Name: Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Lernen Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten ohne Langendorff-Apparatur. Diese Technik minimiert die Ischämiezeit durch in vivo-Perfusion und verbessert die Ausbeute für kardiovaskuläre Forschung.

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Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) und T32 HL134616 (Sturgill und Salyer) unterstützt.

Alle in dieser Studie durchgeführten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Ohio State University in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien genehmigt.
1. Vorbereitung der Lösung
ANMERKUNG: Die Pufferkonzentrationen sind Tabelle 2 zu entnehmen.
<ol><li>Präisolation (bis zu 2 Wochen vor der Myozytenisolierung)<ol><li>Perfusionspufferbasis: Bereiten Sie 1 l Perfusionspufferbasis (NaCl, KCl,NaH2PO4, HEPES, Glucose und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H2O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von 7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.</li>
		<li>Clearing-Puffer: Bereiten Sie 1 l Clearing-Puffer (NaCl, KCl, NaH2 PO 4, HEPES, Glucose, EDTA und BDM) in 1 l hochreinen 18,2 MΩ·cm H2O vor. Stellen Sie vor der 0,22 μm Sterilfiltration einen pH-Wert von7,4 ein. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.</li>
		<li>100 mM CaCl 2 Stammlösung: 1,11 g CaCl 2 werden abgewogen und in 100 ml hochreines 18,2 MΩ·cm H2 O aufgelöst. Bei Raumtemperatur bis zum Tag der Isolierunglagern.</li>
		<li>Liberase-Aliquote: Lösen Sie 5 mg Verdauungsenzyme in 5 ml sterilem, RNase-freiem Wasser auf. 0,8 ml Aliquote herstellen und bis zum Tag der Isolierung bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Laminieren Sie das Geschirr: Tragen Sie 100 μl 40 μg/ml Mauslaminin auf sterile 30-ml-Petrischalen mit Glasboden auf. 30 Minuten einwirken lassen und überschüssiges Laminin entfernen. Legen Sie das Laminin auf eine Petrischale mit UV-Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (laminierte Petrischalen können bis zu 2 Wochen verwendet werden).</li>
		<li>DMEM-Medien: In einer Biosicherheitswerkbank 2,5 ml FBS, 0,5 ml Penicillin-Streptomycin (50 U/ml-50 μg) und 1 ml 500 mM BDM zu 46 ml DMEM geben. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern (Medien können bis zu 2 Wochen verwendet werden).</li>
		<li>M199-Medien: Bereiten Sie 1 l M199-Medien (NaHCO3, HEPES, L-Glutathion, M199, BDM und BSA) in 1 l hochreinem 18,2 MΩ·cm H2O vor. Vor der Sterilfiltration auf pH 7,4 einstellen (0,22 μm Filter). Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.</li>
		<li>500 mM BDM-Vorrat: 0,5 g BDM zu 10 ml hochreinem 18,2 MΩ·cm H2O. Bei 4 °C bis zum Tag der Isolierung lagern.</li>
		<li>Stabilisierende Plattformerstellung: Bilden Sie Spielteig um die Basis der Nadel, die in den Luer-Absperrhahn geschraubt ist. Formen Sie die Petrischale, die das Herz enthält, und stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der richtigen Höhe für die Ventrikelinjektion befindet (~ 5 mm über dem Boden der Schale).</li>
	</ol></li>
