Manueller Aufbau eines Gewebe-Microarrays mit der Tape-Methode und einem Handheld-Microarrayer

Das Gewebe-Microarray (TMA) ist ein wichtiges Forschungsinstrument, das kleine beispielhafte Gewebestücke, die als Gewebekerne bekannt sind, aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken, die als Spenderblöcke bezeichnet werden, zu einem einzigen Paraffinblock zusammenfügt. Die Bandmethode ist eine vollständig manuelle Konstruktionsmethode, die den Konstruktionsprozess umkehrt, indem sie den Block um aufrechte Kerne gießt und somit mit nicht idealen Spenderblöcken kompatibel ist und kostengünstige, weit verbreitete Einweg-Handgewebe-Microarrayer verwendet. Der mehrstufige Workflow dieses Prozesses wird von Herrn Lee Wisner und Dr. Brandon Larsen demonstriert.

Eines der wichtigsten Konzepte, an die man sich bei der Konstruktion von TMA-Blöcken erinnern sollte, ist die Tatsache, dass Gewebe in formalinfixiertem Paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken tatsächlich dreidimensionale Strukturen sind. Wir haben hier eine Animation entwickelt, um dieses Konzept zu erklären. Was Sie hier sehen, ist eine Animation, die einen formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Gewebeblock darstellt, der die dreidimensionale Natur dieses Gewebes innerhalb des Blocks zeigt.

Sie können sehen, dass das Gewebe oben im Block sichtbar ist und dieser Bereich ziemlich groß ist. Wenn wir in der Lage wären, sozusagen Röntgenbilder zu sehen und durch den Block zu sehen, könnten wir sehen, dass das Gewebe nicht wirklich gleichmäßig tief in diesem Block geformt ist, fast wie ein Eisberg im Ozean, wo das, was Sie auf der Oberfläche sehen, möglicherweise nicht wirklich das darstellt, was darunter ist. Innerhalb dieses Gewebeblocks kann es zusätzliche Gewebestücke geben, die auf der Oberfläche nicht sichtbar sind.

Es kann Bereiche der Nekrose oder des Gewebetods im Zentrum dieses Gewebes tiefer unten geben. Ein Pathologe sollte diesen zweidimensionalen Abschnitt von der Oberseite dieses Gewebeblocks überprüfen und dann diesen Objektträger kommentieren, um die Bereiche zu zeigen, die das Gewebe von Interesse enthalten, und Nekrose oder andere Arten von Gewebe ausschließen, die nicht wirklich von Interesse sind. Um die richtige Kernentnahme des Gewebes zu erleichtern, sollte der Pathologe drei Dinge tun.

Zuerst markiert der Pathologe mit einem Objektträgermarkierungsstift das Gewebe von Interesse auf dem Objektträger, so dass andere Gewebe vermieden werden können. Zweitens, wenn es Bereiche innerhalb dieses Interessenbereichs gibt, die vermieden werden sollten, kann der Pathologe den gleichen Markierungsstift verwenden, um die Bereiche auszulöschen, die nicht beprobt werden sollten. Und schließlich, vorzugsweise mit einer anderen Farbe des Stiftes, sollte der Pathologe die Bereiche markieren, die innerhalb des Interessengebiets für die Kernprobenahme und TMA-Konstruktion ideal sind.

Es ist wichtig zu bedenken, dass, wenn dieser Prozess abgeschlossen ist, sich die Gewebezusammensetzung tiefer im Inneren ändern kann, von wo aus eine Kernprobe gewonnen wird, und wir werden dies hier in der Animation zeigen, dass die Position des Kerns die Zusammensetzung dieses Kerns bestimmt, die durch die Tiefe des Gewebes und das, was in diesem Block vorhanden ist, variieren wird. Zum Beispiel fängt hier der erste Kern, den wir illustrieren, einen Teil des Gewebes in seiner oberen Hälfte ein, aber tiefer im Block ist kein Gewebe mehr vorhanden, aus dem dieser Kern gewonnen wird, so dass nur Paraffinwachs beprobt wurde. Der zweite Kern, den wir hier illustriert haben, hat Gewebe über seine gesamte Länge erfasst, da Gewebe in der gesamten Tiefe dieses Blocks an dieser Stelle vorhanden ist.

Der dritte Kern hat einen Teil des Gewebes eingefangen und dann einen Teil Paraffinwachs in der Mitte eingefangen, wo kein Gewebe vorhanden war, und dann ein bisschen mehr Gewebe an seinem unteren Ende gefangen, wo sich Gewebe im unteren Teil dieses Blocks befand. Sobald die Pathologieüberprüfung abgeschlossen ist, stellen Sie die endgültige Liste der Spenderblöcke zusammen, die in der TMA-Konstruktion verwendet werden sollen, und erstellen Sie dann eine TMA-Karte. Die TMA-Karte ist eine schematische Gliederung, in der sich die Kerne in der fertigen TMA befinden und die von der resultierenden TMA geschnittenen Gewebeabschnitte auf dem Schieber geschnitten werden.

Stellen Sie zu Orientierungszwecken sicher, dass die TMA-Karte das Platzieren von Kernen in einer geraden Matrix wie einer drei mal drei oder vier mal vier Matrix vermeidet und mindestens eine Orientierungsmarkierung enthält. Da die Bandmethode den Konstruktionsprozess umkehrt, indem geschmolzenes Wachs um die invertierten Kerne gegossen wird, erfordert dies die Erstellung einer zweiten Karte, die als Konstruktionskarte bekannt ist und ein Spiegelbild der TMA-Karte ist. Die Konstruktionskarte zeigt, wo jeder Kern während des Baus platziert werden muss, um an der richtigen Stelle im fertigen TMA zu erscheinen.

Sobald die Karten erstellt wurden, bereiten Sie die TMA-Basisform aus Metall vor. Um die Platzierung des Kerns zu steuern, verwenden Sie ein Einweg-Papier-Schachbrettgitter. Schneiden Sie das karierte Papiergitter zu, und befestigen Sie ein Stück Doppelklebeband auf der Rückseite des Gitters.

Legen Sie das Gitter und das Klebeband in das Metallfach und fügen Sie ein zweites Stück Doppelklebeband auf das Gitter auf. Überlagern Sie den pathologiegeprüften H & E-Objektträger auf dem zu stanzenden FFPE-Gewebeblock und verwenden Sie die Markierungen des Pathologen, um zu identifizieren, wo der Gewebeblock gestanzt werden soll. Stanzen Sie den FFPE-Spenderblock mit einem Handheld-Handkernstempel, ob Einweg oder wiederverwendbar, in der entsprechenden Region.

Wenn Sie einen wiederverwendbaren Kernstempel verwenden, stellen Sie sicher, dass er vor und nach jedem Gewebestempel gereinigt wird. Werfen Sie den Kern aus dem Kernstempel aus. Verwenden Sie einen Nadelpickel, um den ausgeworfenen Kern auf das Fadenkreuz des mit Doppelklebeband überzogenen Gitters zu legen.

Stellen Sie sicher, dass der Kern in einer umgekehrten, aufrechten Weise platziert ist, so dass das Gewebeende des Kerns das Band berührt und sich an der richtigen Stelle befindet, wie in der Konstruktionskarte angegeben. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Spenderblöcke entkernt und die Kerne an den entsprechenden Positionen platziert sind. Sobald alle Kerne an Ort und Stelle sind, beschriften Sie eine Kunststoffkassette und legen Sie sie auf die Metallbasis, die die Kerne enthält.

Die Höhe der Kerne sollte die Tiefe des Metallfachs nicht überschreiten, da hohe Kerne gekippt oder umgestürzt werden, wenn die Kassette eingesetzt wird. Gießen Sie geschmolzenes Paraffin vorsichtig durch die Kassette in die Schale mit den Kernen. Lassen Sie das geschmolzene Paraffin überlaufen, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Körper des TMA befinden.

Stellen Sie sicher, dass sich das Paraffin bis zur Oberseite der Kassette füllt, so dass die Kassette eingebettet und fest mit dem Paraffinblock verbunden ist, sobald sie erstarrt ist. Lassen Sie den Block 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen und bewegen Sie den Block während dieser Zeit nicht. Kühlen Sie den Block bei vier Grad Celsius für weitere 30 Minuten, um sich vollständig zu verfestigen.

Nach dem vollständigen Setzen trennen Sie vorsichtig die Metallgrundform und entfernen Sie das Doppelklebeband vom Paraffinblock. Sobald das TMA erstellt ist, verwenden Sie ein Mikrotom, um das neue TMA zu schneiden. Sobald der Block entsprechend verkleidet wurde, sammeln Sie Vollgesichtsgewebeabschnitte.

Überführen Sie die Abschnitte in ein vorgewärmtes Wasserbad und montieren Sie die Gewebeabschnitte. Nach dem Trocknen reichen Sie repräsentative Abschnitte für die H & E-Färbung und zusätzliche immunhistochemische Färbungen ein, die möglicherweise erforderlich sind. Reichen Sie die gefärbten TMA-Abschnitte zur pathologischen Überprüfung ein.

