Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms
15. April 2022
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.
Die Anwendung der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung namens FISH auf die genetische Risikostratifizierung beim multiplen Myelom ist unerlässlich. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale Plasmazellen, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetperlen sortiert oder markiert wurden, mit zytoplasmatischem Kappa- oder Lambda-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Tests namens cIg FISH. Interphase FISH nach Plasmazellsortierung oder cIg FISH erweist sich aufgrund des relativ geringen Anteils an Plasmazellen im Knochenmark als signifikant bei der Diagnose des multiplen Myeloms.
Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, darunter komplexe Prozesse, hohe Probenanforderungen und hohe experimentelle Kosten. Plasmazellen können in einem Knochenmarkabstrich schnell lokalisiert werden. Darauf aufbauend verwenden wir Knochenmarkabstrich FISH zum Nachweis von multiplen Myelomzellen.
Diese Studie wurde nach den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan genehmigt. Die Proben wurden von einem Patienten mit multiplem Myelom in der Abteilung für Hämatologie des Zhongnan-Krankenhauses der Universität von China Wuhan gesammelt. Legen Sie die ersten 0,2 Milliliter Knochenmarklösung auf einen sauberen Einweg-Glasobjektträger, verteilen Sie die Knochenmarkabstriche auf gleichmäßige Dicke und scharfe Schwänze, indem Sie das Knochenmark schnell entfernen und trocknen Sie es dann auf natürliche Weise.
Decken Sie die Knochenmarkfilme mit einem Milliliter Wright-Giemsa-Lösung für ca. 10 Sekunden bei Raumtemperatur ab. Geben Sie einen Milliliter Phosphatpuffer zu den Objektträgern, es war Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Farbstofflösung austrocknet oder von den Objektträgern fließt. Mischen Sie die Farbstofflösung vorsichtig und halten Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Spülen Sie die Rutschen mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft. Verwenden Sie die Vorwärtslichtmikroskopie, um bösartige Plasmazellen nachzuweisen, die Plasmazellen sollten gut verteilt sein. Was wir jetzt im Feld sehen, sind die Plasmazellen, die ziemlich verstreut sind.
Dies ist eine typische binukleare Kernplasmazelle. Decken Sie den hybridisierten Bereich 10 Minuten lang mit Fixierlösung ab, um Plasmazellen zu verfärben und zu fixieren. Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie ihn an der Luft bei Raumtemperatur.
Ein Glas mit zweifachem SSC-Puffer in einem Wasserbad auf 56 Grad Celsius vorheizen. Waschen Sie den vorbereiteten Knochenmarkabstrich im vorgewärmten zweifachen SSC-Puffer für 10 Minuten, gefolgt von einem Eintauchen in deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur. Dehydrieren Sie den Abstrich in einem Ethanolgradienten von jeweils 70% 85% und 100% Ethanol für jeweils eine Minute.
Trocknen Sie den Abstrich 10 Minuten lang an der Luft. Zuerst TP53 auf Zentromer der Chromosom-17-Sondenmischung in den Hybridisierungsbereich geben und mit einem Deckschlitten abdecken, drücken Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um Luftblasen von unten zu entfernen. Versiegeln Sie alle Seiten des Deckschliffs mit Gummizement, um eine gute Dichtheit zu gewährleisten.
Nach der Erstarrung des Gummizements wurde der Schlitten auf eine automatische FISH-Maschine gelegt Denaturierung wurde bei 78 Grad Celsius für fünf Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Hybridisierung bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nehmen Sie die Folie von der FISH-Maschine auf. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um den Gummizement vorsichtig zu entfernen.
Tauchen Sie den Schieber etwa ein bis zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in zwei Mal SSC ein, um den Abdeckschlupf abzuwaschen. Waschen Sie die Rutsche in 68 Grad Celsius Vorwärmpuffer in einem Wasserbad für zwei Minuten. Waschen Sie die Rutschen mit zweimal SSC in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für eine Minute.
Direkt im Dunkeln aufstellen, um gründlich für 10 Minuten bei 10 Mikroliter DAPI auf den hybridisierten Bereich zu trocknen, mit einem Deckglas abdecken. Betrachten Sie hybridisierten Objektträger mit einem geeigneten Filterset auf einem Fluoreszenzmikroskop, verwenden Sie einen monochromatischen blauen Fluorophor-optischen Filter, um die Fluoreszenzintensität des Zellkerns zu beobachten. Nehmen Sie Zellkernbilder unter einem DAPI-Filtersatz auf.