	<li>Der Tag der Isolation<ol><li>Perfusionspuffer: Am Tag der Isolierung 9,5 mg MgCl2 auf 100 ml Perfusionspufferbase geben. Vollständig mischen lassen, bevor 30 ml des fertigen Perfusionspuffers entfernt werden, und in eine saubere, 100-ml-Glasflasche mit weitem Mund und Schraubverschluss (Aufschlusspuffer) geben. HINWEIS: Diese Zusätze können am Tag der Isolierung ohne zusätzliche pH-Einstellungen vorgenommen werden, da ihre Zugabe den pH-Wert vernachlässigbar verändert.<ol><li>Entfernen Sie 12 ml Perfusionspuffer und legen Sie ihn zur Seite (Stopppuffer). Gießen Sie die restlichen 58 ml Perfusionspuffer in eine weitere saubere, 100-ml-Weithalsglasflasche mit Schraubverschluss. Lagern Sie den verbleibenden Perfusionspuffer während der gesamten Isolierung bei 37 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Aufschlusspuffer: 7,5 μl 100 mM CaCl2 bis 30 ml Perfusionspuffer für eine Endkonzentration von 25 μM zugeben. Unmittelbar vor der Isolierung 770 μl Liberase in den Aufschlusspuffer geben, um eine Endkonzentration von 26 μg/ml zu erreichen.</li>
		<li>Stopppuffer: 240 mg BSA in 12 ml Perfusionspuffer auflösen. Während der gesamten Isolierung bei 37 °C lagern.</li>
		<li>Clearing-Puffer: Bereiten Sie eine 3-ml-Spritze mit Clearing-Puffer vor und befreien Sie die Nadel von Blasen. Bis zur Isolation auf Eis lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vielfältige Vorbereitung
<ol><li>Reinigen Sie den temperaturgesteuerten Verteiler mit frisch aufbereitetem Perfusionspuffer und achten Sie darauf, dass keine Blasen zurückbleiben. Schrauben Sie mit einem Luer-Lock-Anschluss eine 27-G-Nadel ein und befreien Sie sie von Blasen. Ein geklärter Verteiler ist für eine erfolgreiche Isolierung unerlässlich.</li>
</ol>3. Tierische Vorbereitung
<ol><li>Injizieren Sie der Maus unmittelbar vor der Isolierung intraperitoneal 100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin nach Körpergewicht. Bei diesem Verfahren wurde eine männliche, 4 Monate alte C57Bl/6-Maus verwendet.</li>
	<li>Legen Sie die Maus bei Bedarf auf ein erhitztes OP-Pad, um die Sedierung zu fördern. Zelten Sie die Arme der Maus und kleben Sie die Gliedmaßen und den Schwanzansatz an eine blaue Laborwindel. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch den Rückzug des Zehen-Kneif-Reflexes vollständig betäubt ist. Tragen Sie ein steriles Tuch um den Operationsbereich auf.</li>
</ol>4. Verfahren zur Isolierung von Kardiomyozyten
<ol><li>Legen Sie das Brustbein der Maus frei und schneiden Sie seitlich zur Mittellinie proximal durch die Rippen und zur Achselhöhle. Schneiden Sie das Zwerchfell vorsichtig vollständig durch und achten Sie auf flache Schnitte, um das Herz zu vermeiden. Klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat fest und falten Sie die Rippen nach hinten, um die Brusthöhle freizulegen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig das Perikard aus dem Herzen und schneiden Sie die untere Hohlvene unmittelbar distal des Herzens vollständig durch. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 27-g-Nadel, um 3 ml eiskalten Clearing-Puffer über 1 Minute schnell in den rechten Ventrikel des Herzens zu injizieren.</li>
	<li>Halten Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette fest und ziehen Sie es vom Körper weg, wobei Sie so viel wie möglich von der Aorta freilegen. Klemmen Sie mit einem Hämostat die aufsteigende Aorta fest, achten Sie darauf, die Vorhöfe nicht einzuklemmen, und schneiden Sie das Herz aus der Brust.</li>
	<li>Übertragen Sie das geklemmte Herz schnell auf den Deckel einer Polypropylen-Petrischale mit ca. 10 ml warmem Perfusionspuffer. Setzen Sie das geklemmte Herz in die Stützplattform ein und injizieren Sie mit einer stabilisierten 27-G-Nadel, die am Verteiler befestigt ist, 10 ml temperaturgesteuerten 37 °C-Perfusionspuffer über 5 Minuten in den linken Ventrikel.</li>
