Name: Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie die paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Charakterisierung von Selbstassoziationen intrinsisch ungeordneter Proteine mittels NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die atomare Auflösung dynamischer Zustände.

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Wir danken Dr. Jinfa Ying und Dr. Kristin Cano für hilfreiche Gespräche und technische Unterstützung. DSL ist ein St. Baldrick's Scholar und bedankt sich für die Unterstützung der St. Baldrick's Foundation (634706). Diese Arbeit wurde teilweise von der Welch Foundation (AQ-2001-20190330) an DSL, dem Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant an DSL), UTHSA Start-Up Funds an DSL und einem Greehey Graduate Fellowship in Children's Health an CNJ unterstützt. Diese Arbeit basiert auf Forschungsarbeiten, die in den Structural Biology Core Facilities durchgeführt werden, die Teil der institutionellen Forschungskerne am Health Science Center der University of Texas in San Antonio sind und vom Büro des Vizepräsidenten für Forschung und der Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174) unterstützt werden.

Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und freigegeben. Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Eine Methode zur Charakterisierung transienter Wechselwirkungen, die bei niedrigen Populationen zwischen intrinsisch ungeordneten Proteinen und verschiedenen Bindungspartnern bestehen, wurde mittels PRE vorgestellt. Im gezeigten Beispiel ist das Protein selbstassoziierend, so dass die PRE aus einer Kombination von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen entstehen kann. Diese Methode lässt sich leicht auf heterogene Proben ausdehnen, bei denen die Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Proteinen charakterisiert...

