Name: Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive Biolumineszenzmethode zur Überwachung von Brustkrebswachstum und Metastasierung bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Beobachtung für präklinische Onkologieforschung.

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Wir danken den Mitgliedern des Y.D.S.-Labors. Wir danken dem Wohl Institute for Translational Medicine am Hadassah Medical Center, Jerusalem, für die Bereitstellung der Kleintierbildgebungsanlage. Diese Studie wurde durch den Research Career Development Award des Israel Cancer Research Fund unterstützt.

Alle Mausexperimente wurden unter dem vom Hebrew University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokoll MD-21-16429-5 durchgeführt. Darüber hinaus ist die Hebrew University von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zertifiziert.
1. Pflege der Zelllinie
HINWEIS: Die menschlichen Brustkrebs-Zelllinien (MCF-7, MDA-MB-468 und MDA-MB-231) wurden in diesem Protokoll verwendet.
<ol><li>Kultivieren Sie alle Brustkrebszelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator (5% CO2). HINWEIS: Überprüfen Sie die Zelldichte regelmäßig; Teilen und erweitern Sie für die zukünftige Verwendung, wenn sie 70% Konfluenz erreichen.</li>
</ol>2. Virenvorbereitung
<ol><li>Behandeln Sie die HEK293T-Zellen mit 1 ml Trypsin, bis sie sich lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml DMEM (10% FBS) hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 150 × g für 5 Minuten, um die Zellen zu sedimentieren. Verwerfen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und fügen Sie 1 ml frisches DMEM-Medium hinzu.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Zellkonzentration und säen Sie 1,2 × 106 Zellen / Well in einer Sechs-Well-Platte.</li>
	<li>Vorwärmen Sie am folgenden Tag alle notwendigen Reagenzien, einschließlich Transfektionsreagenz, serumfreies DMEM, Hüllplasmid (VSV-G), Lentivirus-Verpackungsplasmid (ΔVPR) und pLX304 Luciferase-V5-Blastenplasmid oder FUW-GFP-Plasmid.</li>
	<li>Mischen Sie in einem 1,5 ml autoklavierten Zentrifugenröhrchen 50 μL serumfreies DMEM mit 0,3 μg VSV-G-Plasmid, 1 μg ΔVPR und 1,2 μg pLX304 Luciferase-V5-Blastenplasmid oder FUW GFP-Plasmid.</li>
	<li>Nachdem Sie diese Plasmide gründlich mit dem Medium vermischt haben, fügen Sie 5 μL des Transfektionsreagenzes hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
	<li>Nach der Inkubation fügen Sie die Mischung tropfenweise zu den HEK293T-Zellen hinzu.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Wachstumsmedium nach 24 h durch 2 ml (30% FBS) DMEM. Am folgenden Tag (48 h nach der Transfektion) wird das Medium geerntet, das die Viren ("pLX304 Luciferase-V5 oder die FUW GFP-Viren") enthält. HINWEIS: Die Verwendung von 30% FBS erhöht die Effizienz der Virusproduktion.</li>
	<li>Um HEK293T-Zellrückstände zu vermeiden, lassen Sie das virushaltige Medium 5 min lang mit 150 × g durch einen 0,45 μm Spritzenfilter oder eine Zentrifuge und sammeln den Überstand. HINWEIS: Für die Langzeitlagerung halten Sie die Arbeitsaliquoten des Virus bei -80 °C.</li>
</ol>3. Etablierung von Zellen, die GFP und Luciferase stabil exprimieren ("GFP + Luc+ Zellen")
<ol><li>Am Tag vor der Infektion der Zellen werden 8 × 105 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach der Inkubation über Nacht das Wachstumsmedium durch frisches Medium, das 8 μg/ml Polybren enthält. Geben Sie 200 μL FUW-GFP-Viren tropfenweise zu den Zellen.</li>
	<li>Optional: Um die Viruseffizienz zu verbessern, zentrifen Sie die Platte bei 560 × g für 30 min (37 °C) (Spininfektion).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für 48 h und überprüfen Sie die GFP-Expression durch Fluoreszenzmikroskopie.</li>
	<li>Sortieren Sie die GFP-exprimierenden Zellen nach fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) (GFP+) (Abbildung 1A).</li>
	<li>Infizieren Sie die GFP-sortierten Zellen mit den Blastviren pLX304 Luciferase-V5, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Behandeln Sie die Zellen mit Blasticidin (10 μg/ml) 30 h nach der Infektion, um sich für pLX304 Luciferase-V5 blast-exprimierende Zellen (GFP+, Luc+ Zellen) anzureichern. Dann alle zwei Tage durch frisches Medium ersetzen, das Blasticidin enthält. Behandeln Sie zusätzlich als Kontrolle naive Zellen mit dem gleichen blastizidinhaltigen Medium. HINWEIS: Ein deutlicher Unterschied zwischen den infizierten und Kontrollzellen sollte nach einigen Tagen der Behandlung mit Blasticidin beobachtet werden. Dieser Effekt ist zelllinienabhängig und dauert in der Regel ~8-10 Tage. Eine schlechte Überlebensrate weist auf eine geringe virale Produktionsausbeute hin. Wenn ja, produzieren Sie eine neue Charge von Viren, da eine geringe Effizienz zukünftige Experimente beeinträchtigen kann.</li>
</ol>4. Validierung der In-vitro-Luciferase-Aktivität
<ol><li>Züchten Sie die MCF-7-, MDA-MB-468- und MDA-MB-231 GFP+ Luc+-Zellen in einer 15-cm-Platte auf 80% Konfluenz. Die Zellen werden durch Trypsinisierung geerntet, wie in den Schritten 2.1-2.2 beschrieben.</li>
	<li>Samen Sie eine zunehmende Anzahl von Zellen in jedem Well (0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4 × 104) in eine schwarze 96-Well-Platte. HINWEIS: Schwarze 96-Well-Platten eignen sich besser für die Messung von Luciferase-Werten, da weiße oder transparente Platten Autolumineszenzsignale erzeugen. Verwenden Sie als Kontrolle phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) allein in einem Bohrloch, um sicherzustellen, dass es keine Autolumineszenz von PBS gibt.</li>
	<li>Füllen Sie alle Vertiefungen mit 100 μL DMEM und inkubieren Sie für 16-24 h.</li>
	<li>Luziferinlösung in PBS in einer Konzentration von 1,5 mg/ml aus dem Bestand von 30 mg/ml herzustellen. Aliquot den Bestand an Luciferinlösung und lagern bei -20 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit PBS, fügen Sie 100 μL Luciferinlösung in jede Vertiefung hinzu und warten Sie 2 Minuten. Messen Sie schließlich die Luciferase-Aktivität in allen Brustkrebszellen mit Biolumineszenz. HINWEIS: Die Untersuchung der In-vitro-GFP- und Luciferase-Expression vor Tierversuchen ist von entscheidender Bedeutung. Zusätzlich werden leere Vertiefungen verwendet, um den Hintergrund zu subtrahieren.</li>
</ol>5. Injektion von Mäusen mit GFP+ Luc+ Zellen
<ol><li>Übertragen Sie 5 × 10 6 (MCF-7 und MDA-MB-468) oder 2 ×10 6 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ Zellen in 200 μL bzw. 100 μL PBS.</li>
	<li>Reinigen Sie vor der Injektion die sterile biologische Haube mit 5% iger Desinfektionslösung (siehe Materialtabelle). Dann betäuben Sie die Mäuse mit gefilterter (0,2 μm) Luft, die 4% Isofluran enthält, bei einem Luftdurchsatz von 1 l / min für 2-3 min. HINWEIS: Es ist wichtig, die richtige Anästhesie zu bestätigen; Kneifen Sie den Zeh der Maus zusammen und suchen Sie nach einer Antwort.</li>
	<li>Legen Sie einen Kegel über den betäubten Mauskopf in Rückenlage. Tragen Sie Tierarztsalbe auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
	<li>Wischen Sie den Bauchbereich der Maus oberhalb der Brustdrüse mit Ethanol mit einem Wattestäbchen ab und heben Sie die 4. Brustdrüse mit einer Pinzettean.</li>
	<li>Führen Sie die Nadel 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) unter das Fettpolster ein und injizieren Sie langsam 100 μL der Zellsuspension. HINWEIS: Unter der Haut erscheint eine runde Ausbuchtung. Darüber hinaus kann eine unsachgemäße Injektion zu einer Abweichung der Tumorwachstumsrate oder zum Fehlen eines Tumors in derselben experimentellen Gruppe führen.</li>
