Name: Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Lernen Sie die Interphasen-FISH-Technik zur effizienten Detektion multipler Myelomzellen aus Knochenmarkabstrichen. Diese Methode ermöglicht eine präzisere Identifikation klonaler Plasmazellen für die genetische Risikostratifizierung.

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Dieses Projekt wurde vom Innovationsfonds des WNLO 2018WNLOKF023 unterstützt.

Diese Studie wurde nach den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (Nr. 2019065) genehmigt. Die Proben wurden von einem MM-Patienten in der Abteilung für Hämatologie des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan (China) entnommen.
1. Vorbereitung der BM-Abstriche
<ol><li>Legen Sie die ersten 0,2 ml BM-Lösung auf einen sauberen Einweg-Glasobjektträger.</li>
	<li>Verteilen Sie die BM-Abstriche auf gleichmäßige Dicke mit scharfen Schwänzen, indem Sie den BM schnell entfernen. Dann natürlich trocknen.</li>
	<li>Decken Sie die BM-Folien mit 1 ml Wright-Giemsa-Lösung für ca. 10 s bei Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Phosphatpuffer zu den Objektträgern hinzu. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Farbstofflösung nicht austrocknet oder von den Objektträgern abfließt.</li>
	<li>Mischen Sie die Farbstofflösung vorsichtig und halten Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwenden Sie die Vorwärtslichtmikroskopie, um bösartige PCs zu erkennen. Die PCs sollten gut verteilt sein.</li>
</ol>2. FISH-Vorverarbeitung der BM-Abstriche
<ol><li>Decken Sie den hybridisierten Bereich 10 Minuten lang mit Fixierlösung ab, um die PCs zu verfärben und zu fixieren.<ol>
<li>Zur Herstellung einer frischen Fixierlösung mischen Sie Methanol mit Eisessigsäure in einem Volumenverhältnis von 3:1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem Wasser (dH2O) ab und trocknen Sie ihn an der Luft bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ein Glas mit 2x SSC-Puffer in einem Wasserbad auf 56 °C vorheizen. Verdünnen Sie den Puffer vor Gebrauch frisch auf 20x SSC.<ol>
<li>Um 20x SSC herzustellen, mischen Sie 176 g Natriumchlorid und 88 g Natriumcitrat gründlich mit 800 ml dH2O. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf pH 5,3 ± 0,2 ein. Fügen Sie dann dH2O hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 L zu bringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie den vorbereiteten BM-Abstrich im vorgewärmten 2x SSC-Puffer für 10 min, gefolgt von einem Eintauchen in deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dehydrieren Sie den Abstrich in einem Ethanolgradienten (70%, 85% und 100% Ethanol, jeweils für 1 min). Trocknen Sie den Abstrich 10 Minuten lang an der Luft.</li>
</ol>3. BM Abstrich FISH und Waschen
HINWEIS: Alle Schritte wurden in einem dunklen Raum durchgeführt, um eine Fluoreszenzlöschung zu verhindern.
<ol><li>Fügen Sie das TP53 / Zentromer des Chromosoms 17 (CEP17) Sondenmischung in den Hybridisierungsbereich hinzu und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um Luftblasen von unten zu entfernen.</li>
	<li>Versiegeln Sie alle Seiten des Deckglases mit Gummizement, um eine gute Dichtheit zu gewährleisten.</li>
	<li>Nach dem Erstarren des Gummizements den Schlitten auf eine automatische FISH-Maschine legen. Denaturierung bei 78 °C für 5 min, gefolgt von Hybridisierung bei 37 °C über Nacht.</li>
	<li>Nehmen Sie die Folie von der FISH-Maschine auf. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Gummizement vorsichtig zu entfernen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Rutsche in 2x SSC bei Raumtemperatur für ca. 1 oder 2 min ein, um den Deckglas abzuwaschen.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger in 68 °C vorgewärmtem 0,4x SSC/0,3% NP-40 Puffer in einem Wasserbad für 2 min.<ol>
<li>Bereiten Sie 0,4x SSC / 0,3% NP-40-Lösung vor, indem Sie 20 ml 20x SSC (pH 5,3) gründlich mit 950 ml dH2O mischen. Dann fügen Sie 3 ml NP-40 hinzu und mischen Sie gründlich, bis sie vollständig aufgelöst sind. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn mit NaOH auf 7,0-7,5 ein. Fügen Sie dann dH2O hinzu, um das endgültige Volumen der Gesamtlösung auf 1 L zu bringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen Sie die Dias mit 2x SSC in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 min. Im Dunkeln aufrecht aufgestellt, um 10 min gründlich zu trocknen.</li>
	<li>Geben Sie 10 μL DAPI in den hybridisierten Bereich und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab.</li>
</ol>4. FISH-Analyse und Bildgebung
<ol><li>Betrachten Sie den hybridisierten Objektträger mit einem geeigneten Filterset auf einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Verwenden Sie einen monochromatischen blauen fluorophoren optischen Filter, um die Fluoreszenzintensität des Zellkerns zu beobachten. Nehmen Sie Zellkernbilder unter einem DAPI-Filtersatz auf.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Chromosomenzentromersonde, um zu zeigen, wie viele Chromosomen eine Zelle enthält. Kennzeichnen Sie CEP17 mit grüner Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Spektrumfilter für grünes Fluorophor, um den Standort von CEP17 zu beobachten. Nehmen Sie ein CEP17-Signalbild unter dem grünen Filterset auf.</li>
	<li>Kennzeichnen Sie das TP53-Gen mit oranger Fluoreszenz. Verwenden Sie einen optischen Fluorophorfilter mit Spektrum, um TP53 zu beobachten. Nehmen Sie ein TP53-Signalbild unter diesem Set auf.</li>
	<li>Führen Sie diese drei Bilder zusammen und untersuchen Sie sie auf numerische Anomalien. HINWEIS: In einer normalen Interphasenzelle werden zwei orange und zwei grüne Signale in einem Kern mit blauer Fluoreszenz beobachtet, was auf ein Paar des normalen Chromosoms 17 hinweist (Abbildung 1).</li>
</ol>

