Name: Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie den mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustand in primären Neuronen mittels konfokaler Live-Mikroskopie und ratiometrischem Indikator in Echtzeit erfassen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Behandlungsstrategien zum Schutz von Mitochondrien.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FÜR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wird durch ein ERASMUS+ Stipendium unterstützt. Wir danken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner und Andrea Schlicksupp für die Präparation primärer Neuronen. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Die in Abbildung 4 gezeigten Experimente wurden am Nikon Imaging Center der Universität Heidelberg durchgeführt. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.

<ol><li>Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+equivalents+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics.</a> Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).</li>
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<li>Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+protects+neurons+against+calcium-mediated+oxidation+and+contraction+of+mitochondria+during+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).</li>
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<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
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<li>Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+redox+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent redox sensors.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).</li>
<li>Nietzel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-mediated+kick-start+of+mitochondrial+energy+metabolism+drives+resource-efficient+seed+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).</li>
<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
<li>Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mapping+of+hydrogen+peroxide+and+oxidized+glutathione+reveals+chemical+and+regional+specificity+of+redox+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).</li>
<li>Breckwoldt, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+analysis+of+mitochondrial+redox+signals+during+neuronal+physiology+and+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).</li>
<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
<li>Shokhina, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+redox-sensitive+biosensor+Grx1-roCherry%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry.</a> Redox Biology. 21, 101071(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Quantitative und dynamische Messungen des mitochondrialen Redoxzustandes liefern wichtige Informationen über die mitochondriale und zelluläre Physiologie. Es stehen mehrere fluorogene chemische Sonden zur Verfügung, die reaktive Sauerstoffspezies, "Redoxstress" oder "oxidativen Stress" erkennen. Die letztgenannten Begriffe sind jedoch nicht klar definiert und haben oft keine Spezifität9,17,18. Im Vergleich zu chemischen Farbstof...

Mehrere wichtige mitochondriale Enzyme und Signalmoleküle unterliegen der Thiol-Redox-Regulation1. Darüber hinaus sind Mitochondrien eine wichtige zelluläre Quelle reaktiver Sauerstoffspezies und selektiv anfällig für oxidative Schäden2. Dementsprechend wirkt sich das mitochondriale Redoxpotential direkt auf die Bioenergetik, die Zellsignalisierung, die mitochondriale Funktion und letztendlich auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus3,4. Die mitochondriale Matrix enthält hohe Mengen (1-15 mM) des Thiol-Disulfid-Redoxpuffers Glutathion (GSH), um die Redoxhomöostase aufrechtzuerhalten und die antioxidative Abwehr aufzubauen5,6. GSH kann kovalent an Zielproteine gebunden werden (S-Glutathionylierung), um ihren Redoxstatus und ihre Aktivität zu kontrollieren, und wird von einer Reihe von entgiftenden Enzymen verwendet, die oxidierte Proteine reduzieren. Daher ist das mitochondriale Glutathion-Redoxpotential ein sehr informativer Parameter bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktion und Pathophysiologie.
roGFP2 ist eine Variante von GFP, die durch Zugabe von zwei oberflächenexponierten Cysteinen, die ein künstliches Dithiol-Disulfid-Paar bilden, redoxempfindlich gemacht wurde7,8. Es hat einen einzelnen Emissionspeak bei ~510 nm und zwei Anregungsspitzen bei ~400 nm und 490 nm. Wichtig ist, dass die relativen Amplituden der beiden Anregungsspitzen vom Redoxzustand von roGFP2 abhängen (Abbildung 1), was dieses Protein zu einem ratiometrischen Sensor macht. Im Grx1-roGFP2-Sensor wurde humanes Glutaredoxin-1 (Grx1) mit dem N-Terminus von roGFP29,10 verschmolzen. Die kovalente Bindung des Grx1-Enzyms an roGFP2 ermöglicht zwei wesentliche Verbesserungen des Sensors: Es macht die Sensorantwort spezifisch für das GSH/GSSG-Glutathion-Redox-Paar (Abbildung 1) und beschleunigt das Gleichgewicht zwischen GSSG und roGFP2 um einen Faktor von mindestens 100.0009. Daher ermöglicht Grx1-roGFP2 eine spezifische und dynamische Abbildung des zellulären Glutathion-Redoxpotentials.
Grx1-roGFP2-Bildgebung kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, einschließlich Weitfeldfluoreszenzmikroskopen, rotierenden konfokalen Scheibenmikroskopen und konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Expression des Sensors in primären Neuronen kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, darunter Lipofektion11, DNA/Calcium-Phosphat-Kopräzipitation12, virusvermittelter Gentransfer oder die Verwendung transgener Tiere als Zellquelle (Abbildung 2). Pseudotypisierte rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV), die ein 1:1-Verhältnis von AAV1- und AAV2-Kapsidproteinen 13,14 enthielten, wurden für die Experimente in diesem Artikel verwendet. Mit diesem Vektor wird die maximale Sensorexpression typischerweise 4-5 Tage nach der Infektion erreicht und bleibt mindestens zwei Wochen lang stabil. Wir haben Grx1-roGFP2 erfolgreich in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen von Mäusen und Ratten eingesetzt.
In diesem Artikel wird die rAAV-vermittelte Expression von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Ratte verwendet, um den basalen mitochondrialen Glutathion-Redoxzustand und seine akute Störung zu beurteilen. Für die konfokale Live-Bildgebung wird ein Protokoll mit detaillierten Anweisungen bereitgestellt, wie (i) die Einstellungen für konfokale Laserscanning-Mikroskope optimiert, (ii) ein Live-Imaging-Experiment durchgeführt und (iii) Daten mit FIJI analysiert werden können.