	<li>Nehmen Sie nach dem Injektionsverfahren die Mäuse aus der Haube und bringen Sie sie in einen neuen Käfig. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Nadeln und Spritzen in der Schachtel für scharfe Gegenstände entsorgt werden.</li>
</ol>6. Messung der Luciferase-Spiegel in GFP+ Luc+ Mäusen
<ol><li>Halten Sie vor der Biolumineszenzerkennung die bewusste Maus zurück, indem Sie ihren Hals mit der linken Hand halten. Neigen Sie dann die Hand nach links, was dazu führt, dass die Maus nach oben zeigt, wobei sich der Unterkörper in Rückenlage befindet.</li>
	<li>Injektion von 100 μL Luciferin (30 mg/ml) intraperitoneal (i.p.) in die Bauchoberfläche der Maus im unteren linken Bauchquadranten mit einer 1,0 ml Spritze mit Nadelgröße 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm). HINWEIS: Die Spitze der Nadel sollte nicht mehr als 3-5 mm von der Bauchdecke entfernt eingeführt werden, da sie in viszerale Organe eindringen kann. Darüber hinaus wird empfohlen, eine i.p.-Injektion ohne Anästhesie durchzuführen, da die Luciferinverteilung im Körper von anästhesierten Mäusen langsamer ist als bei bewussten Mäusen. Daher ist die Überwachung der Luciferase-Spiegel in bewussten Mäusen ein schnelleres Verfahren.</li>
	<li>Halten Sie die Maus für 7 Minuten ohne Anästhesie, gefolgt von 3 Minuten in der Anästhesiekammer, bevor Sie die Tumorkinetik messen. HINWEIS: Die Inkubationszeit variiert zwischen den verschiedenen Experimenten, Zelllinien und Spezies zu Spezies. Daher wird empfohlen, die Inkubationszeit vor Beginn der Experimente zu kalibrieren.</li>
	<li>Anästhesien der Mäuse wie in den Schritten 5.2-5.3 beschrieben.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software (Table of Materials) während der Inkubation, initialisieren Sie das Imaging-System, und klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren . HINWEIS: Beachten Sie, dass die Kamera ~ 10 Minuten braucht, um abzukühlen und -90 ° C zu erreichen. Zusätzlich messen Sie als Hintergrundkontrolle die Luciferase-Spiegel bei naiven Mäusen (d. H. GFP+ -Mäusen, denen Zellen injiziert werden, die das Luciferase-Gen nicht exprimieren).</li>
	<li>Halten Sie das Setup in der automatischen Belichtung mit den folgenden Einstellungen bei: Belichtungszeit automatisch, 60 s; Binning Medium, F/Stop 1; Anregungsfilter blockiert; Emissionsfilter geöffnet. Wenn die Initialisierung beendet ist, wählen Sie Imaging-Assistent | Biolumineszenz, und klicken Sie dann auf Weiter | Filter-| öffnen Wählen Sie im Bildmotiv die Option Maus aus.</li>
	<li>Wählen Sie in der Feldansicht Stufe C (10 cm) und Betreffhöhe: 1,50 cm aus.</li>
	<li>Klicken Sie auf Bildeinrichtungsstufe auf C, und stellen Sie vor dem Klicken auf die Schaltfläche Erfassen sicher, dass die Maus in der richtigen Rückenlage auf der Bühne platziert ist.</li>
	<li>Schließen Sie die Tür, klicken Sie auf die Schaltfläche Erwerben und warten Sie, bis ein Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird. HINWEIS: Mit der Option Auto-Exposure dauert ein starkes Signal je nach Signal 5-20 s. Ein schwaches Signal dauert etwa 60 s.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Schritt für die anderen Mäuse.</li>
	<li>Um Lungenmetastasen zu erkennen, decken Sie das starke Signal des Primärtumors mit dickem schwarzem Papppapier ab und legen Sie nur die ventrale Seite der Lunge gegenüber der Kamera frei. Nehmen Sie das Bild mit den gleichen Parametern auf, die oben beschrieben wurden.</li>
</ol>7. Ex-vivo-Bilderfassung mittels Biolumineszenz und Fluoreszenz
<ol><li>Euthanasie die Mäuse mit Kohlendioxid (CO2) Inhalation im Exsikkator und sezieren Sie die Mäuse mit autoklavierten Scheren und Pinzetten.</li>
	<li>Perfusionieren Sie die Mäuse mit 0,9% Kochsalzlösung, ernten Sie die Organe und spülen Sie sie mit 1x PBS ab, um Blutflecken aus dem Organ zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie das gespülte Organ in eine Petrischale und legen Sie es in die Bühne der Biolumineszenzmaschine. Wenden Sie dieselbe Biolumineszenzeinstellung an, die in den Schritten 6.2-6.6 beschrieben ist. HINWEIS: Aufgrund der Abnahme des Luciferase-Signals ist dieser Schritt zeitlich begrenzt. So visualisieren Sie nach dem Einschläfern von Mäusen sofort das Organ durch Biolumineszenz.</li>
	<li>Wenden Sie für GFP-Bilder die gleiche Einstellung wie in Schritt 6.3 beschrieben an, indem Sie den GFP-Filter Fluoreszenz anstelle von Biolumineszenz verwenden.</li>
	<li>Nehmen Sie Lungenbilder mit einem Stereomikroskop auf, um das Vorhandensein von GFP+ -Kolonien zu untersuchen.</li>
</ol>8. Analyse der Biolumineszenzdaten
<ol><li>Doppelklicken Sie auf die Software und wählen Sie Öffnen aus dem Menü Datei .</li>
	<li>Öffnen Sie alle Dateien und minimieren Sie sie. Stellen Sie sicher, dass alle Einheiten Radiance (Photonen) sind. Klicken Sie außerdem auf Auf alle anwenden , um die gleichen Parameter für alle Bilder beizubehalten.</li>
	<li>Wählen Sie im Menü " Ansicht" die Werkzeugpalette aus, wodurch ein neues Fenster geöffnet wird.</li>
	<li>Wählen Sie im Fenster Werkzeugpalette die Registerkarte ROI-Tools und unter Typ den ROI Average Bkg ROI aus.</li>
	<li>Wählen Sie in den ROI-Tools Kreis aus, und zeichnen Sie einen kleinen Kreis auf dem Brustbereich der Maus.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf den Kreis, wählen Sie auf der Registerkarte ROI im Hintergrund die Option Als BKG für zukünftige ROIs verwenden und klicken Sie auf Fertig.</li>
</ol>9. Messung des Gesamtflusses
<ol><li>Wählen Sie im Fenster Werkzeugpalette die Registerkarte ROI-Tools und unter Typ die Option Messung des ROI aus.</li>
	<li>Wählen Sie in den ROI-Tools Kreis aus, und zeichnen Sie einen großen Kreis auf den Primärtumor der Maus.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ROI kopieren , und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ROI in jede einzelne Datei jeder Maus einfügen.</li>
	<li>Klicken Sie auf der Registerkarte ROI-Tools auf ROIs messen, um ein neues Fenster mit dem Namen ROI-Messungen zu öffnen. Behalten Sie auf dieser Registerkarte die Messtypen als Strahldichte (Photonen) und Bildattribute als alle aufgefüllten Werte bei.</li>
	<li>Exportieren Sie die Datei im Format Measurements File (*.txt) oder Csv (*.csv).</li>
	<li>Öffnen Sie die exportierten Daten in einer Tabelle und nehmen Sie den Gesamtfluss (p/s) und die Werte für die Wochen. HINWEIS: Dieser Schritt kann verwendet werden, um verschiedene Gruppen zu messen. Zum Beispiel Mäuse, die mit einem Vehikel behandelt werden, im Vergleich zu denen, die mit einem Medikament behandelt werden.</li>
	<li>Generieren Sie ein XY-Diagramm, in dem die Zeit entlang der X-Achse und der Gesamtfluss (p/s) entlang der Y-Achse dargestellt wird. Nehmen Sie für jede Woche den Parameter Total Flux (p/s) für jede Stichprobengruppe und bestimmen Sie signifikante Unterschiede mit dem nicht-parametrischen Student's t-Test.</li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren haben offengelegt, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Tierversuche sind für die Krebsforschungobligatorisch 7,8,9, und in der Tat wurden viele Protokolle entwickelt 3,6,10,11,12,13,14. Die meisten dieser Studien bestimmten die biologische Wirkung jedoc...