	<li>Übertragen Sie das festgeklemmte Herz und die Stützplattform in eine Petrischale mit ca. 5 ml Verdauungspuffer. Tauschen Sie die Eingangsspritzen gegen eine 50-ml-Spritze mit 25 ml Aufschlusspuffer aus.</li>
	<li>Befreien Sie den Verteiler vor der Injektion von Blasen und verbleibendem Perfusionspuffer. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Nadelposition an der linksventrikulären Spitze ein.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um mit einer 50-ml-Spritze 15 Minuten lang temperaturgesteuerten Aufschlusspuffer bei 37 °C in den linken Ventrikel zu injizieren. Kontrollieren Sie die Temperatur der Lösung mit einem Wassermantel, der zuvor so kalibriert wurde, dass er eine 37 °C-Lösung am Ende der Nadel ausstößt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Ventrikel aus den Vorhöfen und geben Sie sie in ein 10-ml-Becherglas. Geben Sie 3 ml Verdauungspuffer in das Becherglas und schneiden Sie die Ventrikel mit einer scharfen Schere in große Stücke. Das Becherglas mit Alufolie abdecken und 5 min in ein auf 37 °C vorgeheiztes Schüttelwasserbad stellen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, dass keine Gewebestücke entfernt werden. Resuspendieren Sie die Gewebebrocken in 3 ml Aufschlusspuffer und triturieren Sie sie etwa 4 Minuten lang oder bis eine homogene Mischung erreicht ist.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellen durch ein 70-μm-Nylon-Zellsieb in ein 50-ml-Polypropylenröhrchen.</li>
	<li>Das Filtrat wird in ein 14-ml-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden zurückgeführt und 1 Minute lang bei 100 U/min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 3 ml Stopppuffer.</li>
	<li>Geben Sie 54 μl 100 mM CaCl 2 -Bestand in die resuspendierten Zellen, um eine endgültige CaCl2-Konzentration von 1,8 mM zu erreichen. Dieser Schritt kann auch schrittweise durchgeführt werden, um die Zellausbeute zu erhöhen.</li>
	<li>Lassen Sie lebende Zellen 10 Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, bevor Sie den Überstand mit den toten Zellen entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in Lagerlösung (Perfusionslösung mit 200 μM CaCl2). Diese Zellen können nun für funktionelle Experimente (z. B. Kalzium-Bildgebung/-Kontraktion, Patch-Klemme usw.), Kulturen usw. verwendet werden. HINWEIS: Die Zellen können auch in labor- oder experimentabhängigen Lösungen resuspendiert werden.</li>
</ol>5. Zellkultur
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder mit einem gerasterten Deckglas. Da Myozyten sehr groß sind, ist die Zählung mit einem Hämozytometer nicht immer genau. Dies wird verwendet, um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie viele Zellen ungefähr aus der Isolierung gewonnen wurden.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-Medien auf ~25.000 Zellen/ml. Geben Sie 1 ml Zelllösung in jede Vertiefung.</li>
	<li>Inkubation bei 37 °C, 95 % O 2, 5 % CO 2 für2 h.</li>
	<li>Saugen Sie DMEM-Medien vorsichtig aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie 2 ml M199-Medien hinzu.</li>
	<li>Inkubation bei 37 °C, 95% O 2, 5% CO2 für bis zu 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
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</ol>