CEP17 wurde mit grüner Fluoreszenz markiert. Verwenden Sie den optischen Spektrum-Grünfluorophorfilter, um den Standort von CEP17 zu beobachten. Nehmen Sie das CEP17-Signalbild unter grünem Filterset.
Das TP53-Gen wurde mit oranger Fluoreszenz markiert. Verwenden Sie den optischen Fluorophorfilter des Spektrums, um TP53 zu beobachten, nehmen Sie das TP53-Signalbild unter dem Satz, verschmelzen Sie diese drei Bilder zu einer Gesamtheit und untersuchen Sie sie auf numerische Anomalien. In einer normalen Interphasenzelle werden zwei orange und zwei grüne Signale in einem Kern mit blauer Fluoreszenz beobachtet, die auf ein Paar normaler Chromosomen 17 hinweist.
Die Ergebnisse zeigten die Morphologie und Genetik des Knochenmarks bei einem Patienten mit multiplem Myelom. Abbildung A zeigte, dass 15% der Plasmazellen in einem Knochenmarkabstrich größer und dunkler und kerniger zusammen mit großen Mengen an Zytoplasma als normal waren. Abbildung B zeigte ein Graustufenbild von repräsentativ durch eine kernhaltige Plasmazelle in einem Knochenmarkabstrich.
Abbildung C zeigte vier orange und vier grüne Signale in einem Interphasenkern der Plasmazelle, was darauf hindeutet, dass vier Kopien von Chromosom 17 in einem Kern lokalisiert waren. Abbildung D zeigte, dass das abnormale Chromosomenkaryogram dieses Patienten zwei Chromosomenpaare 17 in einem Kern bestätigte. Knochenmarkabstriche sind viel einfacher zu erhalten als gerinnungshemmende Knochenmarkproben, da die Gewinnung von antikoaguliertem Knochenmark komplexe Verfahren erfordert, um den Kern zu erhalten.
Dementsprechend haben wir eine überzeugende Methode für Knochenmarkabstrich FISH zum Nachweis von multiplen Myelomzellen etabliert.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Verbesserung der Effektivität der interphäsen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Detektion auf Knochenmarkausstrichen von Patienten mit multipler Myelom vorgestellt. Die Studie unterstreicht die Bedeutung einer genauen Identifizierung klonaler Plasmazellen für eine wirksame Diagnose.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Onkologie
- Genetik
Hintergrund
- Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist entscheidend für die genetische Risikostratifizierung beim multiplen Myelom.
- Klonale Plasmazellen müssen spezifisch identifiziert werden, um eine genaue FISH-Berichterstattung zu gewährleisten.
- Aktuelle Methoden weisen Einschränkungen auf, darunter Komplexität und hohe Kosten.
- Knochenmarkausstriche können die schnellere Identifizierung von Plasmazellen erleichtern.
Zweck der Studie
- Verbesserung des Nachweises von multiplem Myelom-Zellen mittels FISH an Knochenmarkausstrich.
- Behebung der Mängel bestehender FISH-Methoden.
- Vereinfachung des Prozesses zur Identifizierung klonaler Plasmazellen.
Verwendete Methoden
- Verwendung von Anti-CD138-Magnetkugeln zur Sortierung von Plasmazellen.
- Durchführung einer Markierung des zytoplasmatischen Kappa- oder Lambda-Leichtketten-Immunglobulins.
- Anwendung der Interphase-FISH nach der Plasmazell-Sortierung.
- Verwendung von FISH an Knochenmarkausstrichen zur effizienten Detektion.
Hauptergebnisse
- Die FISH-Analyse von Knochenmarkausstrichen identifiziert wirksam multiple Myelom-Zellen.
- Verbesserte Diagnosegenauigkeit beim multiplen Myelom durch gezielte Nachweisverfahren für Plasmazellen.
- Verminderte Anforderungen an das Probenmaterial und geringere experimentelle Kosten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Optimiertes Protokoll ermöglicht eine schnellere Diagnose und Therapieplanung.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt eine gangbare Alternative zum Nachweis von Multiplen-Myelom-Zellen dar.
- Mit der FISH-Analyse von Knochenmarkausstrichen lassen sich die Einschränkungen bestehender FISH-Techniken überwinden.
