Optimierung der Zellaussaatdichte und der Konzentrationen von 2-Desoxy-D-Glukose (2-DG, ein Glukoseanalogon, das die Glykolyse hemmt) und verschiedener OxPHOS-zielgerichteter Medikamente (Oligomycin, FCCP, Rotenon und Antimycin A), die in diesen Assays verwendet werden, und beschreibt medikamentöse Behandlungsstrategien. Schlüsselparameter des glykolytischen Flusses, wie Glykolyse, glykolytische Kapazität und glykolytische Reserve, und OxPHOS-Parameter wie Basalatmung, maximale Atmung, Protonenleck, ATP-Produktion, freie Atemkapazität und Kopplungseffizienz können in diesen Assays gemessen werden. Dieses Protokoll ermöglicht ECAR- und OCR-Messungen an nicht adhärenten HSPCs und kann verallgemeinert werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren.

Mit diesem Protokoll wurden die Zellzahl und die Konzentrationen verschiedener OxPHOS-Targeting-Medikamente (die in den extrazellulären Flussassays verwendet werden) optimiert, um ECAR und OCR von HSPCs zu messen, die aus 24 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Zunächst wurde der Glykolyse-Stresstest durchgeführt, um die Zellzahl und die Oligomycinkonzentration zu optimieren. In diesem Assay wurde eine unterschiedliche Anzahl von HSPCs pro Bohrloch im Bereich von 5 × 104 bis 2,5 × 105</...