Brustkrebs ist weltweit eine häufige Krebsart, mit etwa 250.000 neuen Fällen, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten diagnostiziertwerden 1. Trotz seiner hohen Inzidenz hat eine neue Reihe von Krebsmedikamenten die Ergebnisse von Brustkrebspatientinnen signifikant verbessert2. Diese Behandlungen sind jedoch immer noch unzureichend, da viele Patienten einen Krankheitsrückfall und eine metastatische Ausbreitung auf lebenswichtige Organe2 erfahren, was die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität der Patienten ist. Daher besteht eine der größten Herausforderungen in der Brustkrebsforschung darin, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Bildung von distalen Metastasen regulieren, um neue Mittel zur Hemmung ihrer Entwicklung zu entwickeln.
Krebsmetastasen sind ein dynamischer Prozess, bei dem sich Zellen vom Primärtumor lösen und durch den Blutkreislauf in benachbarte Gewebe eindringen. So können Tiermodelle, in denen die Zellen eine ähnliche metastatische Kaskade durchlaufen, die Identifizierung der Mechanismen erleichtern, die diesen Prozess steuern 3,4. Darüber hinaus sind diese In-vivo-Modelle für die Entwicklung von Brustkrebstherapeutikaunerlässlich 5,6. Diese orthotopen Modelle können jedoch nicht auf die tatsächliche Kinetik des Tumorwachstums hinweisen, da der Effekt erst bei Beendigung bestimmt wird. Daher haben wir ein Luciferase-basiertes Tool entwickelt, um Tumorentwicklung und metastasierende Besiedlung in Echtzeit zu erkennen. Zusätzlich exprimieren diese Zellen GFP, um die metastatischen Kolonien zu erkennen. Dieser Ansatz ist relativ einfach und beinhaltet keine invasiven Verfahren3. Daher ist die Kombination von Luciferase- und Fluoreszenzdetektion eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien von Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement voranzutreiben.

