Lebend-3D-Zell-Immunzytochemie-Assays des pädiatrischen diffusen Mittellinienglioms

Das diffuse Mittelliniengliom ist ein hochinvasiver Hirntumor. Diese Methode hilft dabei, in Echtzeit zu untersuchen, wie DMG-Zellen in einem 3D-Kontext wandern und eindringen, mit spezifischen Erkenntnissen über die potenzielle Rolle eines Schlüsseladhäsionsmoleküls. Durch die Verwendung eines Markierungsreagenzes und eines spezifischen Antikörper-Anti-CD44 können wir die Expression von CD44 auf der Plasmamembran auf den DMG-Zellen auch in der 3D-Migration und -Invasion untersuchen.

Die Anwendung dieser Technik unterstrich die potenzielle Rolle von CD44 bei der Motilität dieser Zellen, was darauf hindeutet, dass es ein wertvolles und invasives molekulares Ziel darstellen könnte. Rehydrieren Sie zunächst das ALR, indem Sie 100 Mikroliter steriles Wasser hinzufügen und die Lösung durch Pipettieren mischen. Mischen Sie den Antikörper mit dem ALR im TSM-Medium in einer Multi-Well-Platte mit rundem Boden oder in einem bernsteinfarbenen Röhrchen und schützen Sie es vor Licht.

Bereiten Sie eine ausreichende Menge des Mediums vor, um 25 Mikroliter pro Vertiefung bei der dreifachen endgültigen Assay-Konzentration zu dosieren, und inkubieren Sie dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. BSR wird im TSM-Medium mit einer Konzentration von 1,5 Millimolar verdünnt, um am Ende des Assays eine Endkonzentration von 0,5 Millimolar zu erhalten. Entfernen Sie dann vorsichtig und langsam 75 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung, vermeiden Sie es, den Boden der Vertiefung zu berühren, in der sich der NS befindet, und überprüfen Sie das Vorhandensein des NS visuell.

Geben Sie vorsichtig 25 Mikroliter des BSR- und ALR-Antikörperkomplexes in jede Vertiefung und lassen Sie den ALR-Antikörperkomplex zwei bis drei Minuten lang mit dem Medium mischen. Stellen Sie mit einem inversen Mikroskop sicher, dass sich jeder NS mittig am Boden des Wells befindet. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, indem Sie sie mit einer Nadel entfernen.

Lege den Teller für fünf Minuten auf Eis, damit der Boden des Tellers kalt wird. Geben Sie 75 Mikroliter BMM pro Vertiefung ab, indem Sie eine vorgekühlte P200-Spitze an der Innenwand der Vertiefung platzieren, um Blasenbildung zu vermeiden und den Boden der Vertiefung zu berühren. Lassen Sie den Teller fünf Minuten auf Eis, damit sich das BMM mit dem Medium vermischen kann.

Überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop die Position von NS. Und wenn nicht zentral vorhanden, zentrifugieren Sie die Platte bei vier Grad Celsius bei 180 mal G fünf Minuten lang. Übertragen Sie dann die Platte in das Lebendzellanalysegerät, das in den Inkubator gestellt ist, der auf 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Sobald die Vertiefungen mit BMM beschichtet sind, schneiden Sie eine P200-Spitze ab.

Entnehmen Sie 50 Mikroliter des Zellmediums und NS aus jeder ausgewählten Vertiefung und überführen Sie sie in eine beschichtete Vertiefung mit flachem Boden. Überprüfen Sie das Vorhandensein und die Position des NS in jeder Vertiefung visuell. Geben Sie vorsichtig 50 Mikroliter des verdünnten BSR- und ALR-Antikörpers in jede Vertiefung und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis sich die Reagenzien vermischen.

