Name: Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Untersuchung synaptischer Übertragung und Plastizität in akuten Gehirnschnitten von Nagetieren. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Charakterisierung spezifischer Synapsen.

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Diese Arbeit wird durch das Wellcome-Stipendium 206401/Z/17/Z unterstützt. Wir danken Zafar Bashir für seine fachkundige Betreuung und Dr. Clair Booth für die technische Unterstützung und Kommentare zum Manuskript.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Erforschung hochspezifischer synaptischer Projektionen mit großer Reichweite unter Verwendung einer Kombination aus stereotaktischer Chirurgie, um AAVs zu liefern, die optogenetische Konstrukte kodieren, und Elektrophysiologie in akuten Hirnschnitten (Abbildung 1). Zusammen bieten diese Techniken Werkzeuge, um die Physiologie und Plastizität von Gehirnschaltkreisen mit hoher Präzision in weiträumigen und anatomisch diffusen Bahnen z...

Das Verständnis der Physiologie von Synapsen und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist grundlegend für das Verständnis, wie Gehirnnetzwerke im gesunden Gehirn funktionieren1 und wie sie bei Hirnerkrankungen fehlfunktionieren. Die Verwendung von akuten ex vivo Gehirnschnitten ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von Synapsen einzelner Neuronen mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Die Kontrolle des Membranpotentials und die einfache pharmakologische Manipulation ermöglichen die Isolierung von Rezeptorsubtypen. Diese Aufnahmen können mit exquisiter Spezifität gemacht werden, um das postsynaptische Neuron zu identifizieren, einschließlich laminarer und subregionaler Position2, zellulärer Morphologie3, Vorhandensein molekularer Marker4, seiner afferenten Projektionen5 oder sogar, wenn es kürzlich aktiv war6.
Das Erreichen der Spezifität präsynaptischer Inputs ist jedoch etwas schwieriger. Die konventionelle Methode hat Stimulationselektroden verwendet, um die Axone anzuregen, die in einer bestimmten Lamina verlaufen. Ein Beispiel dafür ist der Hippocampus, wo lokale Stimulation im Stratum radiatum Synapsen aktiviert, die vom CA3 in das CA1-Teilfeld7 projizieren. In diesem Fall wird eine präsynaptische Spezifität erreicht, da der CA3-Input den einzigen exzitatorischen Input darstellt, der sich innerhalb des Stratum radiatum befindet, das auf CA1-Pyramidenzellen8 projiziert. Dieser hohe Grad an Eingangsspezifität, der mit konventioneller elektrischer präsynaptischer Aktivierung von CA3-CA1-Axonen erreicht werden kann, ist jedoch eine Ausnahme, die sich in der intensiven Studie widerspiegelt, der diese Synapse unterzogen wurde. In anderen Hirnregionen koexistieren Axone aus mehreren afferenten Signalwegen in derselben Lamina, beispielsweise in Schicht 1 des Neocortex9, so dass eine inputspezifische präsynaptische Stimulation mit herkömmlichen Stimulationselektroden unmöglich wird. Dies ist problematisch, da verschiedene synaptische Inputs unterschiedliche physiologische Eigenschaften haben können; Daher kann ihre Co-Stimulation zu einer Fehlcharakterisierung der synaptischen Physiologie führen.
Das Aufkommen der Optogenetik, der genetischen Kodierung von lichtempfindlichen Membranproteinen (Opsinen) wie Kanalrhodopsin-2 (ChR2), hat eine enorme Erweiterung der Möglichkeiten zur Untersuchung isolierter synaptischer Projektionen zwischen Gehirnregionen ermöglicht10,11. Hier beschreiben wir eine verallgemeinerbare und kostengünstige Lösung zur Untersuchung der synaptischen Physiologie und Plastizität mit großer Reichweite. Die optogenetischen Konstrukte werden hochspezifisch mit Hilfe viraler Vektoren geliefert, die eine äußerst präzise Kontrolle der präsynaptischen Region von Interesse ermöglichen. Efferente Projektionen drücken den lichtaktivierten Kanal aus, der die Aktivierung dieser Fasern in einer Zielregion ermöglicht. So können langreichweitige, anatomisch diffuse Signalwege untersucht werden, die durch herkömmliche, unspezifische, elektrische Stimulation nicht unabhängig aktiviert werden können.
Wir beschreiben als Beispielweg die Transduktion des medialen präfrontalen Kortex (mPFC) mit adeno-assoziierten Viren (AAVs), die exzitatorische Kationenkanal-Opsine kodieren. Wir beschreiben dann die Herstellung von akuten Schnitten aus lateralem entorhinalen Kortex (LEC), Patch-Clamp-Aufnahmen von LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 und die lichtevozierte Aktivierung glutamaterger mPFC-LEC-Projektionen (Abbildung 1). Wir beschreiben auch die histologische Beurteilung der Injektionsstelle, um die Lage der präsynaptischen Region von Interesse zu bestätigen und die postsynaptische Zellmorphologie zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Röhrchen</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 & Mikro; L-Pipette</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>3-Wege-Luer-Ventil</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidin (DAB) Substrat</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopyridin</td><td>Hallo Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>4x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Viraler Titer: 3,3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>Achromatische Linse</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Fokussiert das visuelle Spektrum und das nahe IR</td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicat-Glaskapillare</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Kamera - Qimaging Retiga Electro Photometrics</td><td></td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhexidin OP-Peeling</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td></tr><tr><td>Kollimationskondensorlinse</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Cyanacrylat-Kleber</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungsgerät</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel 500 nm Langpass</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel 600 nm Langpass</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegelwürfel</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenhalter mit seitlichem Anschluss</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Anregungsfilter</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Augengel</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Feiner Pinsel</td><td>Wissenschaftlicher Laborbedarf</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>Guillotine</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-Gluconat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Kinematischer Fluoreszenzfilter Würfel</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>LED-Treiber</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Lidocain Salbe</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobohrer</td><td>Harvard Apparatur</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter Instrumente</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsspritze</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektionsspritzennadel</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Kundenspezifische Spezifikation: Stärke 33, Länge 15 mm, Punktform 4 - 12 Grad;</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe für Mikroinjektion</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Montiert blaue LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>Montiert grüne LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Die Differential-Interferenz-Kontrast-Optik (DIC) wird für die gebrochene IR-Bildgebung von Scheiben verwendet und ist eine weitere häufig verwendete Methode.</td></tr><tr><td>OCT-Medium</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Optimales Schnitttemperaturmedium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Aufnahmekammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Scheibenanker</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen</td><td>Kopf</td><td>Modell 902</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Halter für Mikrobohrer</td><td>Harvard Apparat</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Naht</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter für intrazelluläre Aufzeichnung Lösung</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxincitrat</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechte Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Bausatz</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>Version 2.32</td><td>Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose-Schneidlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intrazellulär?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenetische befragung der synaptischen Übertragung und plastizität über große entfernungen vom medialen präfrontalen kortex zum lateralen entohinalen kortex

