Name: In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Visualisierung von Axonwachstum und Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Mäusehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Mechanismen in situ.

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Wir danken Maria Eugenia Bernis für das Fotografieren der Verfahren. Wir danken auch Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski und Sina Stern für das Lesen und Diskutieren des Manuskripts. Wir danken unseren hervorragenden technischen Assistentinnen Jessica Gonyer, Blanca Randel und Anh-Tuan Pham. Wir würdigen die wertvolle Unterstützung der Lichtmikroskopanlage und der Tieranlage des DZNE. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG), der International Foundation for Research in Paraplegia (IRP) und Wings for Life (bis F.B) unterstützt. F.B. ist Mitglied des Exzellenzclusters ImmunoSensation2, der SFBs 1089 und 1158 und ist Träger des Roger-De-Spoelberch-Preises.

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<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trip+of+the+tip%3A+understanding+the+growth+cone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li>
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<li>Bradke, F., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+local+actin+instability+in+axon+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of local actin instability in axon formation.</a> Science. 283 (5409), 1931-1934 (1999).</li>
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<li>Witte, H., Neukirchen, D., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+stabilization+specifies+initial+neuronal+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule stabilization specifies initial neuronal polarization.</a> Journal of Cell Biology. 180 (3), 619-632 (2008).</li>
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<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
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<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wie die Wachstumskegel ihre Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren, um die gleichzeitige Axonausdehnung und -führung zu koordinieren, ist immer noch Gegenstand der Debatte 3,18. Bahnbrechende Studien an 2D-Substraten gaben einen Einblick in die grundlegenden molekularen Mechanismen, die die Kräfte erzeugen, die die Wachstumskegeldynamik während der Axonbildung, des Auswachsens und der Navigation antreiben 2,10,11,12,19. In jüngerer Zeit zeigten Studien in 3D-Matrizen, wie viel Einfluss eine dritte Dimension auf das Verhalten des Wachstumskegels und damit auf das Axonwachstum hat 8,9. Dennoch müssen die komplizierten Mechanismen, die die Wachstumskegeldynamik in vivo anweisen, noch gründlich untersucht werden.
Die Herstellung von organotypischen Schnittkulturen aus IUE- oder EUE-Gehirnen ist weit verbreitet und gut dokumentiert. Es ist zu einem goldenen Standard geworden, der es Wissenschaftlern ermöglicht, Einblicke in die Entwicklung und das Verhalten von Neuronen im lebenden Hirngewebezu gewinnen 20,21. Tatsächlich wurde diese Technik in Kombination mit verschiedenen hochauflösenden bildgebenden Verfahren erfolgreich eingesetzt, um spezifische molekulare Prozesse und morphologische Ereignisse in situ zu visualisieren. Solche Studien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Axonbildung und -erweiterung 19,22, die kortikale neuronale Migration 19,22,23,24, die Zentrosomendynamik 25,26, die Mikrotubulidynamik 27 sowie die funktionelle Dynamik prä- und postsynaptischer Kompartimente 28,29.
Dieses Protokoll befasst sich mit einer Lücke in der experimentellen Neurobiologie, indem es die Wachstumskegeldynamik der sich entwickelnden kortikalen Neuronen in situ, in ex vivo akuten Gehirnschnittkulturen und die Werkzeuge zur Analyse der erhaltenen Daten visualisiert.
Akute Gehirnschnittkulturen wurden verwendet, um dieses Protokoll zu etablieren, weil sie (1) mit etwas Übung leicht zu erzeugen sind; (2) ein zugängliches System zur Untersuchung von Wachstumskegeln zu präsentieren, die in eine quasi-vollständig physiologische Umgebung eingebettet sind, aber transparent genug sind, um eine hochauflösende Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen; (3) kann für seine Verwendung mit einer Vielzahl von transgenen Mauslinien erweitert werden; (4) bieten in Kombination mit IUE oder EUE praktisch unbegrenztes Potenzial, molekulare Werkzeuge zur Bewertung der Leistung von Wachstumskegeln und Axonen in vivo unter Verlust-/Gewinn-von-Funktionsregimen zusammen mit fluoreszierenden Reportern und Zytoskelettsonden bereitzustellen.
Diese Methodik wurde sowohl im Zusammenhang mit EUE als auch mit IUE beschrieben. Obwohl es sich immer noch um eine sehr zuverlässige Methode handelt, führte EUE zu einer erhöhten Inzidenz von Gehirnschnitten, die ein unorganisiertes RG-Netzwerk zeigten, verglichen mit denen, die mit IUE als Verabreichungsmethode erhalten wurden (Abbildung 4C). Störungen im RG-Array beeinflussen stark die neuronale Migration und das Muster der Axondehnung30,31. Dies sind Schlüsselparameter, die vorhersagen, wo Axone zu einem bestimmten Zeitpunkt zur Analyse zu finden sind und in welcher Art von Umgebung sie navigieren. Gehirnschnitte mit einem signifikant gestörten RG-Netzwerk haben typischerweise eine gestörte kortikale Neuronenschichtung. Dies wiederum erzeugt Axone mit chaotischen Flugbahnen. Daher wird dringend empfohlen, die strukturelle Integrität des RG-Netzwerks zu kontrollieren. Interessanterweise korreliert eine schlechte strukturelle Integrität mit einem erhöhten Alter des embryonalen Gehirns. Tatsächlich wurden solche Effekte bei jüngeren E12.5-E13.5-Embryonen typischerweise nicht beobachtet19.