<ol><li>Sonneveld, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+myeloma+with+high-risk+cytogenetics%3A+a+consensus+of+the+International+Myeloma+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group.</a> Blood. 127, 2955-2962 (2016).</li>
<li>Radbruch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+and+competition%3A+the+challenge+of+becoming+a+long-lived+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell.</a> Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).</li>
<li>Lai, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cytogenetics+in+multiple+myeloma%3A+a+study+of+151+patients+including+117+patients+at+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis.</a> Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).</li>
<li>Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+increasing+evidence+for+a+multistep+transformation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process.</a> Blood. 91, 3-21 (1998).</li>
<li>Munsh, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+recommendations+for+risk+stratification+in+multiple+myeloma%3A+report+of+the+International+Myeloma+Workshop+Consensus+Panel+2%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2.</a> Blood. 117, 4696-4700 (2011).</li>
<li>Gole, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cIg-FISH+On+Patients+with+Multiple+Myeloma+-+A+Modified+and+Simple+Technique+Easily+Incorporated+Into+Routine+Clinical+Service%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service.</a> Blood. 120, 4792-4792 (2012).</li>
<li>Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology%2C+ICSH+guidelines+for+the+standardization+of+bone+marrow+specimens+and+reports%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Laboratory+Hematology%22%5BJournal%5D)">Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).</li>
<li>Štifter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+evaluation+of+bone+marrow+aspirate+and+biopsy+is+superior+in+the+prognosis+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma.</a> Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).</li>
<li>Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+on+direct+hematological+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears.</a> Pathology. 27, 86-90 (1995).</li>
<li>Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+morphology%2C+esterase+cytochemistry%2C+and+interphase+cytogenetics+of+peripheral+blood+and+bone+marrow+smears%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).</li>
<li>Dunning, K., Safo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultimate+Wright-Giemsa+stain%3A+60+years+in+the+making%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).</li>
<li>Woronzoff-Dashkoff, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wright-giemsa+stain.+Secrets+revealed%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The wright-giemsa stain. Secrets revealed.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).</li>
<li>McPherson, R. A., Pincus, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Henry%27s+Clinical+diagnosis+and+Management+by+Laboratory+Methods+E-book%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2017).</li>
<li>Ross, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+the+European+Myeloma+Network+on+interphase+FISH+in+multiple+myeloma+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders.</a> Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Anwendung von FISH auf die genetische Risikostratifizierung in MM ist von wesentlicher Bedeutung. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale PCs, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder markiert wurden. Interphase FISH nach PC-Sortierung oder cIg-FISH erwies sich aufgrund des relativ geringen Anteils an PCs im BM als signifikant bei der Diagnose von MM. Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, daru...

Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Plasmazellerkrankung (PC) mit starker biologischer Heterogenität und großen individuellen Unterschieden in der klinischen Wirksamkeit, mit Überlebenszeiten von Monaten bis Jahrzehnten. Zytogenetische Merkmale sind wichtige prognostische Indikatoren für MM. Das Risikostratifizierungssystem und individualisierte Behandlungen, die auf genetischen Merkmalen basieren, sind zu Themen von intensivem Interesse in der klinischen Forschung zu MM1 geworden. Zu den Aberrationen von PCs, die in einem Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungspanel (FISH) aus Knochenmark (BM) getestet wurden, gehören del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) Verstärkung/Verstärkung und 1p (CDKN2C) Deletion.
Die Standard-Metaphasenzytogenetik sollte in die Erstbeurteilung von MM-Patienten einbezogen werden. Obwohl die konventionelle G-Band-Karyotypisierung den Vorteil einer Ganzchromosomenanalyse bietet, führt die geringe Ausbeute dieser Methode zu vielen falsch negativen Ergebnissen2. Traditionell wurden PCs als weitgehend unfähig zur Spaltung angesehen, da sie die Endprodukte der B-Lymphozyten-Differenzierung sind. Dies macht es schwierig, geteilte Bilder zu erhalten. Eine verbesserte zytogenetische Analyse in MM mit Langzeitkulturen (6 Tage) und die Stimulation von Kulturen durch Zytokine können eine vielversprechende Methode zur Identifizierung zytogenetischer Anomalien bei neu diagnostizierten MM-Patienten sein3. Selbst wenn die Kulturzeit auf 6 Tage verlängert wurde, wurden zytogenetische Anomalien bei 30%-50% der MM-Patienten genau berichtet4. Darüber hinaus zeichnet sich MM durch komplexe zytogenetische Aberrationen aus, die seine prognostische Heterogenität widerspiegeln. Die Auflösung der traditionellen Chromosomenbanding-Technologie ist jedoch gering, was leicht zu einer verpassten Erkennung von Chromosomenanomalien in MM führen kann.
Interphase FISH, vorzugsweise nach CD138-positiver magnetischer Perlen-basierter PC-Sortierung oder Markierung mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ/λ, ist bei der Analyse von MM5,6 unverzichtbar. Für die optimierte Ausbeute an Tumorzellen wird dringend eine CD138-positive ausgewählte Probe empfohlen. Die genaue Quantifizierung zytogenetischer Aberrationen erfordert jedoch mindestens 4 ml antikoaguliertes BM für die PC-Sortierung. Darüber hinaus erhöhen die Kombinationen von entweder CD138-Immunmagnetperlensortierung mit FISH oder zytoplasmatischem κ/λ-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Test (cIg-FISH) zahlreiche experimentelle Kosten und sind zeitaufwendig.
In der Regel wird das PC-Verhältnis zunächst aus der morphologischen Untersuchung von gefärbten BM-Abstrichen oder BM-Biopsieabschnitten beurteilt7,8. BM-Proben von höchster Qualität (erste Markaspiratproben) werden für morphologische Tests verwendet, während diejenigen, die zum FISH- oder anderen Nachweis geschickt werden, oft die sekundären Aspiratproben mit hohen Verdünnungsverhältnissen mit peripherem Blut sind.
Bereits in den 1990er Jahren zeigten mehrere Studien, dass BM-Abstriche direkt für interstitielle FISH-Untersuchungen verwendet werden können, was sich als zuverlässige und wiederholbare Methode erwiesen hat9. Eine elegante Studie, die auf Zellmorphologie und Esterasezytochemie in Kombination mit FISH aus peripherem Blut und BM-Abstrichen basierte, bestätigte ihre große klinische Bedeutung für die Aufklärung von Chromosomenanomalien bei Patienten mit granulozytärer und lymphatischer Leukämie10.
Hierin stellen wir eine neuartige Methode zur Verfügung, um den Erfolg des Interphasen-FISH-Detektions bei MM-Patienten zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>automatische FISH-Maschine</td><td>Leica&nbsp; Corporation</td><td>S500-24</td><td>FINAL Assy Thermobrite 240V</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>06J49-001</td><td>DAPI Counterstain</td></tr><tr><td>FISH-Analysesoftware</td><td>IMSTAR&nbsp; Unternehmen</td><td>IMSTAR</td><td>FISH Analysesoftware</td></tr><tr><td>FISH-Sonde</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>05N56-020</td><td>Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit</td></tr><tr><td>Pipette mit festem Volumen</td><td>Eppendorf China Ltd.</td><td>M33768H</td><td>10&nbsp; Mikroliter</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX53</td><td>Vorwärtsfluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Karyotyp-Analysesoftware</td><td>IMSTAR&nbsp; Unternehmen</td><td>IMSTAR</td><td>Karyotyp-Analysesoftware</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Olympus&nbsp; Unternehmen</td><td>BX41</td><td>Vorwärtslichtmikroskop</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>07J05-001</td><td>NP-40</td></tr><tr><td>Färbegestell</td><td>aus Kunststoff Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-501</td><td>&nbsp; 24 Folien</td></tr><tr><td>Kunststofffärbung Färbetank</td><td>Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.</td><td>RSJ-516</td><td>&nbsp; 24 Rutschen</td></tr><tr><td>Gummi Zement</td><td>Marabu &nbsp; GmbH & Co. KG</td><td>FixoGum&nbsp;</td><td>Gummi-Zement</td></tr><tr><td>SSC</td><td>Abbott Molecular Inc.</td><td>02J10-032</td><td>20 mal SSC</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.</td><td>DK-8D</td><td>Wasserbad mit mehreren Temperaturen</td></tr></tbody></table>