<table><tbody><tr><td><starke>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Diamid (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908,1</td><td></td></tr><tr><td>Glukose (2,5 M Stammlösung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M Stammlösung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-aspartat (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (0,1 M Stammlösung)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Ethylesterperchlorat (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imagingKammer</td><td>Life Imaging Services (Basel, Schweiz)</td><td>10920</td><td>Ludin-Kammer Typ 3 für & Oslash; 12mm Deckgläser</td></tr><tr><td>Laser Scanning Konfokalmikroskop, Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Konfokalmikroskop, Scaneinheit</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltikpumpe</td><td>VWR</td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disc Konfokalmikroskop, Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disc Konfokalmikroskop, Inkubationssystem</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Spinning-Disc-Mikroskop, Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-Mikroskop</td><td></td></tr>, <tr><td>konfokales Spinning-Disc-Mikroskop, Scan-Einheit</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>StackReg-Plugin</td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</tr><tr><td>TurboReg-Plugin</td><td></td><td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td></tr></tbody></table>

live-bildgebung des mitochondrialen glutathion-redox-zustands in primären neuronen unter verwendung eines ratiometrischen indikators

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

Die mitochondriale Redoxhomöostase ist wichtig für die neuronale Lebensfähigkeit und Funktion. Obwohl Mitochondrien mehrere Redoxsysteme enthalten, gilt der sehr häufige Thiol-Disulfid-Redoxpuffer Glutathion als zentraler Akteur in der antioxidativen Abwehr. Daher liefert die Messung des mitochondrialen Glutathion-Redoxpotentials nützliche Informationen über den mitochondrialen Redoxstatus und oxidativen Stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) ist ein genetisch kodierter, auf grün fluoreszierendem Protein (GFP) basierender ratiometrischer Indikator des Glutathion-Redoxpotentials, der zwei Redox-Zustands-sensitive Anregungspeaks bei 400 nm und 490 nm mit einem einzigen Emissionspeak bei 510 nm aufweist. Dieser Artikel beschreibt, wie man konfokale Live-Mikroskopie von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen durchführt. Es beschreibt, wie das mitochondriale Glutathion-Redoxpotenzial im Steady-State-Stadium beurteilt werden kann (z. B. zum Vergleich von Krankheitszuständen oder Langzeitbehandlungen) und wie Redoxveränderungen bei akuten Behandlungen gemessen werden können (am Beispiel des exzitoxischen Arzneimittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA). Darüber hinaus stellt der Artikel die Co-Imaging von Grx1-roGFP2 und dem mitochondrialen Membranpotentialindikator Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) vor, um zu demonstrieren, wie Grx1-roGPF2 mit zusätzlichen Indikatoren für multiparametrische Analysen gemultiplext werden kann. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie (i) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopeinstellungen optimiert, (ii) Medikamente zur Stimulation mit anschließender Sensorkalibrierung mit Diamid und Dithiothreitol angewendet und (iii) Daten mit ImageJ/FIJI analysiert werden.