Das vorliegende Protokoll ist gründlich und unkompliziert. Dennoch gibt es einige kritische Schritte, bei denen besondere Sorgfalt und Aufmerksamkeit auf sich genommen werden muss, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Diese wurden ausdrücklich im Protokoll erwähnt und umfassen (1) die Abstimmung der DNA-Menge, die bei der Elektroporation verwendet wird, um eine spärliche Markierung zu erhalten; (2) Vermeidung von Schäden bei der Extraktion von Gehirnen; (3) Kontrolle der Temperatur der Agarose während der Hirnhülle; (4) Fehlerbehebung des idealen Prozentsatzes von Agarose für Gehirne eines bestimmten Alters; und (5) Auswahl von Fluorophoren, deren Erfahrung folgt. Während der Protokolloptimierung wurde die Leistung mehrerer Fluorophore in der Live-Cell-In-situ-Bildgebung getestet. Für dieses Protokoll wurden die monomeren GFP-Varianten EGFP und NeonGreen zur Herstellung der LifeAct- und Lyn-markierten Plasmide gewählt (Abbildung 5A,B). Zusätzlich wurde die RFP-Variante mScarlet getestet und für diesen Aufbau als sehr geeignet befunden (Daten nicht gezeigt). Multimere tRFP (Dimer) und ZsGreen (Tetramer) (Abbildung 5C und ergänzendes Video 1, rechts) wurden ebenfalls getestet. Diese schnell faltenden, superhellen Fluorophore werden empfohlen, wenn die Methode eine schnelle Fluoreszenzsignalerzeugung nach der DNA-Lieferung erfordert.
Eine gängige Praxis bei der Verwendung von Slice-Kulturen ist die Verwendung von Slices aus verschiedenen Gehirnen, um Kontroll- und experimentelle Bedingungen zu testen. Dies stellt eine inhärente Quelle unerwünschter Variabilität dar. Hier wurde ein Expressionssystem verwendet, das eine unabhängige Modifikation benachbarter Neuronen und die Expression von Reportern zur Identifizierung ermöglicht. Beachten Sie, dass es in dieser Demonstration (Abbildung 5C) keine Unterschiede zwischen Neuronen gab, die einen der Fluorophore exprimierten. Zum Beispiel wird eine solche Plasmidmischung in Kombination mit einer transgenen Mauslinie, die ein Cre-sensitives Gen beherbergt, mit tRFP-Neuronen (Dre-sensitive) markiert, die als Wildtyp erhalten geblieben sind. Im Gegensatz dazu markiert das ZsGreen (auch Cre-sensitive) die rekombinierten Neuronen. Daher könnten Wachstumskegel der beiden verschiedenen Genotypen und wahrscheinlich auch Phänotypen gleichzeitig in derselben Gehirnscheibe untersucht werden.
Die Lokalisierung von Axonen und Wachstumskegeln für die Analyse ist eine wichtige Überlegung. Kortikale Neuronen polarisieren, während sie radial von der ventrikulären Zone (VZ) in Richtung der kortikalen Platte (CP) wandern. Während dieses Prozesses bilden Neuronen einen führenden Prozess (einen zukünftigen Dendriten) und einen nachlaufenden Prozess, der zum Axon wird und sich schließlich mit Pionieraxonen in der Zwischenzone (IZ) verbindet und Axontrakte32 bildet. Um axonale Wachstumskegel zu erfassen, wurde daher eine Bildgebung an axonalen Fasern im IZ durchgeführt, einschließlich Axonen, die aus dem CP austreten, und früh erzeugten Axonen, die bereits mit axonalen Bündeln assoziiert sind; oder schließlich in Fasern, die den IZ durchqueren und darunter ausdehnen (Abbildung 7).
Dieses Protokoll macht es möglich, eine hochauflösende Bildgebung von Neuronen in organotypischen Schnitten durchzuführen. In der Vergangenheit war die Lichtstreuung ein erhebliches Problem bei der Abbildung dicker Proben. In den letzten zwei Jahrzehnten ermöglichten umfangreiche Fortschritte in der optischen Technologie die Abbildung dicker Proben. Hier wurde ein Fernabstandsobjektiv verwendet, um kleinere Strukturen, wie z.B. Wachstumskegel, besser sichtbar zu machen. Es ist unvermeidlich, dass dieses Protokoll detailliertere Ereignisse wie den retrograden Aktinfluss oder die Mikrotubulidynamik nicht erfasst. Das Objektiv mit langem Arbeitsabstand, das eine niedrigere numerische Apertur (NA) erfordert, bewahrt Informationen aus dicken Scheiben. Es war jedoch auch möglich, dieses Protokoll an die Verwendung mit Zielen der kürzeren Arbeitsentfernung anzupassen. Dies erforderte einen reibungslosen Transfer der Scheiben in eine Glasbodenschale, um die strukturelle Integrität zu erhalten. Die Verwendung dieser Methode führte jedoch zu einem kürzeren Überleben - ~ 15 h - aufgrund des Verlustes des Gasaustauschs (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu 2D-Kulturen nehmen Wachstumskegel in 3D ein größeres Volumen ein und erfordern eine Kompensation von Bewegungsartefakten in der z-Achse. Um die Fähigkeit zur Abbildung detaillierter Ereignisse zu erhöhen, muss moderne konfokale Technologie eingesetzt werden. Daher wird empfohlen, einen schnell scannenden Z-Stack-Motor zu verwenden, wie z-Galvo, der für hochempfindliche konfokale Mikroskope33 verfügbar ist.
Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll drei Haupteinschränkungen aufweist. Erstens ist es oft eine Herausforderung, das Niveau der Expression / Anzahl der exprimierenden Zellen eines bestimmten Plasmids in vivo zu kontrollieren. Dies führt zu einer Variabilität zwischen allen Schichten, selbst wenn die gleiche Plasmidkonzentration beibehalten wird. Daher muss die Auswahl der regulatorischen Elemente in den verwendeten Ausdrucksvektoren sorgfältig vorgegeben werden. Zweitens ist die Abbildung detaillierter Ereignisse mit Membraneinsätzen derzeit nicht möglich. Diese zweite Einschränkung kann mit den im vorhergehenden Absatz vorgeschlagenen methodischen Aktualisierungen überwunden werden. Schließlich sind Wachstumskegel sehr lichtempfindlich und können schnell photogebleicht werden. Daher kann eine häufige Abbildung der Wachstumskegel für nur 5 Minuten mit Laserscanning-Mikroskopen oft die Wachstumskegel kollabieren lassen. In dieser Hinsicht können neue Fortschritte bei der Lichtblattmikroskopie erzeugten Geräten für die Langzeitbildgebung der Gehirnschnitteangepasst werden 34.