interphasenfluoreszenz-in-situ-hybridisierung von knochenmarkabstrichen des multiplen myeloms

Interphase Fluorescence in situ Hybridization of Bone Marrow Smears of Multiple Myeloma

Der Nachweis der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine unverzichtbare Methode bei der genetischen Risikostratifizierung beim multiplen Myelom (MM), einem der häufigsten hämatologischen Malignome. Das identifizierende Merkmal von MM sind angesammelte bösartige Plasmazellen im Knochenmark. FISH-Berichte für MM konzentrieren sich hauptsächlich auf gereinigte oder identifizierte klonale Plasmazellen und nicht auf alle kernhaltigen Zellen, indem sie mit Anti-CD138-Magnetkügelchen sortiert oder mit zytoplasmatischer Immunglobulin-Leichtkette κ oder λ markiert werden. Knochenmark-Interphasenkerne werden in der Regel aus frischen Knochenmarkzellen gewonnen. Eine zufriedenstellende Anreicherung von Plasmazellproben erfordert jedoch große Mengen an frischem Heparin-antikoaguliertem Knochenmark, das bei schwieriger Knochenmarkextraktion oder einem trockenen Knochenmarkhahn nicht erhalten werden kann. Hierin etablieren wir eine neuartige Methode, um den Erfolg des FISH-Nachweises auf gefärbten oder ungefärbten Knochenmarkabstrichen zu verbessern. Knochenmarkabstriche sind leichter zu erhalten als antikoagulierte Knochenmarkproben.