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

Während der Hämatopoese durchlaufen hämatopoetische Stammzellen einen metabolischen Wechsel von der Glykolyse zur oxidativen Phosphorylierung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um glykolytische und mitochondriale Funktionen von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Maus zu beurteilen. Mit dieser Methode kann die zelluläre Bioenergetik in Echtzeit beurteilt werden.Die 96-Well-Microplate-basierte Plattform bietet eine Quantifizierung mit hohem Durchsatz und hoher Empfindlichkeit, die die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben mit einer einzigen Platte ermöglicht. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Chemikalien oder genetischen Manipulationen auf den HSC-Stoffwechsel unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Es kann helfen, Stoffwechselwege aufzuklären, die die HSC-Pluripotenz aufrechterhalten.Obwohl sich die aktuelle Studie hauptsächlich auf hämatopoetische Stämme und Vorläuferzellen der Maus konzentriert, könnten das Protokoll und dieser Ansatz leicht angepasst werden, um die Analysebedingungen für jede Art von Suspensionszellen zu optimieren. Öffnen Sie einen Tag vor dem Assay das extrazelluläre Flussmittel-Assay-Kit, um die Sensorkassette und die Utility-Plate-Baugruppe zu entfernen. Speichern Sie die Ladehilfswohnungen für die Verwendung am nächsten Tag.Trennen Sie nun die Sensorkassette manuell von der Utility-Platte und legen Sie sie kopfüber neben die Utility-Platte. Füllen Sie mit einer Mehrkanalpipette jede Vertiefung der Gebrauchsplatte mit 200 Mikrolitern Kalibrant, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten sind, und legen Sie dann die Sensorpatrone wieder auf die Utility-Platte, wobei Sie sicherstellen, dass die Sensoren vollständig in das Kaliber eingetaucht sind. Dann inkubieren Sie die Gebrauchsplatte mit Kalibrant und montierte Sensorkartusche in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht nach den im Manuskript genannten Befeuchtungsbedingungen.Am Tag des Assays bereiten Sie 2,5 Milliliter der Zellklebelösung pro 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Öffnen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte, die im Lieferumfang des Flux-Assay-Kits enthalten ist, und dosieren Sie 25 Mikroliter der vorbereiteten Zellklebelösung am Boden jeder Vertiefung. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit dem Deckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Haube.Entfernen und entsorgen Sie nach der Inkubation die überschüssige Zellklebelösung mit einer Mehrkanalpipette oder einem Aspirator und waschen Sie jede Vertiefung zweimal mit 200 Mikrolitern sterilem Reinstwasser. Trocknen Sie die Platte ohne Deckel in der Kapuze 30 bis 45 Minuten an der Luft. Zentrifugieren Sie die vorbereiteten negativen HSPCs der Mauslinie bei 200 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in das entsprechende Assay-Medium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal und suspendieren Sie die Zellen im entsprechenden erwärmten Assay-Medium auf die Konzentration von 250.000 Zellen pro 50 Mikroliter oder fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter der Zellsuspension entlang der Seite jeder Vertiefung der mit Zellkleber beschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikrotiterplatte hinzuzufügen, und fügen Sie dann 50 Mikroliter des Assay-Mediums in die Eck-Hintergrundmessquellen hinzu.Erstellen Sie eine Zentrifugenwaagplatte, indem Sie 50 Mikroliter Wasser pro Bohrloch einer unbeschichteten 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Platte in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 25 bis 30 Minuten zur Zellbefestigung.Nach 30 Minuten unter dem Mikroskop visuell bestätigen, dass die Zellen stabil an der Mikroplattenoberfläche haften. Beginnen Sie mit der Vorbereitung aller erforderlichen Lösungen im vorerwärmten Glykolyse-Stresstestmedium, wie im Textmanuskript erwähnt, und entfernen Sie die hydratisierte Sensorkartusche aus dem Inkubator. Heben Sie die Sensorpatrone aus dem Kalibrant heraus und ersetzen Sie sie auf derselben Gebrauchsplatte mit dem Kalibrant, um die Luftblasen zu entfernen.Legen Sie die 80-Ladeführung flach auf die Oberseite der Sensorkassette und richten Sie sie so aus, dass sich der Buchstabe A in der oberen linken Ecke befindet. Dosieren Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter 100-Millimollar-Glucoselösung in Port A.Ersetzen Sie die 80-Ladeführung flach durch die BC-Ladeführung flach und richten Sie den Buchstaben B in der oberen linken Ecke aus. Geben Sie 22 Mikroliter 20 mikromolare Oligomycinlösung in Port B ab.Richten Sie die BC-Ladeführung flach aus, um den Buchstaben C in der oberen linken Ecke für das Laden von Port C zu finden, und geben Sie 25 Mikroliter 500 millimolare 2-Desoxy-d-Glucoselösung in Port C ab.Dann entfernen und entsorgen Sie die Ladeführung flach.Erstellen oder laden Sie nun die Vorlage für den Glykolyse-Stresstest auf der Steuerung. Geben Sie die Details zu Injektionsstrategien, Behandlungsbedingungen und Zelltypen ein und klicken Sie auf Gruppen generieren. Gehen Sie zur Plattenkarte und weisen Sie jeder zu analysierenden Gruppe Vertiefungen zu.Stellen Sie im Protokoll sicher, dass Kalibrierung und Gleichgewicht im Initialisierungsschritt überprüft werden. Stellen Sie für die Basismessung und die Messungen nach jeder Injektion die Anzahl der Messzyklen auf drei ein und mischen, warten, messen Sie die Zeiten auf drei Minuten, null Minuten, drei Minuten. Klicken Sie in der Software auf Start Run.Entfernen Sie den Deckel von der mit Verbindungen beladenen und hydratisierten Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Arbeitsfach des extrazellulären Flussmittelanalysators. Starten Sie den Kalibrierungslauf. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte mit den ausgesäten Zellen aus dem Inkubator.Ohne die Zellen zu stören, fügen Sie langsam 130 Mikroliter des vorgewärmten Glykolyse-Stresstestmediums pro Vertiefung hinzu, um das mittlere Volumen in jedem Vertiefungsraum auf 180 Mikroliter zu erhöhen, und bringen Sie die Platte für weitere 15 bis 20 Minuten in den Inkubator zurück. Klicken Sie in der Software auf Fach öffnen, um das Thermofach von Seahorse zu öffnen. Nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist, ersetzen Sie die Gebrauchsplatte durch diese Assay-Mikroplatte, die die Zellen enthält, und drücken Sie die Wägezellenplatte, um die Messungen zu starten.Entfernen Sie nach Abschluss der Messungen das Assay-Medium von der Platte, ohne die Zellen zu stören, und waschen Sie sie vorsichtig mit 250 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung, ohne die Zellen zu verdrängen. Geben Sie nun 10 Mikroliter Radioimmunpräzipitations-Lysepuffer, ergänzt mit 1X Protease-Inhibitor-Cocktail zu jeder Vertiefung und rühren Sie die Platte auf einem Shaker für 10 Minuten. Den ganzen Teller bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.Tauen Sie die Platte auf und führen Sie einen Proteinmesstest zur Datennormalisierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie, indem Sie die Datendatei mit der Wave-Desktop-Software öffnen. Klicken Sie auf Normalisieren, fügen Sie die Normalisierungswerte für jedes Bohrloch ein und klicken Sie dann auf Übernehmen, um die Daten zu normalisieren.Klicken Sie auf Exportieren und wählen Sie Glykolyse-Stresstest-Berichtsgenerator, um die analysierten Daten in einen Berichtsgenerator zu exportieren. Die nicht-glykolytische Ansäuerungsrate steigt mit zunehmender Zellzahl von 50.000 auf 250.000, steigt aber nur minimal zwischen 200.000 und 250.000. Die Injektion von 10 millimolarer Glukose stimuliert die Glykolyse bei allen Zellzahlen mit einem maximalen Anstieg der ECAR, der bei 250.000 Zellen pro Bohrung beobachtet wird.Die Injektion von zwei Mikromolaren Oligomycin erhöht ECAR jedoch nicht weiter. Die OCR-Daten, die in den gleichen Glykolyse-Stresstests erhalten wurden, zeigen einen signifikanten Abfall nach der Oligomycin-Injektion aufgrund der Komplex-5-Hemmung. Glykolyse-Stresstestparameter wurden berechnet und 250.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Mikromolaren Oligomycin für weitere Studien ausgewählt.Der mitochondriale Stresstest zeigte, dass zwei mikromolare Oligomycin-Injektionen eine signifikante Reduktion der OCR über die Hemmung von Komplex 5 verursachen. FCCP stimuliert OCR in HSPCs in einer dosisabhängigen Weise mit einem maximalen Anstieg an zwei Mikromolaren. Eine Mischung aus 0,5 Mikromolar Rotenon und 0,5 Mikromolar Antimycin A Injektion senkt OCR auf ihr minimales Niveau, das dem nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauch entspricht.Mitochondriale Stresstestparameter wurden berechnet und zwei Mikromolare FCCP wurden für weitere Studien ausgewählt. Angesichts des hohen Durchsatzcharakters dieser Technik könnte das hier beschriebene Protokoll leicht angepasst werden, um eine große Anzahl bioenergetischer Modulatoren in hämatopoetischen Stammzellen, hämatopoetischen Vorläuferzellen und bösartigen hämatopoetischen Zellen zu screenen. Die Seepferdchenanalyse wird in der Literatur häufig verwendet, um den Stoffwechsel in einer Vielzahl von Kontexten in Gegenwart verschiedener Substrate und Inhibitoren zu messen.