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Die Untersuchung der physiologischen Eigenschaften bestimmter Synapsen im Gehirn und wie sie plastische Veränderungen erfahren, ist eine zentrale Herausforderung in den modernen Neurowissenschaften. Traditionelle elektrophysiologische In-vitro-Techniken verwenden elektrische Stimulation, um eine synaptische Übertragung hervorzurufen. Ein großer Nachteil dieser Methode ist ihre unspezifische Natur; Alle Axone im Bereich der stimulierenden Elektrode werden aktiviert, was es schwierig macht, einen Effekt einer bestimmten afferenten Verbindung zuzuordnen. Dieses Problem kann überwunden werden, indem die elektrische Stimulation durch eine optogenetisch-basierte Stimulation ersetzt wird. Wir beschreiben eine Methode zur Kombination von Optogenetik mit in vitro Patch-Clamp-Aufnahmen. Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung sowohl der basalen synaptischen Übertragung als auch der synaptischen Plastizität präziser anatomisch definierter synaptischer Verbindungen und ist auf fast jeden Signalweg im Gehirn anwendbar. Hier beschreiben wir die Herstellung und Handhabung eines viralen Vektors, der für das Kanalrhodopsin-Protein kodiert, zur chirurgischen Injektion in eine präsynaptische Interessenregion (medialer präfrontaler Kortex) im Nagetiergehirn und zur Herstellung von akuten Schnitten nachgeschalteter Zielregionen (lateraler entorhinaler Kortex). Ein detailliertes Verfahren zur Kombination von Patch-Clamp-Aufnahmen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation zur Untersuchung der kurz- und langfristigen synaptischen Plastizität wird ebenfalls vorgestellt. Wir diskutieren Beispiele von Experimenten, die durch die Kombination von Optogenetik und Cre-abhängiger Zellmarkierung Signalweg- und Zellspezifität erreichen. Schließlich wird die histologische Bestätigung der präsynaptischen Region von Interesse zusammen mit der Biocytin-Markierung der postsynaptischen Zelle beschrieben, um eine weitere Identifizierung des genauen Ortes und des Zelltyps zu ermöglichen.