Intrinsische Störung (ID) beschreibt Proteine (IDPs) oder Regionen innerhalb von Proteinen (IDRs), die sich nicht spontan zu stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen falten, sondern biologisch aktiv sind. Im Allgemeinen besteht die Funktion von IDP/IDRs darin, spezifische, aber reversible Wechselwirkungen mit Biomolekülen unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen1. Somit sind IDPs und IDRs an einer Reihe von zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Rekrutierung, Organisation und Stabilisierung von Multi-Protein-Komplexen, z. B. der Assemblierung und Aktivität des Spleißosoms2, der Rekrutierung und Organisation von Komponenten an den Stellen der DNA-Schädigung3, der Organisation und Stabilisierung der Rekrutierung von Transkriptionskomplexen4 oder des Chromatin-Remodelers BAF5. Darüber hinaus werden IDPs an Signalknoten gefunden, wo ihre Promiskuität für verschiedene Bindungspartner es ihnen ermöglicht, den Informationstransfer durch zelluläre Proteinnetzwerke zu vermitteln6. Neuere Arbeiten haben auch gezeigt, dass IDR-Regionen dazu neigen, sich selbst zu assoziieren und biomolekulare Kondensate durch den Prozess der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung zu bilden7. Viele der oben erwähnten Funktionen, die ID betreffen, werden heute auch mit einem Aspekt der Kondensatbildung in Verbindung gebracht8. Trotz der Bedeutung von ID für die Assemblierung, Stabilisierung, Gerüstbildung und Signaltransduktion biomolekularer Komplexe sind die atomaren Details ihrer spezifischen Wechselwirkungen schwer zu identifizieren, da IDPs und IDRs in der Regel nicht für strukturelle Untersuchungen mit Röntgenkristallographie oder kryogener Elektronenmikroskopie geeignet sind.
Die Kernspinresonanz (NMR) ist eine ideale Technik zur Untersuchung der ID, da sie nicht vom Vorhandensein starrer oder homogener Strukturensembles abhängt, sondern über die unmittelbare lokale Umgebung einzelner Kerne berichtet. Die Resonanzfrequenz oder chemische Verschiebung eines Kerns in einem bestimmten Molekül wird durch schwache Magnetfelder beeinflusst, die durch die lokale elektronische Verteilung induziert werden, die wiederum von Bindungslängen, Winkeln, der Nähe anderer Kerne, Wechselwirkungen mit Bindungspartnern und anderen Faktoren abhängt9. So fungiert jeder Kern als einzigartige, ortsspezifische Struktursonde, die empfindlich auf Veränderungen in seiner lokalen chemischen Umgebung reagiert. Trotz dieser Vorteile ist die NMR eine Bulk-Technik, und die beobachtete chemische Verschiebung ist der Durchschnitt aller Umgebungen, die von einem bestimmten Kern beprobt wurden. Eine Reihe von NMR-Techniken, von denen viele in dieser Ausgabe beschrieben werden, wurden entwickelt, um strukturelle, dynamische und kinetische Informationen über hochenergetische, niedrig besiedelte biomolekulare Konformationen zu gewinnen, die in der gemittelten chemischen Verschiebung enthaltensind 10,11. Obwohl sie nur vorübergehend besiedelt sind, sind die Identifizierung und Quantifizierung dieser Zustände wichtig, um die Details der funktionellen Mechanismen zu bestimmen12. Zum Beispiel kann im Fall von IDPs und IDRs das Konformationsensemble verzerrt sein, um bevorzugt Konformationen zu probieren, die für die Bildung von Begegnungskomplexen mit physiologischen Bindungspartnern produktiv sind. Die Detektion dieser Zustände sowie die Identifizierung der restspezifischen inter- und intramolekularen Wechselwirkungen und Dynamiken sind wichtig, um die zugrundeliegenden strukturellen Mechanismen der Proteinfunktion und Komplexbildung zu bestimmen.
Es wird ein Protokoll zur Verwendung der paramagnetischen Relaxationsverstärkung (PRE) NMR zur Untersuchung transienter, niedrig besiedelter Zustände beschrieben, die für die Bildung von IDP/IDR-vermittelten biomolekularen Komplexen wichtig sind13. Dieser Ansatz ist nützlich für die Untersuchung der transienten Protein-Protein-Interaktionen, wie z. B. solche, die den Aufbau von Amyloidfibrillen aus α-Synuclein 14,15 oder die Selbstassoziation von FUS16 fördern, sowie für die Charakterisierung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen, z. B. zwischen Signalproteinen17. Ein Beispiel für eine selbstassoziierende IDP wird vorgestellt, bei der spezifische inter- und intramolekulare Wechselwirkungen zu bevorzugt verdichteten Zuständen sowie zu ortsspezifischen Wechselwirkungen führen, die die Selbstassoziation vorantreiben.
Die PRE entsteht aus der magnetischen dipolaren Wechselwirkung eines Kerns mit einem paramagnetischen Zentrum mit einem isotropen g-Tensor, der üblicherweise in Form eines ungepaarten Elektrons auf einer Nitroxidgruppe oder als paramagnetisches Metallatom18 geliefert wird (Abbildung 1). Während Atome mit anisotropen g-Tensoren auch einen PRE-Effekt erzeugen, ist die Analyse dieser Systeme aufgrund von Störeffekten, die durch die Pseudo-Kontaktverschiebungen (PCS) oder die residuale dipolare Kopplung (RDC) verursacht werden, schwieriger13,19. Die Stärke der Wechselwirkung zwischen einem Kern und dem paramagnetischen Zentrum hängt vom Abstand <r-6> zwischen den beiden ab. Diese Wechselwirkung führt zu einem Anstieg der Kernrelaxationsraten, was zu einer nachweisbaren Linienverbreiterung auch für langreichweitige Wechselwirkungen (~10-35 Å) führt, da das magnetische Moment des ungepaarten Elektrons so stark ist20,21. Die Erkennung von transienten Zuständen mit dem PRE ist möglich, wenn die folgenden beiden Bedingungen erfüllt sind; (1) die transiente Wechselwirkung befindet sich in schnellem Austausch auf der NMR-Zeitskala (beobachtete chemische Verschiebung ist ein populationsgewichteter Durchschnitt der austauschenden Zustände); und (2) der Abstand zwischen Kernen und paramagnetischem