<table><tbody><tr><td>1,7 mL Eppendorf Röhrchen</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 & Mikro; L Spitzen</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L-Spitzen</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L-Spitzen</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten SCHWARZ</td><td>Flachboden-Bar Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierte Zellzähler</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III Sortierer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Mikrolanze 3 Nadeln 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak Spritzen 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Style Dish</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Style Dish</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt, kein Glutamin</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Geschenk aus dem Labor von Dr. Yossi Buganim (Hebräische Universität Jerusalem</td></tr><tr><td>)HEK293T</td><td></td><td></td><td>Geschenk aus dem Labor von Dr. Lior Nissim (Hebräische Universität Jerusalem)</td></tr><tr><td>Isofluran, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS-Spektrum In-vivo-Bildgebungssystem</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-Lösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Lebendbild-Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Biolumineszenz Messung</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>Zur Verfügung gestellt von David M. Sabatini' s lab (Whitehead Institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Bereitgestellt von David M. Sabatini' s lab (Whitehead institute, Boston, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 Blastenplasmid</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagenzreservoire</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Stereomikroskope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bio-Labor</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau 0,5%ige Lösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA Lösung B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfilter</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>Desinfektionsmittel</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung des brustkrebswachstums und der metastasierenden koloniebildung bei mäusen mittels biolumineszenz