In der ersten morphologischen Beurteilung eines neu diagnostizierten MM-Patienten wurde festgestellt, dass 15% der PCs in einem BM-Abstrich größere und dunklere Kerne zusammen mit größeren Mengen an Zytoplasma als normale PCs aufwiesen (Abbildung 2A). Die erste Röhre von Heparin antikoaguliertem BM, die mit der Immunphänotyp-Technik nachgewiesen wurde, zeigte nur 2,3% der monoklonalen aberranten PCs. Die CD138-Immunperlensortierung in Kombination mit FISH oder der cIg-FISH-Technik ist für di...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Verbesserung des Erfolgs des Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsnachweises bei Knochenmarkabstrichen von Patienten mit multiplem Myelom vor.

Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms

Fluorescence in situ hybridization (FISH) detection is an indispensable method in genetic risk stratification in multiple myeloma (MM), which is one of ...

Die Anwendung der Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung namens FISH auf die genetische Risikostratifizierung beim multiplen Myelom ist unerlässlich. Der kritische Teil der FISH-Berichte sind nicht alle kernhaltigen Zellen, sondern klonale Plasmazellen, die spezifisch gereinigt oder identifiziert wurden, indem sie mit Anti-CD138-Magnetperlen sortiert oder markiert wurden, mit zytoplasmatischem Kappa- oder Lambda-Leichtketten-Immunglobulin mit FISH-Tests namens cIg FISH. Interphase FISH nach Plasmazellsortierung oder cIg FISH erweist sich aufgrund des relativ geringen Anteils an Plasmazellen im Knochenmark als signifikant bei der Diagnose des multiplen Myeloms.Diese Methoden weisen jedoch einige Mängel auf, darunter komplexe Prozesse, hohe Probenanforderungen und hohe experimentelle Kosten. Plasmazellen können in einem Knochenmarkabstrich schnell lokalisiert werden. Darauf aufbauend verwenden wir Knochenmarkabstrich FISH zum Nachweis von multiplen Myelomzellen.Diese Studie wurde nach den Grundsätzen der Helsinki-Erklärung durchgeführt und von der Ethikkommission des Zhongnan-Krankenhauses der Universität Wuhan genehmigt. Die Proben wurden von einem Patienten mit multiplem Myelom in der Abteilung für Hämatologie des Zhongnan-Krankenhauses der Universität von China Wuhan gesammelt. Legen Sie die ersten 0,2 Milliliter Knochenmarklösung auf einen sauberen Einweg-Glasobjektträger, verteilen Sie die Knochenmarkabstriche auf gleichmäßige Dicke und scharfe Schwänze, indem Sie das Knochenmark schnell entfernen und trocknen Sie es dann auf natürliche Weise.Decken Sie die Knochenmarkfilme mit einem Milliliter Wright-Giemsa-Lösung für ca. 10 Sekunden bei Raumtemperatur ab. Geben Sie einen Milliliter Phosphatpuffer zu den Objektträgern, es war Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Farbstofflösung austrocknet oder von den Objektträgern fließt. Mischen Sie die Farbstofflösung vorsichtig und halten Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.Spülen Sie die Rutschen mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft. Verwenden Sie die Vorwärtslichtmikroskopie, um bösartige Plasmazellen nachzuweisen, die Plasmazellen sollten gut verteilt sein. Was wir jetzt im Feld sehen, sind die Plasmazellen, die ziemlich verstreut sind.Dies ist eine typische binukleare Kernplasmazelle. Decken Sie den hybridisierten Bereich 10 Minuten lang mit Fixierlösung ab, um Plasmazellen zu verfärben und zu fixieren. Spülen Sie den Objektträger mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie ihn an der Luft bei Raumtemperatur.Ein Glas mit zweifachem SSC-Puffer in einem Wasserbad auf 56 Grad Celsius vorheizen. Waschen Sie den vorbereiteten Knochenmarkabstrich im vorgewärmten zweifachen SSC-Puffer für 10 Minuten, gefolgt von einem Eintauchen in deionisiertes Wasser bei Raumtemperatur. Dehydrieren Sie