Solche Protokolle sollen neue Forschungswege eröffnen, die ein besseres Verständnis dafür ermöglichen, was es braucht, damit ein Wachstumskegel eine komplexe In-vivo-Umgebung liest und darauf reagiert und, was noch wichtiger ist, die Mechanik dieses ausgeklügelten Zusammenspiels entwirrt.

Neuronen sind stark polarisierte Zellen, die die grundlegende Recheneinheit im Nervensystem darstellen. Sie empfangen und emittieren Informationen, die auf der Kompartimentierung von Input- und Output-Standorten beruhen: Dendriten bzw.Axone 1. Während der Entwicklung dehnen sich Axone aus, während sie durch eine unglaublich komplexe Umgebung navigieren, um ihr Ziel zu erreichen. Die Axonnavigation wird vom Wachstumskegel geleitet, einer sensorischen Struktur, die sich an der Spitze des sich entwickelnden Axons befindet. Der Wachstumskegel ist dafür verantwortlich, Umwelthinweise zu erkennen und in die dynamische räumliche Reorganisation seines Zytoskeletts zu übersetzen 2,3. Die daraus resultierenden morphomechanischen Reaktionen weisen den Wachstumskegel an, sich vom auslösenden Hinweis auszudehnen oder zurückzuziehen, was zu spezifischen Axonmanövern führt.
Das aktuelle Verständnis der Axonausdehnung und Wachstumskegeldynamik stammt aus Studien, die das Axonwachstum überzweidimensionale (2D) Substrate 2,4,5,6,7 untersuchen. Diese bahnbrechenden Studien identifizierten ein ausgeklügeltes Zusammenspiel zwischen Wachstumskegeln und Wachstumssubstraten und zeigten auffällige Unterschiede, die von Substrateigenschaften wie Haft- und Steifigkeit abhängig sind 8,9. Geleitet von diesen Erkenntnissen wurde angenommen, dass extrazelluläre Umwelthinweise das Axonwachstum diktieren sollten, wobei das Wachstumskegel-Zytoskelett dieses Wachstumausführte 2,10,11,12. Insbesondere können Neuronen Axone in nicht adhäsiven Substraten (z. B. Polylysin, Polyornithin) erweitern13. Darüber hinaus kann die Substratsteifigkeit die Axonwachstumsrate unabhängig von Zelladhäsionskomplexen beeinflussen8. Daher kann die Untersuchung der Wachstumskegeldynamik in 2D-Substraten allein das Kräftegleichgewicht, das sich aus der Wechselwirkung von axonalen Wachstumskegeln mit physiologisch relevanten dreidimensionalen (3D) Umgebungen, wie sie in vivo gefunden werden, ergeben, nicht genau modellieren.
Um die Einschränkungen der 2D-Assays zu überwinden, wurden Axonwachstum und Wachstumskegeldynamik in 3D-Matrizen 8,9 untersucht. Diese Matrizen stellen einen physiologischeren Kontext dar, ermöglichen jedoch die Untersuchung zellintrinsischer Mechanismen des Axonwachstums. Es ermöglicht die Einzelzelluntersuchung von Wachstumszapfen bei einer Vielzahl von Erkrankungen und pharmakologischen Behandlungen9. In solchen 3D-Umgebungen zeigten Axone eine ausgeprägte zytoskelettale Dynamik und wuchsen schneller als diejenigen, die in 2D-kultivierten Neuronen beobachtet wurden9. Diese eleganten Studien zeigten den Einfluss einer zusätzlichen Dimension auf die Reorganisation des Wachstumskegel-Zytoskeletts und damit auf sein Verhalten.
Trotz der offensichtlichen Vorteile, die 3D-Matrizen gegenüber 2D-Oberflächen bei der Unterstützung der nativen neuronalen Entwicklung und des Axonwachstums bieten, bleiben sie ein vereinfachtes synthetisches Gerüst, das die Komplexität der Dynamik, die im Gewebe des Zentralnervensystems (ZNS) beobachtet wird, nicht widerspiegeln kann. Hier wurde die Abgabe von Reporterplasmiden durch ex utero und in utero Elektroporation mit organotypischer Scheibenkultur des Gehirns und in situ hochauflösender Live-Bildgebung kombiniert, um die Wachstumskegeldynamik in einem physiologischen Kontext zu analysieren. Diese Methodik ermöglicht die Visualisierung der sich entwickelnden Axone bei gleichzeitiger Erfahrung der 3-dimensionalen In-vivo-Umgebungen und der Komplexität ihrer physikalisch-chemischen Zusammensetzung. Schließlich werden benutzerfreundliche Verfahren zur Messung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik mit allgemein lizenzierter und öffentlich verfügbarer Software beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Adson Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Ziege Anti-Maus</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Ziege Anti-Maus</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin Antikörper</td><td>sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Monoklonale Maus, Klon LN-6, Aszites</td></tr><tr><td>Flüssigkeit B27 Ergänzung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieb GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ unevirsal Elektrodenabzieher</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2-Speed Modell</td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5% (wt/vol)</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipettenspitzen</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Farbstoffgehalt > 85 %</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Straight/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Zellkulturschale</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Wässriges Eindeckmedium</td><td>sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Calcium, Magnesium, kein Phenol rot</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isotonische Kochsalzlösung Lösung</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0,90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S Vibratom</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 mit Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Micro-Adson Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vorratsdose für Mikropipetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsatz</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, hydrophiles PTFE, 0,4&nbsp; &Mikro; m</td></tr><tr><td>Moria Perforierte Löffel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium, minus Phenolrot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan-2 Ergänzung</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Nadelhalter mit Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Pinzetten</td><td>Harvard Apparatur</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Reflex Wickelverschluss Clip</td><td>World Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Rechteck-Elektroporationssystem ECM830</td><td>Harvard Gerät</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gaze</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Gleitmittel Augensalbe</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 chirurgische Seidennähte</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well Glasboden</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ visualisierung des axonwachstums und der wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen hirnschnittkulturen