Quantifizierung von Unterschieden im stationären mitochondrialen Redoxzustand nach Wachstumsfaktorentzug Um die Quantifizierung von Steady-State-Unterschieden im mitochondrialen Redoxzustand zu demonstrieren, wurden primäre Neuronen, die in einem Standardmedium gezüchtet wurden, mit Neuronen verglichen, die 48 Stunden vor der Bildgebung ohne Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Der Entzug des Wachstumsfaktors führt nach 72 h16 zum apoptotischen neuronalen Zelltod. Die Zellen wu...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Diese Methode ermöglicht es zu untersuchen, wie der mitochondriale Redoxzustand unter pathophysiologischen Bedingungen beeinflusst wird. Es kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu bewerten, die auf den Schutz der Mitochondrien abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Organ und eine spezifische Beurteilung dynamischer und nachverfolgender Veränderungen des Redoxzustands der Mitochondrien in Echtzeit ermöglicht.Diese Methode kann mit zusätzlichen Indikatoren kombiniert werden, um neben dem Redoxzustand auch mitochondriales Membranpotential oder Calciumkonzentrationen gleichzeitig zu erfassen. Dieses Protokoll kann auf Kulturzellen, Gewebeexplantaten und Schnittkulturen angewendet werden. Beginnen Sie mit der Optimierung der Einstellungen des konfokalen Rastermikroskops.Stellen Sie dazu den Detektor auf 12 Bit oder 16 Bit ein, aktivieren Sie den sequenziellen Scanmodus und fügen Sie eine zweite Sequenz/Spur hinzu. Wählen Sie für beide Kanäle eine Pseudofarb-Nachschlagetabelle aus, die über- und unterbelichtete Pixel anzeigt, und wählen Sie dann ein Objektiv aus, das für das Objekt von Interesse geeignet ist. Montieren Sie einen Deckglas mit Zellen in die Bildgebungskammer.Fügen Sie einen Milliliter Bildpuffer hinzu und legen Sie die Kammer auf das Mikroskop. Verwenden Sie das Okular und das durchgelassene Licht, um die Zellen zu fokussieren. Nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Pixelformaten und Lochgrößen auf.Nehmen Sie dann Bilder mit unterschiedlichen Laserintensitäten auf und passen Sie die Detektorverstärkung und den Schwellenwert entsprechend an. Nehmen Sie schließlich Bilder mit unterschiedlichen Scangeschwindigkeiten und unterschiedlichen Bilddurchschnitten auf. Stellen Sie für die Live-Bildgebung das Zeitrafferintervall auf 30 Sekunden und die Dauer auf 25 Minuten ein.Montieren Sie dann die Zellen, legen Sie die Kammer auf das Mikroskop und fokussieren Sie die Zellen wie zuvor gezeigt. Wechseln Sie in den Scan-Modus und verwenden Sie den 488-Nanometer-Kanal in der Live-Ansicht, um die Zellen für die Bildgebung zu fokussieren und zu lokalisieren. Um die Anzahl der aufgezeichneten Zellen pro Durchlauf zu erhöhen, verwenden Sie optional die Multi-Point-Funktion, um zwei bis drei Sichtfelder pro Deckglas abzubilden.Starten Sie die Zeitraffererfassung und nehmen Sie fünf Bilder als zweiminütige Baseline-Aufnahme auf. Fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 3X NMDA-Lösung hinzu, um die Endkonzentration von 30 Mikromol zu erreichen, und zeichnen Sie zusätzliche 20 Bilder als 10-minütige NMDA-Reaktion auf. Als nächstes fügen Sie der Kammer 500 Mikroliter 4X DA-Lösung hinzu und nehmen sechs weitere Bilder auf.Saugen Sie den Puffer aus der Bildgebungskammer ab und ersetzen Sie ihn durch einen Milliliter DVB-T-Lösung. Nachdem Sie 10 weitere Bilder aufgenommen haben, beenden Sie die Aufnahme und speichern Sie die Bildserie. Um die Daten in die Bildanalysesoftware zu importieren, klicken Sie auf Plugins, wählen Sie Bio-Formate und dann Bio-Format-Importer.Wählen Sie im Dialogfeld Hyperstack im Ansichtsstapel mit aus, legen Sie den Farbmodus als Standard fest und wählen Sie automatische Skalierung. Ändern Sie das Bildformat in 32 Bit, indem Sie auf Bild klicken, Typ auswählen und dann aus den Optionen 32 Bit auswählen. Um die Farbkanäle in separate Fenster aufzuteilen, klicken Sie auf Bild, gehen Sie zu Farbe und wählen Sie geteilte Kanäle.Passen Sie den Schwellenwert an, um die Mitochondrien für die Analyse auszuwählen, indem Sie auf das Bild klicken und Anpassen und Schwellenwert auswählen. Wählen Sie im Dialogfeld den standardmäßigen roten dunklen Hintergrund und das Stapelhistogramm aus. Wenn die ausgewählten Pixel rot erscheinen, klicken Sie auf Übernehmen.Wählen Sie dann Set background pixels to NAN verarbeiten alle Bilder und führen Sie den gleichen Vorgang für Kanal zwei aus. Um das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern zu visualisieren, erstellen Sie ein Verhältnisbild, indem Sie auf Prozess und Bildrechner klicken. Wählen Sie im Dialogfeld Kanal eins in Bild eins teilen in Vorgang Kanal zwei in Bild zwei.Wählen Sie dann Neues Fenster erstellen und alle Bilder verarbeiten. Ändern Sie die Nachschlagetabelle des Verhältnisbilds in Pseudofarbe, indem Sie auf Bild klicken, Nachschlagetabellen auswählen und dann auslösen. Um das Bild zu analysieren, zeichnen Sie ROIs um einzelne Zellen oder Mitochondrien auf dem Verhältnisbild.Um die ROIs zum ROI-Manager hinzuzufügen, gehen Sie zu Analysieren, klicken Sie auf die Tools, wählen Sie ROI-Manager, klicken Sie auf Hinzufügen und wählen Sie Alle anzeigen. Um die 405- bis 488-Nanometer-Verhältnisse einzelner Zellen zu messen, klicken Sie auf ROI-Manager, wählen Sie alle ROIs durch Drücken von Control A aus, gehen Sie zu more und wählen Sie multi-measure. Wählen Sie im Dialogfeld Alle Slices und eine Zeile pro Slice messen aus.Nachdem Sie die Messungen in die Tabellenkalkulationssoftware exportiert haben, wählen Sie das 405-Nanometer-Bild aus, messen Sie die Intensität aller ROIs und exportieren Sie die Messungen erneut in die Tabellenkalkulationssoftware. Messen Sie in ähnlicher Weise die ROI-Intensitäten des 488-Nanometer-Bildes. Um die ROIs für zukünftige Referenzzwecke zu speichern, wählen Sie alle ROIs aus, indem Sie Steuerung A drücken, gehen Sie zu mehr und wählen Sie Speichern.Diese repräsentativen Schnappschüsse aus einer Zeitrafferaufzeichnung zeigen Verhältnisbilder von Neuronen vor und nach der NMDA-Behandlung und nach der Max/Min-Kalibrierung mit DA und DTT. Die Behandlung der Neuronen mit 30 mikromolarer NMDA induzierte die Mitochondria-Oxidation innerhalb weniger Minuten. Die Analyse einzelner Fluoreszenzkanäle ergab, dass die NMDA-induzierte mitochondriale Azidose einen Abfall der GFP-Fluoreszenz bei einer Anregung von 405 und 488 Nanometern verursachte.In einem Kontrollexperiment schloss die Vorbehandlung mit DA eine weitere Mitochondria-Oxidation durch NMDA aus. Und dementsprechend änderte sich das Verhältnis 405 zu 488 trotz einer erheblichen Abschreckung der redoxsensitiven GFP2-Fluoreszenzintensität nicht. Dieses Experiment bestätigte, dass das Verhältnis von 405 zu 488 Nanometern nicht durch pH-Änderungen beeinflusst wird.In einem separaten Experiment wurden das mitochondriale Membranpotential, der Redoxzustand und die Morphologie parallel bewertet. Die Behandlung der Neuronen mit 60 mikromolarer NMDA führte zum Verlust des Tetramethylrhodamin- oder TMRE-Signals und zu einer Erhöhung des Rho-GFP-Verhältnisses von 405 bis 488 Nanometern, gefolgt von einer verzögerten Auffrischung der Mitochondrien. Wenn Sie mit der Anwendung dieser Methode beginnen, ist es sehr wichtig, sich Zeit zu nehmen, um die mikroskopischen Einstellungen sorgfältig zu optimieren.Dies wird dazu beitragen, die Neuronen während Ihrer Experimente gesund zu halten. Es ist auch sehr wichtig, die Lasersicherheitsregeln immer zu beachten. Stellen Sie sicher, dass Sie keiner Laserstrahlung ausgesetzt sind, wenn Sie während Live-Aufnahmen Medikamente zur Manipulation hinzufügen.