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man die synaptische Physiologie und Plastizität mit Hilfe der viralen Verabreichung optogenetischer Konstrukte untersucht. Das Protokoll kann sehr leicht angepasst werden, um fast jede Langstreckenverbindung im Gehirn zu untersuchen. Als Beispiel beschreiben wir die Injektion von AAVs, die ein Opsin in mPFC der Ratte kodieren, die Herstellung von akuten Schnitten aus LEC, Patch-Clamp-Aufnahmen von LEC-Pyramidenneuronen der Schicht 5 und die lichtevozierte Aktivierung von mPFC-Term...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Viral abgegebene optogenetische Konstrukte erlauben eine detaillierte elektrophysiologische Charakterisierung der Physiologie und Plastizität spezifischer Synapsen in akuten Hirnschnitten. Der Hauptvorteil der optogenetischen Aktivierung von Synapsen ist die Fähigkeit, weitreichende Signalwege zu untersuchen, und die selektive Stimulation von Axonen, die nicht anatomisch getrennt sind. Das Verfahren wird von Dr. Lisa Kinnavane, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus unserem Labor, demonstriert.Legen Sie zunächst eine Hamilton-Spritze in eine Mikroinjektionsspritzenpumpe, die an einem beweglichen Arm befestigt ist, der an einem stereotaktischen Rahmen montiert ist. Dann legen Sie ein Fünf-Mikroliter-Aliquot des Virus in eine Mikrozentrifuge. Drehen Sie die Tube für einige Sekunden und pipetten Sie zwei Mikroliter des viralen Präparats in den Deckel der Röhre.Um die Spritze mit dem viralen Präparat zu füllen, betrachten Sie die Nadelspitze mit einem Operationsmikroskop. Platzieren Sie dann manuell den Bolus des Virus an der Nadelspitze und ziehen Sie den Spritzenkolben mit den Pumpensteuerungen heraus. Stellen Sie das Einspritzvolumen der Pumpe auf 300 Nanoliter und die Durchflussrate auf 100 Nanoliter pro Minute ein.Lassen Sie die Pumpe laufen und bestätigen Sie den ordnungsgemäßen Durchfluss, indem Sie den Tröpfchen des Virus an der Nadelspitze beobachten. Nehmen Sie das Virus auf einem Wattestäbchen auf und reinigen Sie die Nadel mit 70% Ethanol. Als nächstes navigieren Sie mit den Einstellschrauben am stereotaktischen Rahmen die Nadelspitze zum Bregma und notieren Sie sich die stereotaktischen Messungen, die auf den drei Vernierskalen auf dem Rahmen beobachtet werden.Addieren oder subtrahieren Sie diese Entfernungen von Bregma-Koordinaten. Machen Sie ein Gratloch an der Schädeloberfläche mit einem Mikrobohrer, der am stereotaktischen Arm montiert ist. Führen Sie die Nadel an der vorgegebenen dorsoventralen Koordinate in das Gehirn ein und infundieren Sie ein vorgegebenes Volumen des Viruspräparats.Lassen Sie die Nadel nach der Infusion 10 Minuten in situ, um die Diffusion des Bolus zu ermöglichen. Entfernen Sie dann die Nadel und lassen Sie die Pumpe laufen, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht blockiert ist. Zwei Wochen nach der Virusinjektion euthanasieren Sie die Ratte, sezieren Sie schnell das gesamte Gehirn und übertragen Sie es in die Saccharose-Schneidelösung.Nehmen Sie mit einem Metallteelöffel das Gehirn auf, entsorgen Sie die überschüssige Lösung und legen Sie sie auf ein Filterpapier. Entfernen Sie mit einem Skalpell das Kleinhirn und schneiden Sie das Großhirn in der koronalen Ebene etwa zur Hälfte seiner Länge ab. Die hintere Hälfte ist der LEC-Gewebeblock.Bringen Sie den Gewebeblock und das verbleibende Gehirn zur Saccharose-Schneidelösung zurück. Als nächstes legen Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf eine Vibratom-Bühne und verteilen Sie ihn in einer dünnen Schicht. Nehmen Sie dann mit einem Teelöffel den LEC-Gewebeblock und übertragen Sie ihn auf das Klebepflaster, so dass der vordere koronale Schnitt haften geblieben ist.Installieren Sie die Stufe in die Vibratom-Gewebekammer und gießen Sie schnell ausreichend Saccharose-Schneidlösung, um das Gewebe einzutauchen. Nachdem Sie die ventrale Oberfläche des Gewebeblocks in Richtung Klinge ausgerichtet haben, schneiden Sie 350 Mikrometer dicke Scheiben von ventral nach dorsal mit einer langsamen Klingenvorschubgeschwindigkeit. Typischerweise können sieben Scheiben pro Hemisphäre erhalten werden.