Schwerpunkt ist im vorübergehend besiedelten Zustand kürzer als im Hauptzustand11. Die transversale PRE wird Γ2 bezeichnet und aus praktischen Gründen aus der Differenz der transversalenRelaxationsraten von 1 H zwischen einer Probe mit einem paramagnetischen Zentrum und einer diamagnetischen Steuerung berechnet. Für eine eingehende Behandlung der Theorie der PRE und der damit verbundenen Pseudokontaktverschiebungen in schnellen und langsamen Austauschregimen wird der Leser auf die umfassenden Übersichtsarbeiten von Clore und Mitarbeitern13,22 verwiesen. Hier wird nur die Situation betrachtet, in der sich 1HN-Γ 2 im schnellen Austauschregime befindet, wobei aufgrund der r-6-Abhängigkeit des PRE die beobachtete Relaxationsrate sowohl mit der Entfernung, in der sich das paramagnetische Zentrum dem Kern nähert, als auch mit der Zeit, die es in dieser Konformation verbringt, zusammenhängt. Daher erzeugen transiente Konformationen, die keine enge Annäherung beinhalten, eine kleine PRE, während nähere Wechselwirkungen, auch wenn sie nur von kurzer Dauer sind, eine größere PRE erzeugen.
Bei IDPs wird der PRE verwendet, um die Wechselwirkungen innerhalb eines einzelnen Moleküls (intramolekular) und zwischen einzelnen Molekülen (intermolekular) zu messen und zu differenzieren. Durch Anbringen eines paramagnetischen Zentrums an ein sichtbares (z. B. 15N-markiertes) oder NMR-unsichtbares (z. B. natürliches 14N) Protein kann die Quelle (inter- oder intramolekular) des PRE bestimmt werden (Abbildung 2). Die ortsgerichtete Mutagenese, die einen Cysteinrest einführt, ist ein bequemer Ansatz, um ein paramagnetisches Zentrum (Spin-Label) an ein Proteinanzuhängen 23. Es wurden verschiedene Arten von Molekülen für die Verwendung als Spin-Markierungen vorgeschlagen, darunter Metallchelat-Moleküle (EDTA-basiert) und freie Radikale (Nitroxid-basiert)24. Verschiedene Nitroxid-Spin-Markierungen wurden beschrieben und sind mit unterschiedlichen Cystein-reaktiven Chemikalien wie Methanethiosulfonat, Maleimid und Iodacetamid25,26 erhältlich (Abbildung 1). Die inhärente Flexibilität des Tags oder des Linkers kann für bestimmte Analysen problematisch sein, und in diesen Situationen wurden verschiedene Strategien vorgeschlagen, um die Bewegung des Tags zu begrenzen, z. B. durch Hinzufügen sperriger chemischer Gruppen oder die Verwendung eines zweiten Linkers, um den Tag am Protein zu verankern (Attachment an zwei Stellen)27, 28. S. Darüber hinaus können kommerziell erhältliche Tags diastereomere Proteine enthalten, was jedoch im Allgemeinen nicht zu der beobachteten PRE29 beiträgt. Die Verwendung des 3-Maleimido-PROXYLS, das über Maleimid-Chemie an ein freies Cystein gebunden ist, wird beschrieben, da es leicht verfügbar, kostengünstig und nicht reversibel ist und das Reduktionsmittel Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) während der gesamten Markierungsreaktion in der Lösung beibehalten werden kann. Da 3-Maleimido-PROXYL einen isotropen g-Tensor aufweist, werden keine PCS oder RDCs induziert, und die gleichen chemischen Verschiebungszuweisungen können sowohl für die paramagnetischen als auch für die diamagnetischen Proben13 verwendet werden.
Die 1HN-T 2 wird unter Verwendung einer Zwei-Zeitpunkt-Strategie (T a, Tb) gemessen, die sich zuvor als so genau erwiesen hat wie das Sammeln einer vollständigen Evolutionsreihe, die aus 8 bis 12 Zeitpunkten besteht30. Der erste Zeitpunkt (T a) wird so nahe wie möglich an Null gesetzt, und die optimale Länge des zweiten Zeitpunkts hängt von der Größe der größten erwarteten PRE für eine gegebene Probe ab und kann geschätzt werden von: Tb ~ 1,15/(R2,dia + Γ2), wobei R2,dia die R2 der diamagnetischen Probe13 darstellt. Wenn die Größe der größten PREs unbekannt ist, ist die Einstellung von T b auf ~ das Einfache des 1H T2 des Proteins eine gute erste Schätzung und wird durch Anpassung von T2 weiter optimiert, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Diese Zwei-Punkt-Messstrategie reduziert die experimentelle Zeit, die für die Messung von PREs erforderlich ist, erheblich und ermöglicht mehr Zeit für eine bessere Signalmittelung, zumal relativ verdünnte Proben verwendet werden, um die Auswirkungen unspezifischer Kontakte zwischen Molekülen zu minimieren. Eine HSQC-basierte Pulssequenz wird zur Messung von 1H, N-T2 verwendet und wurde an anderer Stelleausführlich beschrieben 30. Um die Empfindlichkeit zu verbessern, können die harten Impulse der Vorwärts- und Rückwärts-INEPT-Übertragungen durch geformte Impulse ersetzt werden. alternativ kann die Sequenz ohne weiteres in eine TROSY-basierte Auslesung31 umgewandelt werden. Da IDPs typischerweise viel längere transversale Relaxationsraten haben, was zu schmaleren Linienbreiten führt (aufgrund der inhärenten Unordnung) als ähnlich große globuläre Proteine, können lange Aufnahmezeiten in der indirekten Dimension genutzt werden, um die spektrale Auflösung zu verbessern und die für IDPs inhärente Begrenzung der chemischen Verschiebungsdispersion zu mildern.
PRE ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Interaktionen, insbesondere von Interaktionen, die vorübergehend oder schwach besiedelt sind. Ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung einer NMR-Probe, die für die Messung von PREs geeignet ist, einschließlich der Schritte zur Proteinaufreinigung, der ortsgerichteten Spinmarkierung, der Einrichtung und Kalibrierung des Pulsprogramms, der Verarbeitung und Interpretation der NMR-Daten, wird bereitgestellt. Es werden wichtige experimentelle Überlegungen angestellt, die sich auf die Datenqualität und das experimentelle Ergebnis auswirken können, einschließlich der Probenkonzentration, der Auswahl der Spin-Markierung und der Entfernung paramagnetischer Komponenten.