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Während der neuronalen Entwicklung navigieren Axone durch die kortikale Umgebung, um ihre endgültigen Ziele zu erreichen und synaptische Verbindungen herzustellen. Wachstumskegel - die sensorischen Strukturen, die sich an den distalen Spitzen der sich entwickelnden Axone befinden - führen diesen Prozess aus. Die Untersuchung der Struktur und Dynamik des Wachstumskegels ist entscheidend für das Verständnis der axonalen Entwicklung und der Wechselwirkungen mit dem umgebenden Zentralnervensystem (ZNS), die es ihm ermöglichen, neuronale Schaltkreise zu bilden. Dies ist unerlässlich bei der Entwicklung von Methoden zur Reintegration von Axonen in neuronale Schaltkreise nach Verletzungen in der Grundlagenforschung und in präklinischen Kontexten. Bisher basiert das allgemeine Verständnis der Wachstumskegeldynamik in erster Linie auf Untersuchungen von Neuronen, die in zwei Dimensionen kultiviert sind (2D). Obwohl zweifellos grundlegend für das aktuelle Wissen über die strukturelle Dynamik von Wachstumskegeln und die Reaktion auf Reize, stellen 2D-Studien die physiologische dreidimensionale (3D) Umgebung, auf die neuronale Wachstumskegel in intaktem ZNS-Gewebe stoßen, falsch dar. In jüngerer Zeit wurden Kollagengele eingesetzt, um einige dieser Einschränkungen zu überwinden und die Untersuchung der neuronalen Entwicklung in 3D zu ermöglichen. Sowohl synthetischen 2D- als auch 3D-Umgebungen fehlen jedoch Signalsignale innerhalb des ZNS-Gewebes, die die Erweiterung und Wegfindung von sich entwickelnden Axonen steuern. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung von Axonen und Wachstumskegeln unter Verwendung organotypischer Gehirnschnitte, bei denen sich entwickelnde Axone auf physiologisch relevante physikalische und chemische Hinweise treffen. Durch die Kombination von Feinabstimmung in utero und ex utero Elektroporation zur spärlichen Lieferung von Fluoreszenzreportern zusammen mit hochauflösender Mikroskopie stellt dieses Protokoll eine methodische Pipeline für die Visualisierung der Axon- und Wachstumskegeldynamik in situ dar. Darüber hinaus ist eine detaillierte Toolkit-Beschreibung der Analyse von Langzeit- und Lebendzellbilddaten enthalten.

Es werden repräsentative Ergebnisse gezeigt, die mit dem beschriebenen Methoden-Workflow erzielt wurden. E15.5-Mäuse wurden in der vorliegenden Demonstration verwendet, obwohl dieses Protokoll leicht an praktisch alle embryonalen Altersgruppen von E11 bis Ende E17 angepasst werden kann. In diesem Protokoll ist entweder ex utero Elektroporation (EUE; Abbildung 2A, 2C-I) oder in utero Elektroporation (IUE; Abbildung 2B, C und 2J-Q) wurden verwendet, um Plasmide in die Vorläuferneuronen zu bringen, die die lateralen Ventrikel auskleiden. Diese Vorläufer sind die Quelle zukünftiger kortikaler projizierender Neuronen (CPN)15,16. Plasmidmischungen wurden hergestellt, um eine spärliche neuronenspezifische Expression von entweder membrangerichtetem (Lyn)-mNeonGreen (Abbildung 1A) oder LifeAct-verstärktem (E)GFP (Abbildung 1B) anzutreiben, um das Gesamtverhalten bzw. die Aktindynamik in Wachstumskegeln zu bewerten. Darüber hinaus wurde eine Plasmidmischung eingeschlossen, die darauf abzielte, einzelne Neuronen entweder mit Turbo(t)-RFP oder Zoanthus sp. (Zs) grün fluoreszierendem Protein (ZsGreen) zu markieren (Abbildung 1C). Dies erleichtert die Überwachung des Wachstumskegelverhaltens von unabhängigen benachbarten Neuronen.
Die Hirndissektion aus elektropoierten Embryonen ist ein entscheidender Schritt, der sorgfältig durchgeführt werden muss, um qualitativ hochwertige Scheiben zu erhalten und die native Gehirnstruktur zu erhalten. Dissektionsinstrumente und Vibratom wurden vorher vorbereitet und sorgfältig mit Ethanol sterilisiert (Abbildung 3A,B). Als nächstes wurden die Köpfe der elektropolierten Embryonen sorgfältig seziert und die Gehirne extrahiert. Hier wird eine repräsentative Dissektion von Gehirnen aus den Embryonen gezeigt, die bei E15 (Abbildung 3C-F) und E12.5 (Abbildung 3G-J) einer EUE unterzogen wurden. Gehirne werden sofort in eine Agarosematrix eingeschlossen, geschnitten und auf PTFE-Membraneinsätze in einer unteren Glasschale für die Inkubation gelegt (Abbildung 3K-M).
Der Gesundheitszustand von Gehirnschnitten ist ein wichtiger Punkt für die Kontrolle, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Eine Sichtprüfung auf Verunreinigungen wurde täglich durchgeführt. Sobald die Kultur fertiggestellt ist, werden die Gehirnschnitte fixiert und der Immunhistochemie unterzogen. Hier wurde 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) verwendet, um die gesamte zelluläre Organisation und die Vimentinfärbung zu kontrollieren, um die Glia-Organisation aufzudecken; insbesondere Radialglia (RG) Gerüst. Typischerweise zeigen erfolgreich kultivierte Hirnschnitte, die entweder aus IUE oder EUE stammen, eine normale zelluläre Verteilung, wie DAPI und eine etwas organisierte Anordnung von RG mit apikal orientierten Pial-Kontaktierungsprozessen17 zeigen (Abbildung 4A, B). Gelegentlich werden deutliche Störungen im RG-Gerüst in kultivierten Hirnschnitten beobachtet, insbesondere bei solchen, die aus der EUE-Elektroporation stammen (Abbildung 4C). Hirnschnitte mit extrem unorganisiertem RG-Gerüst zeigen eine gestörte neuronale Migration und ein defektes Axonwachstum (nicht abgebildet). Daher ist die Steuerung des RG-Gerüsts eine einfache postkulturelle Methode, um die aus zuverlässigen Gehirnschnitten gewonnenen Daten zu sortieren.