Übertragen Sie die Scheiben in die Schichtsammelkammer. Stellen Sie die Auffangkammer dann für eine Stunde in ein 34 Grad Celsius warmes Wasserbad, bevor sie wieder Raumtemperatur erreicht. Legen Sie den Rest des Gehirns für 48 Stunden in Paraformaldehyd.Zur Identifizierung der Zielzelle legen Sie die Scheibe in die Aufnahmekammer und immobilisieren sie mit einem Scheibenanker. Navigieren Sie bei geringer Vergrößerung mit Infrarotbeleuchtung zur LEC-Ebene fünf. Wechseln Sie dann zum Wasserimmersionsobjektiv mit hoher Vergrößerung und identifizieren Sie die pyramidalen Neuronen.Markieren Sie die Position der Zelle auf dem Monitor mit Klebeband. Als nächstes, um eine ganze Zellpflasterklemme zu bilden, stellen Sie eine Borosilikatglas-Mikropipette her und füllen Sie sie mit intrazellulärer Aufnahmelösung. Setzen Sie die gefüllte Mikropipette in den Elektrodenhalter ein und üben Sie einen positiven Druck aus, indem Sie hart in ein Mundstück blasen, das mit dem seitlichen Anschluss des Elektrodenhalters verbunden ist.Heben Sie das Mikroskopobjektiv so an, dass sich ein Meniskus bildet, und führen Sie die Elektrode in den Meniskus ein, bis sie auf dem Mikroskop zu sehen ist. Öffnen Sie das Fenster Dichtungstest, und stellen Sie fest, ob der Pipettenwiderstand drei bis fünf Megaohm beträgt. Berühren Sie dann die identifizierte Zelle mit einer Pipettenspitze, was zu einer Vertiefung in der Zellmembran führt.Als nächstes üben Sie Unterdruck durch Absaugen am Mundstück aus, wodurch der Pipettenwiderstand erhöht wird. Fahren Sie fort, allmählich Unterdruck anzuwenden, bis die Zellmembran reißt, was zu Transienten der gesamten Zellkapazität führt. Um in die aktuelle Klemmkonfiguration zu gelangen, verwenden Sie eine montierte LED, die mit Filterwürfeln und entsprechender Optik in den Lichtpfad des Mikroskops gerichtet ist, und legen Sie Lichtimpulse über das 40X-Objektiv auf die Scheibe auf.Liefern Sie Züge mit mehreren Lichtpulsen bei fünf Hertz, 10 Hertz und 20 Hertz, um die präsynaptischen Freisetzungseigenschaften zu untersuchen. Damit Biocytin das Neuron füllen kann, warten Sie mindestens 15 Minuten nach dem Eintritt in die gesamte Zellkonfiguration. Überwachen Sie in der Spannungsklemme die Membrankapazität und den Eingangswiderstand.Ziehen Sie dann die Pipette langsam entlang des Annäherungswinkels vom Soma der Zelle weg und beobachten Sie das langsame Verschwinden von Kapazitätstransienten und Membranstrom, was auf die Wiederversiegelung der Zellmembran und die Bildung eines Außenflecks an der Pipettenspitze hinweist. Legen Sie die Scheibe in Paraformaldehyd in einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie über Nacht. Befestigen Sie mit OCT-Medium einen Gewebeblock an der Kryostatprobenscheibe.Um das Gewebe einzufrieren, geben Sie Isopentan in einen geeigneten Behälter und tauchen Sie die Probenscheibe ein, um sicherzustellen, dass das Gewebe über dem Niveau des Isopentans liegt. Dann senken Sie den Behälter mit Isopentan in flüssigen Stickstoff und lassen Sie das Gewebe einfrieren. Sobald das Gewebe vollständig gefroren ist, lassen Sie den Gewebeblock 30 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius in der Kryostatkammer, damit sich die Temperatur des Blocks ausgleichen kann.Schneiden Sie nach dem Gleichgewicht 40 