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Brustkrebs ist eine häufige heterogene Malignität und die zweithäufigste Todesursache bei Frauen, hauptsächlich aufgrund von entfernten Organmetastasen. Es wurden mehrere Tiermodelle erstellt, darunter die weit verbreiteten orthotopen Mausmodelle, bei denen Krebszellen in das Brustfettpolster injiziert werden. Diese Modelle können jedoch nicht dazu beitragen, die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung zu überwachen. Modernste Werkzeuge zur Echtzeitüberwachung von Krebszellen in Mäusen werden das Verständnis der Tumorbiologie erheblich verbessern. 
Hier wurden Brustkrebszelllinien etabliert, die Luziferase und grün fluoreszierendes Protein (GFP) stabil exprimieren. Insbesondere enthält diese Technik zwei aufeinanderfolgende Schritte, die durch die Messung der Luciferase-Aktivität in vitro eingeleitet werden, gefolgt von der Implantation der Krebszellen in Brustfettpolster von nicht fettleibigen diabetisch-schweren kombinierten Immunschwächemäusen (NOD-SCID). Nach der Injektion werden sowohl das Tumorwachstum als auch die metastasierende Besiedlung in Echtzeit durch das nichtinvasive Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht. Dann wird die Quantifizierung von GFP-exprimierenden Metastasen in der Lunge mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, um die beobachteten Biolumineszenzergebnisse zu validieren. Dieses ausgeklügelte System, das Luciferase und fluoreszenzbasierte Erkennungswerkzeuge kombiniert, bewertet Krebsmetastasen in vivo, was ein großes Potenzial für den Einsatz in Brustkrebstherapeutika und Krankheitsmanagement hat.