assessment-cellular-bioenergetics-mouse-hematopoietic-stem-primitive

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll bietet einen biochemischen Ansatz zur Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von primären leukämischen Zellen mit einem extrazellulären Fluss-Assay. Die Beurteilung des metabolischen Profils dieser Zellen hilft, ihre Bedürfnisse zu charakterisieren, was zu einer personalisierten Therapie führt.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Dieses Video demonstriert die Methode zur Analyse des Energiestoffwechsels in aktivierten menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator. Verschiedene Inhibitoren der Elektronentransportkettenkomplexe beeinflussen die ATP-Synthese, die über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen wird und Einblicke in den Zellstoffwechsel und die Bioenergetik gibt.

Echtzeit-Überwachung des Energiestoffwechsels in humanen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Dieses Protokoll bietet eine kostengünstige Möglichkeit zu isolieren und zu charakterisieren Maus primäre renale tubuläre Zellen, die anschließend südlich kultiviert werden können, um renale biologischen Funktionen ex Vivo, einschließlich der mitochondrialen Bioenergetik zu beurteilen.

Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung der leukämischen Zellen aus dem Knochenmark Leukämie Patienten und Analyse ihrer metabolischen Zustand. Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen könnte dazu beitragen, um die Nachfrage von Primärzellen besser zu charakterisieren und könnte bis zu mehr personalisierte Medizin.

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Lernen Sie die Bewertung zellulärer Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator. Diese Methode ermöglicht Echtzeitmessungen von ECAR und OCR.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator (Video) | JoVE Journal

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Weitere Videos entdecken