Es müssen keine Interessenkonflikte offengelegt werden.

Der Hauptvorteil unserer Langendorff-freien Kardiomyozyten-Isolationstechnik besteht darin, dass sie Hypoxie und ischämische Zeit begrenzt, da keine Kanülierung an einem Langendorff-Gerät erforderlich ist. Alternativ zu den klassischen Langendorff-Techniken, die mehrere Minuten benötigen, um das Herz zu entfernen, zu reinigen und aufzuhängen, was oft zu einer ischämischen Schädigung der Myozyten führt, beinhaltet unsere Methode eine In-vivo-Reinigung des Blutes über eine eiskalte Reinigungslösung. Der e...

Eine wesentliche Idee in der herzbiologischen Literatur ist seit Jahrzehnten der molekulare Wirkmechanismus. Der Wirkmechanismus muss etabliert sein, um verlässliche Studien zu veröffentlichen. Eine gut etablierte Strategie zur Bestimmung molekularer Mechanismen sind isolierte Kardiomyozytenstudien, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten benötigen, um vertrauenswürdige Daten zu erhalten. Zelluläre und molekulare Experimente, die an Kardiomyozyten durchgeführt werden, um den Wirkmechanismus zu bestimmen, sind der Goldstandard für die Untersuchung von Kontraktion1, Elektrophysiologie2, Calcium (Ca 2+) -Zyklus3, Myofilament Ca2+ Sensitivität4, Zytoskelett5, Metabolismus6, Wirkungen von Hormonen7, Signalmoleküle8, Arzneimittelstudien9 etc. Die Maus ist aufgrund der Leichtigkeit der genetischen Manipulation, ihrer geringen Größe, ihrer relativ kurzen Lebensdauer, ihrer geringen Kosten usw. zur Spezies der Wahl für die meisten herzbiologischen Experimente geworden10. Die zuverlässige Isolierung hochwertiger Maus-Kardiomyozyten ist jedoch mit den derzeitigen Techniken nicht trivial.
Labore isolieren Kardiomyozyten seit fast 70 Jahren11. Praktisch alle Techniken zur Isolierung von Kardiomyozyten beruhen auf der Verdauung des Herzens über verschiedene Enzyme (Kollagenase, Protease, Trypsin usw.). In den frühen Perioden (1950er bis 1960er Jahre) wurde die Chunk-Methode angewendet, bei der das Herz entfernt, in viel kleinere Stücke geschnitten und in Lösung mit Kollagenase / Protease / Trypsin12 inkubiert wurde. In den 1970er Jahren implementierten Labore die verbesserte "Langendorff"-Methode13, bei der Kardiomyozyten mit einer auf Koronararterienperfusion basierenden Isolationstechnik isoliert wurden (retrograde Perfusion mit Enzym über den Langendorff-Apparat); Diese Technik ist auch heute noch die dominierende Methode der Myozytenisolierung auf diesem Gebiet, ~50 Jahre später14,15,16. Neuere Arbeiten haben sich auf die Kanülierung des Herzens in vivo verlagert, um die Hypoxiezeit und ischämische Schäden zu begrenzen, was zu überlegenen Kardiomyozytenisolierungen (bessere Ausbeute und höhere Qualität) führt17. In jüngster Zeit hat sich dies zu einer in vivo durchgeführten Langendorff-freien Herzperfusion entwickelt 18,19,20,21,22. Wir haben die Langendorff-freie Kardiomyozyten-Isolationstechnik auf Basis der Technik von Ackers-Johnson et al.18 weiterentwickelt und verschiedene Komponenten aus den vielen bisherigen Isolationstechniken adaptiert. Zu diesen wichtigen Anpassungen gehören die Injektion eines eiskalten Clearing-Puffers und der Einbau einer Stützplattform zur Stabilisierung der Nadel, die eine verringerte Manipulation des Herzens ermöglicht. Ebenfalls detailliert in dieser Technik ist die Temperaturkontrolle der injizierten Puffer (37 °C), die die Zeit zwischen In-vivo-Injektion und Aufschluss aufgrund einer geringeren EDTA-Perfusion verkürzte, wie zuvor veröffentlicht18. Durch die Verringerung der Manipulation des Herzens und damit die Minimierung der Größe der Einstichstelle wird eine gründliche und konstante Durchblutung der Koronararterien erreicht. Wir verfeinerten die Technik auch mit einem sekundären Chunk-Aufschluss, der Menge an EDTA im injizierten Clearing-Puffer und änderten den pH-Wert. Unsere beschriebene Technik ist zuverlässiger, effizienter und erfordert im Vergleich zur Verwendung des Langendorff-Geräts keine umfangreiche Ausbildung/Übung (Tabelle 1).

<table><tbody><tr><td>10 cc Bd Luer-Lok Spritze</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pyrex Becherglas</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL Polypropylen-Verschluss Glas-Medienaufbewahrungsflasche</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Reagenzgläser aus Polypropylen mit rundem Boden und Kappe</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandion-Monoxim</td><td>Sigma</td><td>B0753></td><td>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok Spritze</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschalen</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL BD Spritze ohne Nadel</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Space Gel Heizkissen</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 g x 1/2" Injektionsnadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A3803</td><td>Hitzeschockfraktion, lyophilisiertes Pulver, im Wesentlichen fettsäurefrei, >98%</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>C7902></td><td>99%</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Geeignet für Zellkulturen, >99,5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-behandelte Zellkulturschale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp beheizte Tauchzirkulatoren</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Mosquito Hämostatische Pinzette</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Hy-Lite Zählkammer-Set</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99,5%</td></tr><tr><td>Beschriftungsband</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Spritzenpumpe</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutathion</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Research Grade</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>Hohe Thermolysinkonzentration</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Maus Laminin</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>Stift / Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>Präzisionsdigitales reziprokes Wasserbad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Geeignet für Zelle Kultur</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S5886></td><td>99%</td></tr><tr><td>Natriumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Steriles Zellsieb 70 &micro; m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Student Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>VWR Saugfähige Unterlage</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

eine einfache und effektive methode zur konsistenten isolierung von maus-kardiomyozyten