Mikrometer dicke Abschnitte in den Kryostaten und führen Sie die Abschnitte mit einem feinen Pinsel von der Klinge. Kleben Sie diese gefrorenen Abschnitte auf einen Poly-L-Lysin-beschichteten Objektträger mit Raumtemperatur, indem Sie den Objektträger an den Abschnitten berühren. Nachdem Sie jedem Objektträger 150 Mikroliter Montagemedium hinzugefügt haben, tragen Sie den Abdeckschein auf und entfernen Sie Luftblasen durch vorsichtiges Drücken auf den Abdeckschein.Decken Sie die Objektträger zum Schutz vor Fotobleiche ab und lassen Sie sie 12 Stunden an der Luft trocknen. Untersuchen Sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop die Lage der viralen Injektionsstelle. Für die Biocytinfärbung inkubieren Sie die Scheiben in 3% Wasserstoffperoxid in PBS für 30 Minuten, um jede endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.Dann waschen Sie die Gehirnscheiben mit PBS, bis keine weiteren Sauerstoffblasen mehr sichtbar sind. Als nächstes inkubieren Sie die Scheiben für drei Stunden in 1% Avidin-biotinylierter HRP-Komplexlösung in PBS, das 0,1% Triton X-100 enthält. Nach sechs PBS-Wäschen inkubieren Sie jede Scheibe in DAB-Lösung, bis die Biocytinfärbung neuronaler Strukturen sichtbar wird.Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Scheiben in kaltes PBS übertragen. Anschließend die Scheiben mit einem Pinsel auf die Glasmikroskop-Objektträger montieren. Nachdem Sie überschüssiges PBS entfernt haben, fügen Sie das Montagemedium hinzu.Decken Sie die Scheiben mit Abdeckstreifen ab und lassen Sie sie, wie zuvor demonstriert, an der Luft trocknen. Eine gesunde Pyramidenzelle wurde lokalisiert und gepatcht. Wenn eine postsynaptische Zellidentifikation erforderlich ist, sollte eine Zelle, die den fluoreszierenden Marker exprimiert, mit Hilfe einer Weitfeldoptik lokalisiert werden.Einzelne Lichtpulse von zwei Millisekunden führten zu einfachen wellenförmigen optogenetischen exzitatorischen postsynaptischen Potentialen. Die kurzfristige Plastizität der Synapse wird durch Anwendung von fünf, 10 und 20 Hertz Lichtstimulation untersucht. Bei der Untersuchung der Langzeitplastizität verursachte die Zugabe des cholinergen Agonisten Carbachol zum zirkulierenden aCSF für 10 Minuten eine langfristige Depression, die 40 Minuten nach Entfernung des Liganden noch sichtbar war.Die Länge der Injektionsstelle wurde histologisch untersucht. Der fluoreszierende Reporter mCherry wurde in den tieferen Schichten des prälimbischen und infralimbischen Kortex lokalisiert. Darüber hinaus bestätigte die Färbung einer mit Biozytin gefüllten Zelle ihre Lage und Morphologie.Die kritischen Schritte dieses Protokolls sind die genaue Transduktion der afferenten Hirnregion, die post-hoc überprüft werden kann, und die schnelle Dissektion des Gehirns bei der Herstellung akuter Schnitte. Dieses Verfahren lässt sich leicht mit der fluoreszierenden Markierung eines einzelnen Zelltyps kombinieren, beispielsweise einer bestimmten Interneuronen-Unterklasse. Um dies zu tun, würden wir ein transgenes Tier verwenden, das eine Rekombinase in diesem bestimmten Zelltyp exprimiert.Viral verabreichte optogenetische Konstrukte haben schnelle Fortschritte in den Bereichen System- und Schaltungsneurowissenschaften ermöglicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video zeigt ein Protokoll zur Untersuchung synaptischer Interaktionen und neuronaler Reaktionen in einem transfizierten Hippocampus-Hirnschnitt der Maus. Dabei werden sensorische Neuronen mit großer Reichweite beleuchtet, um Aktionspotentiale auszulösen, und die daraus resultierenden exzitatorischen postsynaptischen Potentiale im aufgezeichneten Neuron unter Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik aufgezeichnet.