Gehirnschnitte, die entweder aus IUE oder EUE mit Lyn-mNeonGreen-exprimierender Plasmidmischung gewonnen werden, führen zu einer ähnlich spärlichen Neuronenmarkierung. Ein repräsentatives pyramidenförmiges CPN, das Lyn-mNeonGreen und das dynamische Verhalten seines Wachstumskegels exprimiert, ist als Beispiel gezeigt (Abbildung 5A und ergänzendes Video 1, oben links). Darüber hinaus wurden Neuronen mit einem Plasmid markiert, das eine Aktinsonde exprimierte, um die Aktindynamik von axonalen Wachstumskegeln in situ zu analysieren (Abbildung 5B und ergänzendes Video 1, unten links). In-situ-Experimente wurden auch mit einem Dual-Cre/Dre-Fluorophor-exprimierenden Plasmid-Design durchgeführt (Abbildung 1C und ergänzendes Video 1, rechts). tRFP- oder ZsGreen-Fluorophore in diesem Plasmid könnten spezifisch und individuell entweder durch Dre- bzw. Cre-Rekombinasen in benachbarten Neuronen aktiviert werden (Abbildung 5C). Diese experimentelle Aufstellung ermöglicht die parallele Analyse von Wachstumskegeln von Kontrollneuronen mit benachbarten modifizierten Neuronen (bei gegebenem Funktionsverlust oder -gewinn). Dadurch wird die Variabilität umgangen, die sich aus der Verwendung verschiedener Schichten zum Testen von Kontroll- und Versuchsbedingungen ergibt.
Aus dem aufgezeichneten Film generierte Kymographen wurden analysiert, aus denen dynamische Wachstumsparameter wie protrusive Aktivität über die Zeit und Wachstumslänge leicht gewonnen werden können (Abbildung 6A). Beachten Sie, dass eine einfache Anpassung der zeitlichen Auflösung des Zeitraffers die Messung der Axondehnungsgeschwindigkeit für 2 h ermöglicht (Abbildung 6A). Darüber hinaus kann die Variation des Wachstumskegelvolumens im Laufe der Zeit - ein Maß für die allgemeine dynamische Aktivität des Wachstumskegels - leicht erhalten werden, in diesem Fall mit lizenzierter Software (Abbildung 6B und Abbildung 6E, F). Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit des Aktinlaufbandes und das Gleichgewicht von Filopodien / Lamellipodien während der Wachstumskegelerkundungsaktivität zu bewerten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Abbildung 1: Schemata der im Protokoll verwendeten Plasmide . (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. Relevante Informationen über Plasmidkomponenten und die Herkunft von Fluorophor finden Sie in den Boxen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Abbildung 2: Arbeitsablauf von ex utero und in utero Elektroporation von E15.5-Mäusen. (A) Einrichtung einer Operationsstation für die Elektroporation ex utero. (B) Einrichtung einer Operationsstation für die In-utero-Elektroporation. (C) Uterushörner, die außerhalb der Bauchhöhle der betäubten Maus gezogen werden. (D) Entnahme eines Embryos aus dem Gebärmuttersack. (E) Embryonenopfer durch vollständige Rückenmarkstransektion über einen diagonalen Einschnitt; Beachten Sie, dass eine Enthauptung vermieden wurde. (F) Einsetzen des Embryos in den Halter und Injektion mit DNA/Fast Green-Gemisch in den linken seitlichen Ventrikel. (G,H) Positionieren Sie den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden mit der Kathode (roter Pfeil) über dem Kortex in einem Winkel von 60°. (I) Platzierung der Arme des Embryos (schwarze Pfeile) außerhalb des Halters, um ein Abrutschen des Embryos während des Eingriffs zu verhindern. (J) Rotation des Embryos im Gebärmuttersack, um den Kopf freizulegen. (K,L) Injektion der DNA / Fast Green-Mischung in die lateralen Ventrikel des Embryos durch die Gebärmutterwand. (M) Positionieren Sie den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden mit einer Kathode (roter Pfeil) über dem Kortex in einem Winkel von 60°. (N) Vernähter Muskelschnitt durch laufende Verriegelungsnaht. (O) Vernähter Hautschnitt über eine unterbrochene Naht. (P) Sicherung der Wunde mit chirurgischen Wundclips und Desinfektion mit Betadin. (Q) Platzierung der Maus im Auffangkäfig mit Ferninfrarot-Wärmelicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Abbildung 3: Extraktion von E15.5 und E12.5 Gehirnen und organotypisches Schnittkulturverfahren. (A) Werkzeuge, die für das Verfahren zur Gehirnextraktion verwendet werden. (B) Einrichtung einer organotypischen Kulturstation. (C-F) Extraktion von E15.5 Gehirn. (G-J) Extraktion von E12.5 Gehirn. Gepunktete Linien markieren die Position der Einschnitte. Rote Pfeile weisen auf die Richtung des Ziehens durch eine Pinzette hin. (K) Einbettung des Gehirns in eine 3-cm-Schale mit 3% schmelzarmer Agarose, wobei ein Abstand von 1-2 mm Agarose unter dem Gehirn verbleibt. (L) Sammlung von 150 μm Hirnschnitt. (M) Platzierung von Hirnschnitten auf PTFE-Membraneinsätzen, die in einer 35-mm-Schale mit Paraffinfilm immobilisiert wurden (blauer Pfeil). Die Markierung des roten Sterns zeigt eine bestimmte Gehirnschnittsammlung aus Vibratom (L) und deren Übertragung auf die PTFE-Membran (M) an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Abbildung 4: Erhaltene radiale Gliazellstruktur in gesunden organotypischen Schnitten. Konfokale Bilder von E17.5-Gehirnschnitten, die das RG-Array (Vimentin; grün) und die Gesamtzellorganisation (DAPI; Magenta) nach IUE (A) und EUE (B, C) zeigen. Beachten Sie die starken Störungen im RG-Array, die gelegentlich durch EUE (C) entstehen können. Die Vergrößerungen entsprechen den rot gepunkteten Rahmen in der Hauptfigur: Maßstabsbalken, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Abbildung 