den Abstrich in einem Ethanolgradienten von jeweils 70% 85% und 100% Ethanol für jeweils eine Minute.Trocknen Sie den Abstrich 10 Minuten lang an der Luft. Zuerst TP53 auf Zentromer der Chromosom-17-Sondenmischung in den Hybridisierungsbereich geben und mit einem Deckschlitten abdecken, drücken Sie vorsichtig die feine spitze Pinzette, um Luftblasen von unten zu entfernen. Versiegeln Sie alle Seiten des Deckschliffs mit Gummizement, um eine gute Dichtheit zu gewährleisten.Nach der Erstarrung des Gummizements wurde der Schlitten auf eine automatische FISH-Maschine gelegt Denaturierung wurde bei 78 Grad Celsius für fünf Minuten durchgeführt, gefolgt von einer Hybridisierung bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nehmen Sie die Folie von der FISH-Maschine auf. Verwenden Sie eine feine spitze Pinzette, um den Gummizement vorsichtig zu entfernen.Tauchen Sie den Schieber etwa ein bis zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in zwei Mal SSC ein, um den Abdeckschlupf abzuwaschen. Waschen Sie die Rutsche in 68 Grad Celsius Vorwärmpuffer in einem Wasserbad für zwei Minuten. Waschen Sie die Rutschen mit zweimal SSC in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für eine Minute.Direkt im Dunkeln aufstellen, um gründlich für 10 Minuten bei 10 Mikroliter DAPI auf den hybridisierten Bereich zu trocknen, mit einem Deckglas abdecken. Betrachten Sie hybridisierten Objektträger mit einem geeigneten Filterset auf einem Fluoreszenzmikroskop, verwenden Sie einen monochromatischen blauen Fluorophor-optischen Filter, um die Fluoreszenzintensität des Zellkerns zu beobachten. Nehmen Sie Zellkernbilder unter einem DAPI-Filtersatz auf.CEP17 wurde mit grüner Fluoreszenz markiert. Verwenden Sie den optischen Spektrum-Grünfluorophorfilter, um den Standort von CEP17 zu beobachten. Nehmen Sie das CEP17-Signalbild unter grünem Filterset.Das TP53-Gen wurde mit oranger Fluoreszenz markiert. Verwenden Sie den optischen Fluorophorfilter des Spektrums, um TP53 zu beobachten, nehmen Sie das TP53-Signalbild unter dem Satz, verschmelzen Sie diese drei Bilder zu einer Gesamtheit und untersuchen Sie sie auf numerische Anomalien. In einer normalen Interphasenzelle werden zwei orange und zwei grüne Signale in einem Kern mit blauer Fluoreszenz beobachtet, die auf ein Paar normaler Chromosomen 17 hinweist.Die Ergebnisse zeigten die Morphologie und Genetik des Knochenmarks bei einem Patienten mit multiplem Myelom. Abbildung A zeigte, dass 15% der Plasmazellen in einem Knochenmarkabstrich größer und dunkler und kerniger zusammen mit großen Mengen an Zytoplasma als normal waren. Abbildung B zeigte ein Graustufenbild von repräsentativ durch eine kernhaltige Plasmazelle in einem Knochenmarkabstrich.Abbildung C zeigte vier orange und vier grüne Signale in einem Interphasenkern der Plasmazelle, was darauf hindeutet, dass vier Kopien von Chromosom 17 in einem Kern lokalisiert waren. Abbildung D zeigte, dass das abnormale Chromosomenkaryogram dieses Patienten zwei Chromosomenpaare 17 in einem Kern bestätigte. Knochenmarkabstriche sind viel einfacher zu erhalten als gerinnungshemmende Knochenmarkproben, da die Gewinnung von antikoaguliertem Knochenmark komplexe Verfahren erfordert, um den Kern zu erhalten.Dementsprechend haben wir eine überzeugende Methode für Knochenmarkabstrich FISH zum Nachweis von multiplen Myelomzellen etabliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt die Technik der Absaugung von Knochenmark aus der Beckenwirbelsäule und die Vorbereitung des Abstrichs für die Biopsie. In diesem Beispiel führen wir eine Knochenmarkaspiration bei einem Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) durch und untersuchen die Zellen auf eine messbare Resterkrankung (MRD), einen wichtigen prognostischen Biomarker.