- Zukünftige Forschungsarbeiten könnten darauf abzielen, diese Methode weiter für den klinischen Einsatz zu optimieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode behebt einen zentralen Engpass in der Diagnostik des multiplen Myeloms, indem sie die FISH-Analyse an leicht verfügbaren Knochenmarkausstrichen ermöglicht und somit die Abhängigkeit von frischen, heparinisierten Aspiraten verringert. Sie unterstützt eine schnellere und zugänglichere genetische Risikostratifizierung in hämatologisch-onkologischen Abläufen, insbesondere wenn die Probengewinnung schwierig ist. Der Ansatz verbessert die translationale Kontinuität, indem er die Eignung der Proben erhöht, ohne die Spezifität für klonale Plasmazellen zu beeinträchtigen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung chromosomaler Abnormalitäten in klonalen Plasmazellen direkt aus Ausstrichen und unterstützt so die mechanistische Entschärfung genomischer Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Verringert den Aufwand für die Probenvorbereitung, da keine Zellsortierung oder Anreicherung vor der FISH-Analyse erforderlich ist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte, abstrichbasierte Plattform für die Interphasen-FISH, die die Einsatzbereitschaft des Assays bei Proben mit geringer Ausbeute oder schwieriger Zugänglichkeit verbessert.
- Operativer Wert: Erhöht die Reproduzierbarkeit, indem präanalytische Variablen, die mit der Handhabung und Verarbeitung frischer Aspirate verbunden sind, minimiert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt biomarkerbasierte Studien, indem der räumliche Kontext von Plasmazellen in Ausstrichen erhalten bleibt, was eine Korrelation von Morphologie mit genetischen Aberrationen ermöglicht.
- Operativer Wert: Erleichtert die longitudinale Überwachung in präklinischen Modellen, bei denen wiederholte Knochenmarkaspirationen unpraktisch sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur Translation ein, indem sie einen machbaren FISH-Arbeitsablauf bietet, wenn primäre Proben begrenzt sind, und ermöglicht eine nachgeschaltete genetische Analyse, ohne die Identifizierung von Leitstrukturen oder die präklinische Validierung zu verzögern.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung genomischer Veränderungen auf Klonbasis, indem FISH an archivierten oder schwer zu verarbeitenden Knochenmarkausstrichen ermöglicht wird.
- Screening: Verbessert die Standardisierung von Assays, indem Ausstriche als einheitlicher Träger für die Hybridisierung und Signaldetektion verwendet werden.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Beurteilung von Veränderungen in der chromosomalen Kopienzahl (z. B. TP53, CEP17) in Interphasekernen zur Risikostratifizierung.
- Translationale Forschung: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem wiederholte Probenahmen über Ausstriche in Längsschnittstudien möglich sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein wiederverwendbares Protokoll für FISH-fertige Ausstriche, das auf verschiedene Multiplen-Myelom-Modelle und Probenarten anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Vorhersagesicherheit bei der genetischen Risikobewertung, indem FISH an Proben ermöglicht wird, die andernfalls nicht für die Analyse geeignet wären.
- Operativer Wert: Erhöht die Laborauslastung und verkürzt die Durchlaufzeit, indem die Probenvorbereitung vereinfacht wird.
- Strategischer Wert: Verringert biologische und technische Risiken bei frühen Entscheidungen, indem der Zugang zu kritischen zytogenetischen Daten erweitert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die mittels FISH basierende Stratifikation in ressourcenbegrenzten oder klinischen Umgebungen machbar wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der FISH-Sondenkonstruktion, Hybridisierung und Fluoreszenzmikroskopie zur genauen Interpretation der Signale.
- Setzt den Zugang zu Standard-FISH-Geräten voraus, einschließlich Hybridisierungskammern, Waschpuffern und Filterblöcken für DAPI, Spektrum-Grün und Spektrum-Orange.
- Erfordert die Standardisierung der Präparat-Erstellung und Färbeprotokolle, um eine konsistente Plasmazellmorphologie und -erhaltung sicherzustellen.
- Muss die Variabilität der Plasmazelldichte zwischen verschiedenen Ausstrichen bei der Bestimmung der Probentiefe und der Signalquantifizierungsschwellen berücksichtigen.
- Auf die Interphasenanalyse beschränkt; ermöglicht ohne zusätzliche Methoden keine Metaphasenkaryotypisierung oder Detektion struktureller Umordnungen.