Photostimulation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen in Hippocampus-Schnitten der Maus

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Optogenetische Ansätze sind weit verbreitet zu manipulieren neuronale Aktivität und bewerten die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion verwendet. Hier wird eine Technik erläutert , dass bei in - vivo - Expression des optischen Aktivator Channelrhodopsin, ermöglicht eine ex vivo Analyse der synaptischen Eigenschaften bestimmter großer Reichweite und lokale neuronale Verbindungen in Angst bezogenen Schaltungen.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Dieses Protokoll enthält einen Workflow, künstliche MicroRNA-vermittelten RNA-Interferenz mit Optogenetik Förderung insbesondere präsynaptischen Boutons mit reduzierten Expression von selektiven-Gens in intakte neuronale Schaltkreise zu kombinieren.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.

Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung

Ex-vivo-Gehirnschnitte können verwendet werden, um die Auswirkungen von flüchtigen Anästhetika auf evozierte Reaktionen auf afferente Inputs zu untersuchen. Optogenetik wird eingesetzt, um thalamokortikale und kortikokkortikale Afferenzen für nicht-primären Neokortex unabhängig zu aktivieren, und synaptische und Netzwerkantworten werden mit Isofluran moduliert.

Optogenetische Aktivierung afferenter Signalwege in Hirnschnitten und Modulation von Reaktionen durch flüchtige Anästhetika

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.

Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten

Hier stellen wir zwei Protokolle für die Aufzeichnung von Mikro-Elektrokortikographie (μEcoG) mit hoher Dichte bei Ratten und Mäusen vor, einschließlich chirurgischer, Implantations- und Aufzeichnungsmethoden. μECoG-Aufzeichnungen werden entweder in Kombination mit laminarer Polytrodenaufzeichnung im auditorischen Kortex der Ratte oder mit optogenetischer Manipulation der neuronalen Aktivität im somatosensorischen Kortex der Maus durchgeführt.

Multiskalige Untersuchungen der kortikalen Prozessierung durch Integration laminarer Polytroden und Optogenetik mit Mikroelektrokortikographie bei Nagetieren

Erfahren Sie die optogenetische Untersuchung synaptischer Übertragung und Plastizität in akuten Gehirnschnitten von Nagetieren. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Charakterisierung spezifischer Synapsen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex (Video) | JoVE Journal

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

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