5: In-situ-Visualisierung der Wachstumskegeldynamik in akuten organotypischen Schnitten. (A,B) Neuronen und ihre entsprechenden Wachstumskegel, die mit Lyn-mNeonGreen bzw. LifeAct-GFP gekennzeichnet sind. Roter Stern markiert Wachstumskegel von Lyn-mNeonGreen exprimierendem Neuron. Blaues Sternchen, das den Wachstumskegel des LifeAct-GFP-exprimierenden Neurons markiert. (C) Benachbarte Neuronen, die mit dem dualen Plasmidsystem markiert sind, das tRFP (Magenta) und ZsGreen (grün) und ihre entsprechenden Wachstumskegel enthält. Die abgebildeten Wachstumskegel (rechts) befanden sich außerhalb des erfassten Rahmens (links), der kurz nach dem Erwerb des Wachstumskegel-Zeitraffers aufgenommen wurde; Maßstabsstäbe, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Analyse der Axonwachstumsgeschwindigkeit und des Wachstumskegelvolumens. (A) Axon-Tracing auf einem Neuron, das Lyn-mNeonGreen (oben) exprimiert, und seinem entsprechenden Kymographen (unten), der mit ImageJ erzeugt wurde. (B) Rekonstruktion des Z-Stack-Videos des Wachstumskegels mit der Bildanalysesoftware (oben) und dem gleichen Wachstumskegel, der mit dem Oberflächenmesswerkzeug (unten) hervorgehoben wurde. (C) Graphen, die Veränderungen der Wachstumsgeschwindigkeit im Laufe der Zeit für mehrere Axone zeigen. (D) Die durchschnittliche Wachstumsgeschwindigkeit von Axonen wird in (C) quantifiziert. (E) Schaubild der Veränderungen des Wachstumskegelvolumens im Zeitablauf. (F) Das durchschnittliche Volumen der Wachstumskegel wird in (E) quantifiziert; Maßstabsstab, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Abbildung 7: Radiale Migration und neuronale Polarisation pyramidaler kortikaler Neuronen. Diagramm, das die Entwicklung pyramidenförmiger kortikaler Neuronen (rosa) veranschaulicht, die radial von der keimventrikulären Zone (VZ) in Richtung der Pia-Oberfläche wandern. Geleitet von radialen Gliaprozessen (grau) etablieren wandernde polarisierte Neuronen einen führenden Prozess, den zukünftigen Dendrit, und einen nachlaufenden Prozess, das zukünftige Axon, die sich weiter nach unten in Richtung der Zwischenzone (IZ) erstrecken. Gestrichelte rote Kästchen stellen die kortikalen Bereiche dar, in denen Wachstumskegel abgebildet wurden. Speziell im IZ, in der subventrikulären Zone (SVZ) oder beim Verbinden von Axonbündeln (grün). Die Illustration wurde mit dem webbasierten Tool BioRender.com erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plasmid</td>
			<td>Konzentration (μg/μL)</td>
			<td>Verwendungszweck</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Markierung von membranzielgerichtetem Protein (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Wanne-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Wanne-alpha-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Markierung von filamentösem Aktin (F-Aktin) in Wachstumskegeln</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Unabhängige Markierung von zwei Populationen benachbarter Neuronen</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Wanne-alpha-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Wanne-alpha-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der im Protokoll verwendeten Plasmide. Name, Konzentration und Verwendungszweck jedes verwendeten Plasmids.
Ergänzendes Video 1: In situ Visualisierung der Wachstumskegeldynamik in akuten organotypischen Schnitten. Dynamik von Wachstumskegeln, die mit Lyn-mNeonGreen (oben links) und LifeAct-GFP (unten links) gekennzeichnet sind. Benachbarte Wachstumskegel werden mit dem dualen Plasmidsystem, das tRFP (Magenta; oben rechts) und ZsGreen (grün; unten rechts) enthält, unterschiedlich markiert. Bildgebungsintervall, 2,5 s. Maßstabsstäbe, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Wie Axone durch die komplexe Matrix des zentralen Nervensystems navigieren, ist eine grundlegende Frage in der Neurobiologie. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in der physiologischen Umgebung mit hochauflösender Bildgebung. Dieses Protokoll beschreibt eine benutzerfreundliche End-to-End-Pipeline für die Abgabe von DNA in das embryonale Gehirn der Maus, Präparate für hochwertige organotypische Schnitte und eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildaufnahme und -analyse.Obwohl ursprünglich entwickelt, um die Axondynamik im embryonalen Zentralnervensystem zu untersuchen, konnte dieses Protokoll angepasst werden, um eine organotypische Kultur und Visualisierung der Axonplastizität nach traumatischen oder pathologischen Zuständen zu ermöglichen. Das Protokoll selbst ist relativ einfach. Das Erreichen der ersten Kennzeichnung und die Erhaltung von Gehirnstrukturen sind jedoch kritische Punkte.Daher erfordern die Elektroporations-, Gehirndissektions- und Schneideschritte besondere Sorgfalt. Die Demonstration des Verfahrens wird hilfreich sein, und der Doktorand kommt aus dem Labor von Bracket. Machen Sie nach der Betäubung einer schwangeren weiblichen Maus einen Einschnitt, um beide Uterushörner mit einem Wattestäbchen herauszuziehen, der in warmer Kochsalzlösung oder Pinzette getränkt ist, und greifen Sie vorsichtig die Zwischenräume zwischen den Embryonen ein.Legen Sie dann die Embryonen auf nasse Gaze. Nachdem Sie den Gebärmuttersack aufgeschnitten haben, entfernen Sie jeden Embryo. Geben Sie die Embryonen in eine 10 Zentimeter große Schale, die HBSS enthält, ergänzt mit Glukose auf Eis.Für die