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Wir beschreiben ein Protokoll, das Bildgebung von Mitochondrien ermöglicht in lebenden Nervenzellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie über einen längeren Zeitraum. Imaging über längere Zeiträume durch Lentivirus-vermittelte Expression von mitochondrial gezielte fluoreszierendes Protein und Verwendung eines kostengünstigen Bühne-Top-Inkubator, entworfen und gebaut wurde in unserem Labor durchgeführt.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

Wir demonstrieren die Anwendung der Fluoreszenz-Indikator, TMRM, in kortikalen Neuronen, die relativen Veränderungen in TMRM Fluoreszenzintensität vor und nach der Anwendung eines bestimmten Stimulus zu bestimmen. Wir zeigen auch die Anwendung der Fluoreszenz-Sonde...

Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Quelle: Katsalifis, A., et al. Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Bildgebung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Fluoreszenzindikators. Durch Anlegen von zwei Anregungswellenlängen unter einem Fluoreszenzmikroskop wird das Fluoreszenzintensitätsverhältnis gemessen, um die mitochondriale Oxidation zu...

Abbildung des mitochondrialen Redoxzustands in primären Neuronen mit Hilfe eines ratiometrischen Indikators

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder In Vivo

Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen...

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Dieser Artikel beschreibt die Methode zur mitochondrialen Zeitraffer-Bildgebung von Astrozytenkulturen, die mit dem MitoTimer-Biosensor ausgestattet sind, und die daraus resultierende multiparametrische Analyse der mitochondrialen Dynamik, Mobilität, Morphologie, Biogenese, Redoxzustand und Umsatz.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Systems in kultivierten Astrozyten

Diese Technik beschreibt einen effektiven Arbeitsablauf zur Visualisierung und quantitativen Messung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels in HeLa-Zellen mittels fluoreszenzbasierter Live-Bildgebung.

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

In diesem Video zeigen wir, Visualisierung von PKC-Translokation in lebenden Zellen mit fluoreszenzmarkierten PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Erfahren Sie, wie Sie den mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustand in primären Neuronen mittels konfokaler Live-Mikroskopie und ratiometrischem Indikator in Echtzeit erfassen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Behandlungsstrategien zum Schutz von Mitochondrien.

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators (Video) | JoVE Journal

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

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