Knochenmarkaspiration: Eine Methode zur Gewinnung von Knochenmark zur Untersuchung der Zellmorphologie

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Eine Strategie zur quantitativen Analyse histologischer Daten im Knochenmark wird vorgestellt. Die konfokale Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen in Gewebeschnitten führt zu 2-dimensionalen Bildern, die automatisch analysiert werden. Co-Lokalisationsanalysen verschiedener Zelltypen werden mit Daten aus simulierten Bildern verglichen, um quantitative Informationen über zelluläre Interaktionen zu erhalten.

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Wir beschreiben einen Hochdurchsatz-Wirkstoffsensitivitätsassay für primäre multiple Myelomzellen. Es besteht aus einer Rekonstruktion der Mikroumgebung des Knochenmarks (einschließlich extrazellulärer Matrix und Stroma) in Multi-Well-Platten und einer nicht-invasiven Methode zur longitudinalen Quantifizierung der Zellviabilität.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Nützlichkeit der multiplen Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (mFISH) und der spektralen Karyotypisierung (SKY) bei der Identifizierung interchromosomaler stabiler Aberrationen in den Knochenmarkzellen von Mäusen nach Exposition gegenüber Ganzkörperbestrahlung.

Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Nachweis von minimal oder messbare Resterkrankung (MRD) ist eine wichtige prognostische Biomarker für die Verfeinerung der Risikobewertung und Vorhersage von Rückfällen bei akuter myeloischer Leukämie (AML). Diese umfassende Leitlinien und Empfehlungen mit best Practices für konsistente und genaue Identifizierung und Nachweis von MRD, können helfen, effektive Entscheidungen für AML-Behandlung.

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.

Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Hier wird eine auf Phosphoflow-Zytometrie basierende Methode zur Analyse der Signalwege stromabwärts der mTORC1-, JAK/STAT5- und MAPK-Signalwege in akuten humanen myeloischen Leukämiezellen beschrieben, die in Mäuse xenotransplantiert und aus Knochenmarkaspiraten gewonnen wurden. Die Werte von p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 und p-ERK1/2 werden gleichzeitig mit einem spektralen Durchflusszytometer der nächsten Generation mit hoher Empfindlichkeit gemessen.

Intrazelluläre Phosphoflow-Zytometrie von Xenotransplantaten bei akuter myeloischer Leukämie

Lernen Sie die Interphasen-FISH-Technik zur effizienten Detektion multipler Myelomzellen aus Knochenmarkabstrichen. Diese Methode ermöglicht eine präzisere Identifikation klonaler Plasmazellen für die genetische Risikostratifizierung.

Interphasenfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Knochenmarkabstrichen des Multiplen Myeloms

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