Ex-utero-Elektroporation nehmen Sie einen Embryo auf und legen Sie ihn in den Halter. Führen Sie dann vorsichtig die Glaskapillare mit der DNA-Fast-Green-Mischung durch den Embryonenschädel in den lateralen Ventrikel ein und injizieren Sie zwei bis drei Mikroliter der DNA-Plasmidmischung in jeden Ventrikel. Als nächstes halten Sie den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden im entsprechenden Winkel, um den gewünschten Gehirnbereich anzuvisieren, wobei die Kathode dem Bereich zugewandt ist, in dem der DNA-Transfer beabsichtigt ist.Für die Elektroporation in utero, nachdem Sie die Uterushörner herausgezogen und die Embryonen auf eine nasse Gaze gelegt haben, wie zuvor gezeigt, verwenden Sie die Fingerspitzen, um den Embryo sanft in der Gebärmutter zu drehen, bis sich die lambdoidalen und saggitalen Nähte befinden. Führen Sie dann vorsichtig die Glaskapillare mit der DNA Fast Green Mix durch die Gebärmutterwand und den Embryonenschädel in den Seitenventrikel ein und injizieren Sie zwei bis drei Mikroliter der DNA-Plasmidmischung nach Belieben in einen oder beide Ventrikel mit maximal zwei Mikrolitern pro Ventrikel. Halten Sie nach der Injektion den Kopf des Embryos zwischen Platinpinzettenelektroden im entsprechenden Winkel, um den gewünschten Gehirnbereich mit der Kathode zu erreichen, die dem Bereich zugewandt ist, in dem der DNA-Transfer beabsichtigt ist.Sobald alle erforderlichen Embryonen elektroporiert wurden, verwenden Sie eine salzhaltige Wattestäbchen, um die Uterushörner vorsichtig wieder in die Bauchhöhle zu legen. Nähen Sie die Muskel- und Hautschnitte mit 5-0-Nahtmaterial, sichern Sie dann die Wunde mit Nahtklammern und desinfizieren Sie die Wunde, indem Sie sie mit Betadin besprühen. Legen Sie die Maus zurück in den Erholungskäfig und halten Sie die Wärme mit einem Ferninfrarot-Wärmelicht für mindestens 20 Minuten nach dem Eingriff aufrecht.Fixieren Sie den Kopf des Embryos unter einem Dissektionsmikroskop. Entfernen Sie dann die Haut im Schädel, indem Sie entlang der Mittellinie schneiden, beginnend von der Basis des Kopfes in Richtung Nase. Schälen Sie die Haut im Schädel seitlich und machen Sie eine ausreichend große Lücke, damit das Gehirn entfernt werden kann.Als nächstes, um das Gehirn zu entfernen, setzen Sie die geschlossene Spitze der sterilen Dissektionsschere ein, die unter dem Riechkolben beginnt und sich in Richtung des Hirnstamms bewegt. Dann schneiden Sie den Hirnstamm ab und schneiden Sie viele lose Stücke von Hirnhäuten um das Gehirn herum. Nehmen Sie mit einem perforierten Löffel das Gehirn auf und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit, indem Sie den Boden des Löffels gegen trockenes Seidenpapier tupfen.Dann legen Sie das Gehirn in eine Agaroseschale auf Eis. Als nächstes mischen Sie mit einem kleineren Löffel die Agarose für 10 Sekunden für eine gleichmäßige Abkühlung, dann manövrieren Sie das Gehirn in die Mitte der Schale, legen Sie sie horizontal mit der dorsalen Seite nach oben und stellen Sie sicher, dass sie vollständig mit Agarose aus allen Richtungen bedeckt ist. Nehmen Sie den Agaroseblock vorsichtig vom Vibratome-Arbeitsplatz auf und trocknen Sie den Boden, indem Sie gegen Seidenpapier tupfen.Legen Sie dann den Block auf den geklebten Bereich des Probenhalters mit der rostralen Seite des Gehirns nach oben und legen Sie den Probenhalter auf Eis. Lassen Sie den Kleber eine Minute trocknen. Schneiden Sie das Gehirn in koronale Scheiben in einem Winkel von 15 Grad.Sammeln Sie dann mit sauberen Spateln die Gehirnscheiben und legen Sie sie mit Parrafin auf eine PTFE-Membran, die in einer 35-Millimeter-Glasbodenschale immobilisiert ist. Sammeln Sie bis zu fünf Gehirnscheiben pro Membran. Als nächstes entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette die überschüssige HBSS-Glucoselösung aus der Nähe der Scheiben auf der Membran, wobei die Scheiben halbtrocken bleiben, dann fügen Sie 500 Mikroliter vorgewärmte Schichtmedien direkt in den Raum unter der Membran hinzu und inkubieren Sie die Scheiben bei 35 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Für die Bildgebung des Axonwachstums lokalisieren Sie eine Kortexregion mit niedriger bis mittlerer Zelldichte. Für die Abbildung der Wachstumskegeldynamik lokalisieren Sie einen Wachstumskegel in der unmittelbaren Zone oder subventrikulären Zone des Kortex. Als nächstes definieren Sie eine Z-Stack-Größe.Für das Axonwachstum in einem großen Z-Stapel stellen Sie eine Schrittgröße von zwei Mikrometern ein und für Wachstumskegel in einem kleineren Z-Stapel eine Schrittgröße von einem Mikrometer. Öffnen Sie für die Datenanalyse die Bilddatei in Fidschi, indem Sie auf Datei klicken, dann öffnen und das Bild auswählen. Erhalten Sie die maximale Intensität der Projektion des Zeitraffers, indem Sie auf das Bild klicken, gefolgt von Stapeln, Z-Projektion und Projektion mit maximaler Intensität.Gehen Sie durch den Zeitraffer und lokalisieren Sie ein wachsendes Axon. Zeichnen Sie nach dem Auffinden eine Linie durch das wachsende Axon, beginnend mit der Spitze des Axons im ersten Bild und dem Axon durch den gesamten Zeitraffer. Als nächstes singen Sie das Plugin kymo re-slice wide.Legen Sie den Maßstab des Kymographen fest, indem Sie zu Bild und dann zu Eigenschaften gehen. Nachdem Sie den Abstand in Mikrometern und die Pixelbreite und die Zeit in Sekunden oder Minuten und die Pixelhöhe festgelegt haben, gehen Sie