Für die TMA-Validierung sollte der Pathologe den H & E-Objektträger aus dem TMA-Block überprüfen und jeden kreisförmigen Punkt unter dem Mikroskop überprüfen, um zu sehen, ob das interessierende Gewebe vorhanden ist. Eine kritische Komponente des Bauprozesses ist die Identifizierung von Geweben, die in einem bestimmten Spenderblock von Interesse sind, aus dem der TMA-Kern gewonnen werden soll. Die erste Spalte dieser Abbildung zeigt beispielhafte Spender-H&Es mit den Markierungen des Pathologen.

Die zweite Spalte zeigt den gestanzten Bereich der H & E-gefärbten Gewebe. Die dritte Spalte zeigt das H & E-gefärbte Gewebe der TMA-Kerne, die aus den Spenderblöcken in den in den Spalten eins und zwei gezeigten Bereichen geerntet wurden. Der Pathologe kann den abgestimmten Spenderblock und den TMA-Kern H & Es zusammen betrachten, um zu bestätigen, dass der Interessenbereich gesammelt wurde und dass die Gewebezusammensetzung gleich ist.

Es gibt zwei Hauptmetriken für den erfolgreichen Abschluss einer TMA durch die Bandmethode. Die erste ist das Vorhandensein von Gewebekernpunkten an den erwarteten Positionen und in Abstand voneinander, die durch visuelle Inspektion beurteilt werden. Die in A und B gezeigten Bilder zeigen zwei erfolgreich abgeschlossene Tape Methode TMAs und die entsprechenden H&E-Folien.

Visuelle Inspektionen dieser TMA-Blöcke zeigen, dass die Kerne in jedem TMA und den entsprechenden Abschnitten vorhanden und regelmäßig verteilt sind. Zu den wichtigsten Konstruktionsproblemen, die während des Konstruktionsprozesses der Bandmethode auftreten können, gehören die Trennung von Block und Kassette aufgrund des vorzeitigen Entfernens der Metallbasis vor der Erstarrung, wie in Bild C gezeigt.Kernumkippen und / oder Platzierungsdrift der eingebetteten Kerne, wie in Bild D gezeigt, können auftreten, während übermäßig turbulentes Gießen des geschmolzenen Paraffins, die durch schlecht haftendes doppelseitiges Klebeband verschlimmert werden kann. Diese Abbildung zeigt, dass der H & E-Fleck für jeden der Kerne eine beispielhafte TMA ist.

Alle bis auf einen der Kernspots sind im H & E vorhanden. Die Abbildung zeigt auch, dass einige der Kerne als vollständige kreisförmige Gewebepunkte vorhanden sind, während andere nicht vollständig vorhanden sind. Ein solcher Gewebeverlust ist nicht ungewöhnlich und kann auf eine unzureichende Blockverkleidung zurückzuführen sein, um alle Kerne vollständig zu enthüllen.

Alternativ kann das Vorhandensein von unvollständigem oder das völlige Fehlen von Gewebe auf eine schlechte Gewebequalität dieses Kerns zurückzuführen sein, was zu einem Gewebeverlust während des Färbeprozesses führen kann. In dieser nächsten Abbildung wurden Immunhistochemie und RNA-ISH-Färbung an den TMA-Abschnitten durchgeführt, um die TMA weiter zu validieren. Wie hier gezeigt, kann eine Vielzahl von Flecken verwendet werden, abhängig von dem Gewebe, das zum Aufbau der TMA verwendet wird.

Vimentin wird als Qualitätskontrolle eingesetzt. U6 ist ein Indikator für die RNA-Qualität. EBER wird verwendet, um den EBV-Status zu bestimmen.

Und CD20 ist ein B-Zell-Marker, der das Vorhandensein von B-Zellen anzeigt. Dies sind einige Flecken, die zur Validierung Ihrer TMA verwendet werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie verstehen, wie Sie ein Gewebe-Microarray mit der Bandmethode erstellen und warum TMAs wichtige zeit- und ressourcensparende Forschungswerkzeuge sind.

Sie sollten auch verstehen, dass die TMA-Konstruktion kein idealer Prozess ist und dass kontinuierliche pathologische Anleitung und Überprüfung kritische Komponenten sind, nicht nur während des Bauprozesses, sondern auch für immunhistochemische Studien, die an TMA-Abschnitten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das interessierende Gewebe tatsächlich im TMA-Abschnitt vorhanden ist.