<table><tbody><tr><td>0,45 &Mikro; m und 0,22 &micro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHVM33RS SLGVR33RS</td><td>Filterlysat vor dem ersten Reinigungsschritt und vor der Größenausschlusschromatographie.</td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Agarplatten für die bakterielle Transformation.</td></tr><tr><td>14N Ammoniumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>576794</td><td>Die Verwendung von 15N in M9-Medium erzeugt ein im NMR sichtbares Protein, 14N erzeugt ein NMR-unsichtbares Protein</td></tr><tr><td>15N Ammoniumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>299251</td><td>Die Verwendung von 15N in M9-Medium erzeugt ein im NMR sichtbares Protein, 14N erzeugt ein NMR-unsichtbares Protein</td></tr><tr><td>3 L Fernbach Baffled Flask</td><td>Corning</td><td>431523</td><td>Bakterielle Expressionskultur</td></tr><tr><td>3-Maleimido-Proxyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>253375</td><td>Nitroxid-Spin-Markierung</td></tr><tr><td>50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Lösung/Protein Lagerung</td></tr><tr><td>Amicon Zentrifugalfilter</td><td>Millipore Sigma UFC900308</td><td></td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>Antibiotikum für einen selektiven Marker, die genaue Wahl hängt vom Expressionskonstrukt Plasmid</td></tr><tr><td>ab Analysenwaage</td><td>Oahus</td><td>30061978</td><td>Explorer Pro, zum Wiegen von Reagenzien</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AX1775</td><td>Reduziert die Nitroxid-Spin-Markierung</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td></td><td></td><td>Sterilisieren von Glaswaren und Nährmedien</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Thermo Fisher</td><td>010-1459</td><td>Gewinnung von E. coli-Zellen nach rekombinanter Proteinexpression</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Handkurbel</td><td>Thomas Scientific</td><td>0241C68</td><td>Boekel handbetriebene Zentrifuge mit niedriger Drehzahl und 15-ml-Bechern, die NMR-Röhrchen aufnehmen können</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7901</td><td>Entfernen Sie kontaminierende paramagnetische Verbindungen aus Pufferlösungen</td></tr><tr><td>Computer-Workstation</td><td></td><td></td><td>Linux oder Mac OS, kompatibel mit NMR-Datenverarbeitungs- und Analyse-Softwarepaketen wie NMRPipe und Sparky</td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>Benötigt für NMR-Lock-Signal</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Dibasisches Natriumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Ellmans Reagenz (5,5-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure)</td><td>Thermo Fisher</td><td>22582</td><td>Quantifizierung von freien Cystienrückständen</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher</td><td>3114-0050</td><td>Wird verwendet, um bakterielles Lysat zu entfernen.</td></tr><tr><td>Hochfeld-NMR-Gerät (600 - 800 MHz)</td><td>Bruker</td><td></td><td>Ausgestattet mit einer Mehrkanal-Kryosonde und</td></tr><tr><td>einer IMAC-Säule zur Temperaturregelung, HisTrap FF</td><td>Cytvia</td><td>17528601</td><td>Anfängliche Fraktionierung von rohem bakteriellem Lysat</td></tr><tr><td>Isopropyl B-D-thiogalactosid (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758</td><td>Induziert die Proteinexpression für Gene unter Kontrolle des lac-Operators</td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>22700025</td><td>Artikel werden zur Umwandlung von E. coli verwendet, um Protein von Interesse zu exprimieren, Substitutionen für jeden dieser Artikel mit ähnlichen Produkten sind akzeptabel.</td></tr><tr><td>LB-Bouillon</td><td>Thermo Fisher</td><td>12780052</td><td></td></tr><tr><td>Niederdruck-Chromatographie-System</td><td>Bio-Rad</td><td>7318300</td><td>BioRad BioLogic wird für Niederdruck-Chomatographen verwendet, z. B. für laufende IMAC-Säulen</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat Sigma</td><td>Aldrich</td><td>M7506</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Mitteldruck-Chromatographie-System</td><td>Bio-Rad</td><td>7880007</td><td>BioRad NGC ausgestattet mit einem Multi-Wellenlängen-Detektor, pH- und Leitfähigkeitsmonitoren und automatischem Fraktionssammler</td></tr><tr><td>MEM-Vitaminlösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6895</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Mikrofluidisierer</td><td>Avestin</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Bietet eine schnelle und effiziente Lyse von Bakterienzellen</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Kalibriertes Set von Mikropipettierern mit passgenauen Einwegspitzen (von mehreren Herstellern erhältlich, z. B. Eppendorf)</td></tr><tr><td>Monobasisches Kaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1551139</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>NMR-Pipetten</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255688</td><td>Zur Entnahme von Proben aus dem NMR-Röhrchen</td></tr><tr><td>NMR-Probenröhrchen</td><td>NewEra</td><td>NE-SL5</td><td>Geeignet für Hochfeld-NMR-Spektrometer</td></tr><tr><td>Präparative Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-HC</td><td>Ernte von E. coli-Zellen nach rekombinanter Proteinexpression</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352057</td><td>Klares bakterielles Lysat</td></tr><tr><td>Schüttinkubator</td><td>Eppendorf</td><td>S44I200005</td><td>Temperaturkontrolliertes Wachstum von E. coli-Starter- und Expressionskulturen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td>M9 Medienkomponente</td></tr><tr><td>Beschallungswasserbad und Vakuumquelle</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>Wird zur Entgasung von Pufferlösungen</td></tr><tr><td>verwendet Ultraschallgerät</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB505110</td><td>Wird für die bakterielle Zelllyse oder das Scheren bakterieller DNA</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>verwendet Implen</td><td>OD600 Diluphotometer</td><td>Überwachen Sie das Wachstum von E.coli-Proteinexpressionskulturen</td></tr><tr><td>Superdex 200 16/600 Größenexkulsion Colum</td><td>Cytvia</td><td>28989333</td><td>Letzter Proteinaufreinigungsschritt</td></tr><tr><td>Topspin Software, Version 3.2 oder höher</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bediensoftware für das NMR-Instrument</td></tr><tr><td>Transformation kompetente E. coli Zellen</td><td>Thermo Fisher</td><td>C600003</td><td>One Shot BL21 Star (DE3) chemisch kompetente E. coli, andere Stämme können kompatibel sein</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>ThermoFisher</td><td>20490</td><td>Reduktionsmittel, kompatibel mit einigen Sulfhydryl-reaktiven Konjugationen,</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektralphotometer</td><td>Implen</td><td>NP80</td><td>Messung der Proteinkonzentration.</td></tr><tr><td>Wasserbad, temperiert</td><td>ThermoFisher</td><td>FSGPD25</td><td>Für den Hitzeschock Schritt der bakteriellen Umwandlung</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Zur Ergänzung von M9-Medien bei Bedarf</td></tr></tbody></table>