zu Analysieren und klicken Sie auf Messen. Um das Volumen des Wachstumskegels zu messen, öffnen Sie die Bilddatei in der Bildanalysesoftware, indem Sie auf Datei klicken, öffnen und die gewünschte Datei auswählen.Wählen Sie dann in Schritt eins unter Algorithmuseinstellungen die Option Nur einen Bereich von Interesse segmentieren aus, und schneiden Sie in Schritt zwei den Rahmen so zu, dass er in den gesamten Wachstumskegel in allen Frames passt. Als nächstes in Schritt drei, halten Sie die Schwelle auf absolute Intensität und in Schritt vier, stellen Sie sicher, dass die gesamte Wachstumskegelregion geschwemmt ist. Wählen Sie dann in Schritt fünf unter Filtertyp die Anzahl der Voxel LMG auf eins aus.Wählen Sie die Schaltfläche Ausführen aus, um alle Erstellungsschritte auszuführen und den Assistenten zum Hinzufügen neuer Flächen zu beenden. Wählen Sie schließlich auf der Registerkarte Statistiken oben im Fenster des Assistenten bestimmte Werte und Volumes auf der Registerkarte "Detailliert" aus. Typischerweise zeigen erfolgreich kultivierte Gehirnschnitte, die entweder aus der In-utero- oder Ex-utero-Elektroporation stammen, eine normale zelluläre Verteilung und eine organisierte Anordnung radialer Gliazellen mit apikal orientierten Pilo-Kontaktierungsprozessen.Gelegentlich werden eine Ex-utero-Elektroporation beobachtet, die Störungen im radialen Glia-Gerüst und kultivierten Hirnschnitten markiert, was diese Kontrollfärbung empfehlenswert macht. Ein repräsentatives pyramidenförmiges kortikales projizierendes Neuron, das Lyn-mNeonGreen exprimiert, und das dynamische Verhalten seines Wachstumskegels werden hier gezeigt. Zusätzlich wurden Neuronen mit einer plasmidexprimierenden Aktinsonde markiert, um die Aktindynamik von axonalen Wachstumskegeln in situ zu analysieren.In-situ-Experimente wurden auch mit einem dualen Cre-Dre-Fluorophor-exprimierenden Plasmid-Design durchgeführt, bei dem tRFP- oder ZsGreen-Fluorophore spezifisch und individuell durch Dre- bzw. Cre-Rekombinasen in benachbarten Neuronen aktiviert werden konnten. Aus Kymographen werden dynamische Wachstumsparameter wie Wachstumsgeschwindigkeit für mehrere Axone und Wachstumskegelvolumen im Laufe der Zeit leicht gewonnen. Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit des Aktinlaufbandes und das Gleichgewicht zwischen Filopodien und Lamellapodien während der Wachstumskegelerkundungsaktivität zu bewerten.Es ist wichtig, die Gehirnstruktur aufrechtzuerhalten und die Plasmidkonzentrationen fein abzustimmen, um eine spärliche Markierung zu erreichen. Dies ist entscheidend für die genaue Visualisierung von Axonen und Wachstumskegeln im Kortex. Abhängig von den ausgewählten Plasmen und dem genetischen Hintergrund ermöglicht dieses Protokoll den Benutzern, Neuronen oder die Umgebung, in der sie wachsen, zu modifizieren, was eine breite Palette von Studien ermöglicht.Durch die Ermöglichung eines hochauflösenden Zugangs zu Neuronen in situ ermöglicht diese Technik Neurowissenschaftlern, die dynamische Interaktion zwischen Wachstumskegeln und den Metriken des zentralen Nervensystems sowohl auf morphologischer als auch auf molekularer Ebene zu untersuchen.

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Dieses Video zeigt die ex vivo Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen. Die Embryonen werden isoliert und in Agarose eingebettet. Mit Hilfe eines Vibratoms werden Scheiben erhalten, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthalten. Die Scheiben werden in Kultur aufbewahrt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.

Ex-vivo-Kultur und Bildgebung von okulomotorischen Schnitten aus transgenen Mausembryonen

Quelle: Wiegreffe, C., et. al.,  Konfokale Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen in der organotypischen Schnittkultur des embryonalen Mausgehirns unter Verwendung von In utero{ Elektroporation. {{}}J. Vis. Exp.{{TAG_ 44}} (2017) Dieses Video zeigt die konfokale Zeitraffermikroskopie, um die radiale Migration kortikaler Neuronen von der subventrikulären Zone zur kortikalen Platte über radiale Gliagerüste in transduzierten embryonalen Hirnschnitten der Maus zu beobachten.

Zeitraffer-Bildgebung der radialen Migration kortikaler Neuronen in transduzierten embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Neuroblast Migration ist ein grundlegendes Ereignis in der postnatalen Neurogenese. Wir beschreiben ein Protokoll für die effiziente Markierung von Neuroblasten durch in vivo Elektroporation postnatalen und anschließende Visualisierung der Migration mit Zeitraffer-Bildgebung der akuten Hirnschnitten. Wir sind eine Beschreibung für die quantitative Analyse von Neuroblast Dynamik von Video-Tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung von Motoneuron-Projektion und Axon Arborization in transgenen Hb9::GFP -Maus-Embryonen. Nach Immunostaining für Motoneuronen verwendeten wir Fluoreszenz lichtblattmikroskopie Bild Embryonen für anschließende Quantitative Analyse. Dieses Protokoll gilt für andere Neuron Navigation Prozesse in das zentrale Nervensystem.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Lernen Sie die hochauflösende Visualisierung von Axonwachstum und Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Mäusehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Mechanismen in situ.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

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