Wir erzeugten Brustkrebs-Zelllinien (MDA-MB-231, MCF-7 und MDA-MB-468), die GFP- und Luciferase-Vektoren exprimieren. Konkret wurde dies durch eine sequentielle Infektion erreicht. Zuerst wurden die Brustkrebszelllinien mit einem Lentivirus-Vektor infiziert, der fluoreszierendes GFP exprimierte. Die GFP-positiven Zellen (GFP+) wurden 2 Tage nach der Infektion sortiert (Abbildung 1A,B) und mit dem pLX304 Luciferase-V5-Vektor infiziert. Dann wurde Blasticidin verwen...

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Mit diesem ausgeklügelten, nicht-invasiven Werkzeug können wir die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung bei Mäusen in Echtzeit überwachen, was ein großes Potenzial für die Brustkrebstherapie und das Krankheitsmanagement hat. Die Kombination von Luciferase und Fluoreszenzdetektion ist eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien zur Progression von Brustkrebs und zum Krankheitsmanagement voranzutreiben. Dies kann für Krebsmedikamentenstudien angewendet werden.Dieses Protokoll ist nicht auf Brustkrebs beschränkt und könnte auf andere Karzinome wie Lunge und Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Beginnen Sie damit, die MCF-7-, MDA-MB-468- und MDA-MB-231-GFP- und Luciferase-positiven Zellen separat in einer 16-Zentimeter-Platte auf 80% Konfluenz zu züchten. Nachdem Sie die Zellen durch Trypsinisierung geerntet haben, säen Sie eine zunehmende Anzahl von Zellen in jedem Well in eine schwarze 96-Well-Platte.Füllen Sie dann alle Vertiefungen mit 100 Mikrolitern DMEM und inkubieren Sie für 16 bis 24 Stunden in einem Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% CO2. Bereiten Sie Luciferinlösung in PBS in einer Konzentration von 1,5 Milligramm pro Milliliter vor un

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Quelle:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, 2Abteilung für grundlegende psychologische Prozesse, Institut für Psychologie, Universität BrasíliaDieses Video zeigt das Verfahren zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo,...

Biolumineszierende Bildgebung der Progression von Brusttumoren in einem weiblichen Mausmodell

Biolumineszenz-Bildgebung ist ein bekanntes Werkzeug für Tumoren und Metastasen zu lokalisieren, aber Quantifizierung dieser Bilder erfordert oft komplexe Berechnungen und bestimmte Instrumente. Wir beschreiben die einfach zu bedienende luminoscore-Methode, basierend auf genauen Aufnahmebedingungen, keine Berechnungen erfordern, und ermöglicht die Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung in Mausmodellen beobachtet werden.

Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Wir führen einen murinen orthotopen Brust Krebs Modell und radikale Mastektomie Modell mit Biolumineszenz-Technologie, die Tumorlast um menschliche Muttermilch Tumorprogression imitieren zu quantifizieren.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Diese Arbeit setzt ein fortschrittliches Protokoll vor, um die Tumorbelastung durch den Nachweis von grünen Fluoreszenzprotein- und Biolumineszenzsignalen sowie die Integration quantitativer molekularer Detektionstechniken genau zu bewerten.

Studieren von dreifach negativem Brustkrebs mit orthotopischem Brustkrebsmodell

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Kombinierte Verwendung von Tail Vein Metastasis Assays und Real-Time In Vivo Imaging zur Quantifizierung der metastasierenden Kolonisation und Belastung von Brustkrebs in der Lunge

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Erfahren Sie die nicht-invasive Biolumineszenzmethode zur Überwachung von Brustkrebswachstum und Metastasierung bei Mäusen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Beobachtung für präklinische Onkologieforschung.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

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