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Der Bedarf an reproduzierbaren und technisch einfachen Methoden, die qualitativ hochwertige Kardiomyozyten liefern, ist für die Forschung in der Herzbiologie von entscheidender Bedeutung. Zelluläre und molekulare funktionelle Experimente (z. B. Kontraktion, Elektrophysiologie, Kalziumzyklus usw.) an Kardiomyozyten sind der Goldstandard für die Etablierung von Krankheitsmechanismen. Die Maus ist die Spezies der Wahl für funktionelle Experimente und die beschriebene Technik ist speziell für die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten. Bisherige Methoden, die einen Langendorff-Apparat erfordern, erfordern ein hohes Maß an Training und Präzision für die Aortenkanülierung, was häufig zu einer Ischämie führt. Das Feld verlagert sich hin zu Langendorff-freien Isolationsmethoden, die einfach und reproduzierbar sind und lebensfähige Myozyten für die physiologische Datenerfassung und Kultur liefern. Diese Methoden verkürzen die Ischämiezeit im Vergleich zur Aortenkanülierung erheblich und führen zu zuverlässig erhaltenen Kardiomyozyten. Unsere Anpassung an die Langendorff-freie Methode umfasst eine initiale Perfusion mit eiskalter Clearing-Lösung, die Verwendung einer stabilisierenden Plattform, die eine stabile Nadel während der Perfusion gewährleistet, und zusätzliche Verdauungsschritte, um zuverlässig gewonnene Kardiomyozyten für den Einsatz in funktionellen Messungen und Kulturen zu gewährleisten. Diese Methode ist einfach und schnell durchzuführen und erfordert wenig technisches Geschick.

Es gibt einige Elemente, die bei der Bestimmung des Erfolgs einer Isolation zu berücksichtigen sind. Erstens müssen die Kardiomyozyten stäbchenförmig sein und keine Membranbläschen aufweisen, wie die in Abbildung 1 isolierten Zellen. Eine typische Isolierung ergibt ~80% der Myozyten, die stäbchenförmig sind. Wenn die Isolierung weniger als 50% stäbchenförmige Zellen ergibt, wird dies als erfolglose Isolierung angesehen und Kardiomyozyten werden nicht verwendet. Schließlich sollten die Kardio...