paramagnetische relaxationsverstärkung zur detektion und charakterisierung von selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten proteinen

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Intrinsisch ungeordnete Proteine und intrinsisch ungeordnete Regionen innerhalb von Proteinen machen einen großen und funktionell bedeutsamen Teil des menschlichen Proteoms aus. Die hohe Flexibilität dieser Sequenzen ermöglicht es ihnen, schwache, langreichweitige und vorübergehende Wechselwirkungen mit verschiedenen biomolekularen Partnern einzugehen. Spezifische, aber wenig affine Interaktionen fördern die promiskuitive Bindung und ermöglichen es einem einzelnen, intrinsisch ungeordneten Segment, mit einer Vielzahl von Zielstellen zu interagieren. Aufgrund der vorübergehenden Natur dieser Wechselwirkungen kann es schwierig sein, sie mit strukturbiologischen Methoden zu charakterisieren, die auf Proteinen beruhen, um eine einzige, vorherrschende Konformation zu bilden. Die NMR zur Verbesserung der paramagnetischen Relaxation ist ein nützliches Werkzeug, um die strukturellen Grundlagen schwacher und transienter Wechselwirkungen zu identifizieren und zu definieren. Ein detailliertes Protokoll zur Verwendung der paramagnetischen Relaxationsverstärkung zur Charakterisierung der niedrig besiedelten Begegnungskomplexe, die sich zwischen intrinsisch ungeordneten Proteinen und ihren Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen biomolekularen Partnern bilden, wird beschrieben.

Intramolekulare 1H N-Γ2 PREs wurden auf einem selbstassoziierenden, intrinsisch ungeordneten Fragment (Reste 171-264) detektiert, das von der Domäne mit geringer Komplexität des RNA-bindenden Proteins EWSR142 abgeleitet wurde (Abbildung 3). Es wird erwartet, dass Rückstände in unmittelbarer sequentieller Nähe des Spin-Markierungs-Bindungspunktes (z. B. Rückstand 178 oder 260 in Abbildung 3) signif...

Es wird ein Protokoll für die Anwendung der NMR-Spektroskopie zur Verstärkung der paramagnetischen Relaxation vorgestellt, um schwache und transiente inter- und intramolekulare Wechselwirkungen in intrinsisch ungeordneten Proteinen zu detektieren.

Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Die Technik der paramagnetischen Relaxationsverstärkung kann verwendet werden, um intermolekulare Abstände zu charakterisieren und zu messen und transiente und/oder niedrig besiedelte biomolekulare Wechselwirkungen zu quantifizieren. Hier haben wir diese Technik angewendet, um Wechselwirkungen zu erfassen, die der Proteinkondensation vorausgehen. Die Empfindlichkeit von PREs ermöglicht die Identifizierung, Detektion und Quantifizierung dynamischer Zustände mit atomarer Auflösung, die für andere NMR-Techniken unsichtbar und unzugänglich bleiben.Zu den wichtigsten Schritten in diesem Protokoll gehören das Entfernen der unkonjugierten Nitroxid-Spin-Markierung und die sorgfältige Analyse der Spektren, um die Peakhöhe genau zu messen. Darüber hinaus ist beim Aufbau des NMR-Experiments und der Pulskalibrierung Vorsicht geboten. Zu Beginn wird 3-Maleimido-PROXYL aus einer Stammlösung mit dem 20-fachen molaren Überschuss des 15N-isotopenmarkierten Proteins von Interesse zugegeben.Über Nacht bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius licht- und sauerstoffgeschützt und mit leichtem Schaukeln oder inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag das nicht umgesetzte Freidrehetikett, um eine unspezifi

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Das Ziel dieses Experiments ist es, zu bestimmen und steuern die Größe, Form und Stabilität des self-assembled diskotischen Amphiphile in Wasser. Für wässriger Basis supramolekularer Polymere wie Maß an Kontrolle ist sehr schwierig. Wir wenden eine Strategie sowohl mit abstoßenden und anziehenden Wechselwirkungen. Die experimentellen Techniken angewandt, um dieses System charakterisieren, sind breit anwendbar.

Steuern der Größe, Form und Stabilität der supramolekularen Polymeren in Wasser

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur ortsgerichteten Spinmarkierung und Rekonstitution von pentameren ligandengesteuerten Kanälen für Elektronen-Paramagnetische Resonanzstudien. Dieses Protokoll kann für jedes Membranprotein angepasst werden. Die hier beschriebene Rekonstitutionsmethode kann auch für Patch-Clamp-Messungen von makroskopischen und einkanaligen Strömen in einem definierten Lipidsystem verwendet werden.

Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

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Glykan-Protein-Wechselwirkungen entwirren: Kernspinresonanz (NMR) als Rettung

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) kann die Dynamik von Strukturproteinen rückstandsspezifisch charakterisieren. Wir bieten ein praxisorientiertes Protokoll für die Aufzeichnung von NMR 15N R1 und R2 Relaxations- und {1H}-15N heteronuklearen Overhauser Effekt (hetNOE) Experimenten, das für die Zeitskala von Pikosekunden bis Nanosekunden empfindlich ist.

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Lernen Sie die paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Charakterisierung von Selbstassoziationen intrinsisch ungeordneter Proteine mittels NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die atomare Auflösung dynamischer Zustände.

Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen (Video) | JoVE Journal

Paramagnetische Relaxationsverstärkung zur Detektion und Charakterisierung von Selbstassoziationen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

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