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Diese Technik ist zuverlässiger und effizienter und erfordert im Vergleich zu den am häufigsten verwendeten Langendorff-Gerätetechniken keine umfangreiche Übung oder Ausbildung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die ischämische Zeit begrenzt, da die anfängliche Perfusion in vivo stattfindet. Bei dieser Technik ist es wichtig, Blasen im Verteiler zu vermeiden und eine übermäßige Bewegung des Herzens während der Verdauung zu vermeiden, da diese die Ausbeute verringern können.Diese Technik wird Sarah Sturgill, eine Doktorandin im Labor von Dr. Mark Ziolo, demonstrieren. Beginnen Sie mit der Reinigung des temperaturgesteuerten Verteilers mit frisch vorbereitetem Perfusionspuffer. Schrauben Sie dazu eine 27-Gauge-Nadel ein und entfernen Sie die Blasen mit einem Luer-Lock-Anschluss.Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zurückbleiben. Um den Kardiomyozyten zu isolieren, legen Sie das Brustbein der vollständig anästhesierten Maus frei und schneiden Sie seitlich zur Mittellinie proximal durch die Rippen und zur Achselhöhle. Schneiden Sie dann durch das Zwerchfell und achten Sie auf flache Schnitte, um das Herz zu vermeiden.Klemmen Sie das Brustbein mit einem Hämostat fest und falten Sie die Rippen nach hinten, um die Brusthöhle freizulegen. Entfernen Sie das Perikard vorsichtig aus dem Herzen, bevor Sie die untere Hohlvene unmittelbar distal des Herzens durchtrennen. Injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel über eine Minute drei Milliliter eiskalten Clearing-Puffer in den rechten Ventrikel des Herzens.Als nächstes halten Sie das Herz mit einer Pinzette. Ziehen Sie es vom Körper weg und legen Sie so viel wie möglich von der Aorta frei. Klemmen Sie dann die aufsteigende Aorta mit einem Hämostat fest und schneiden Sie das Herz heraus.Übertragen Sie das geklemmte Herz schnell auf den Deckel einer Polypropylen-Petrischale, die 10 Milliliter warmen Perfusionspuffer enthält. Legen Sie das festgeklemmte Herz in die Stützplattform und injizieren Sie 10 Milliliter temperaturgesteuerten Perfusionspuffer bei 37 Grad Celsius über fünf Minuten in den linken Ventrikel mit einer stabilisierten 27-Gauge-Nadel, die am Verteiler befestigt ist. Als nächstes überführen Sie das eingespannte Herz und die Stützplattform in eine Petrischale mit etwa fünf Millilitern Verdauungspuffer.Tauschen Sie Eingangsspritzen gegen eine 50-Milliliter-Spritze aus, die 25 Milliliter Aufschlusspuffer enthält. Befreien Sie den Verteiler vor der Injektion von Blasen und dem verbleibenden Perfusionspuffer. Setzen Sie die Nadel vorsichtig in die gleiche Nadelposition an der linksventrikulären Spitze ein.Mit Hilfe einer Perfusionspumpe spritzen Sie mit einer 50-Milliliter-Spritze 15 Minuten lang 37 Grad Celsius Aufschlusspuffer in den linken Ventrikel. Kontrollieren Sie die Temperatur der Lösung mit einem Wassermantel, der so kalibriert ist, dass er eine Lösung von 37 Grad Celsius ausstößt. Entfernen Sie die Ventrikel aus den Vorhöfen, bevor Sie sie in ein 10-Milliliter-Becherglas geben.Drei Milliliter Verdauungspuffer in das Becherglas geben und die Ventrikel mit einer scharfen Schere in große Stücke schneiden. Decken Sie das Becherglas mit Alufolie ab und legen Sie es fünf Minuten lang in ein auf 37 Grad Celsius vorgeheiztes Schüttelwasser. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Gewebebrocken in drei Millilitern Verdauungspuffer und trituieren Sie ihn etwa vier Minuten lang oder bis eine homogene Mischung erreicht ist.Wenn Sie fertig sind, filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen. Waschen Sie das Nylonzellsieb mit drei Millilitern Aufschlusspuffer. Geben Sie das Filtrat in ein 14-Milliliter-Polypropylenröhrchen mit rundem Boden zurück und zentrifugieren Sie es.Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in drei Milliliter Stopppuffer resuspendieren. Fügen Sie der Zellsuspension 54 Mikroliter 100 millimolaren Calciumchlorid-Brühe hinzu, um die endgültige Calciumchloridkonzentration auf 1,8 Millimolar zu erhöhen. Lassen Sie die lebenden Zellen 10 Minuten ruhen und entfernen Sie den Überstand mit den toten Zellen.Nach der Resuspendierung des Pellets in einer Speicherlösung können die Zellen für funktionelle Experimente und Kulturen verwendet werden. Hellfeldmikroskopische Aufnahmen von isolierten Zellen zeigten, dass die Isolierung von Maus-Kardiomyozyten stäbchenförmige ruhende Zellen ohne Membranbläschen oder abgerundete Kanten erzeugte. Die Zellen zeigten eine Ausbeute von etwa 80% und hohe Überlebensraten, die den Erfolg der Isolationstechnik bestimmten.Für eine erfolgreiche Isolierung ist es am wichtigsten, die Blasen aus dem Verteiler zu entfernen und die Nadel in dasselbe Loch im Herzen einzuführen. Einmal isoliert, können die Kardiomyozyten für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Dieses Protokoll wird verwendet, um einzelne vorhofflische Kardiomyozyten aus dem erwachsenen Mausherz mit einem Chunk-Verdauungsansatz zu isolieren. Dieser Ansatz wird verwendet, um rechte oder linke Vorhoffleine myozyten zu isolieren, die verwendet werden können, um Vorhoffleine Myozytenelektrophysiologie in Patch-Clamp-Studien zu charakterisieren.

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.

Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Dieses Protokoll beschreibt Modifikationen der Langendorff-Methode einschließlich der Tiefe der Aortenkanülierung zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen.

Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Lernen Sie eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten ohne Langendorff-Apparatur. Diese Technik minimiert die Ischämiezeit durch in vivo-Perfusion und verbessert die Ausbeute für kardiovaskuläre Forschung.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

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