Stellen Sie mit einem inversen Mikroskop sicher, dass sich die meisten replizierten NS zentral im Bohrloch befinden. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass keine Blasen vorhanden sind, legen Sie die Platte vorsichtig in das Lebendzellanalysegerät, wie zuvor gezeigt. Wählen Sie in der Software des Live-Cell-Analysegeräts die Option "Zeitplan" aus, klicken Sie dann auf die Registerkarte "Plus" und wählen Sie "Nach Zeitplan scannen", um die Platten mit den im Textmanuskript angegebenen Intervallen zu scannen.

Erstellen oder stellen Sie im Softwarefenster ein Schiff wieder her und klicken Sie dann auf die Option Neu. Wählen Sie den Sphäroid-Scan-Typ, die Phase plus Hellfeld, grüne Bildkanäle für den Invasionsassay und das 4X-Objektiv aus. Wählen Sie den Klonierungsscan mit Verdünnung, das 4X-Objektiv und die Phase und Grün für den Migrationsassay aus.

Wählen Sie den Plattentyp aus und definieren Sie die zu scannenden Wells, indem Sie sie auf der Plattenkarte markieren, und stellen Sie dann die Scanfrequenz ein. Klicken Sie auf Zum Zeitplan hinzufügen und starten Sie den Scan. Wählen Sie den Reiter Neue Analysedefinition anlegen.

Wählen Sie dann auf der Registerkarte Sphäroidinvasion oder Basisanalysatoranwendung für Invasion bzw. Migration aus. Wählen Sie die für die Invasion und Migration geeigneten Kanäle im Bildkanal aus. Wählen Sie einige repräsentative Bilder aus drei bis vier Vertiefungen aus, um eine Vorschau anzuzeigen und die Analyseeinstellung zu verfeinern.

Passen Sie für den Invasionsassay auf der Registerkarte Analysedefinition die Anwendungseinstellungen im Hellfeld- und Grünkanal mit den im Textmanuskript genannten Einstellungen an, um eine präzise Segmentierung zwischen dem Sphäroid und den eindringenden Zellen zu erzeugen. Passen Sie für den Migrationsassay die Anwendungseinstellungen wie im Textmanuskript erwähnt in den Phasen- und Grünkanälen an, um eine präzise Segmentierung zwischen der Konfluenz und den grünen Zellen zu erzeugen. Überprüfen Sie, ob die Analyseeinstellungen für den NS korrekt sind, indem Sie zufällig auf mehrere Vertiefungen klicken.

Wählen Sie die zu analysierenden Vertiefungen und Zeitpunkte aus. Speichern Sie die Analysedefinition und klicken Sie auf Fertig stellen. Die repräsentativen immunfluoreszierenden konfokalen Bilder der CD44-Expression in primären DMG-Patientenzellen zeigten die Rolle von CD44 bei der Zellmigration und -invasion.

Die lebende 3D-Zellimmunchemie ermöglicht die Visualisierung der CD44-Expression. Die repräsentativen Bilder des Zeitraffers sowohl für die Migration als auch für die Invasion zeigen das Vorhandensein und Fehlen des grünen Fluoreszenzsignals auf derselben Zelle, das im Laufe der Zeit beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass die Expression von CD44 ein- und ausgeschaltet ist, während die Zellen wandern und eindringen. Die Migrations- und Invasionsprozesse werden über 96 Stunden verfolgt und zeigen QCTB-R059-Zellen mit einem hohen CD44-Gehalt.

Die Quantifizierung der CD44-Expression und ihres Anstiegs über die Zeit wurde anhand des gesamten grünen Fluoreszenzsignals gemessen, das mit der ALR sowohl für die Migration als auch für die Invasion assoziiert ist. Wenn der Anti-CD44-Antikörper auf lebenden Zellen angewendet wird, beeinflusst er die Zellmorphologie und induziert einen Übergang von einer mesenchymalartigen zu einer amöbenartigen Invasion und eine Verringerung der invasiven und migrierenden Kapazität dieser Zellen. Die kritischsten Schritte der Methode sind das Mischen des Markierungsreagenzes mit einem Antikörper, die Zugabe der Mischung zum Matrigel und zum Medium sowie der Zugang zum Live-Cell-Imaging-Gerät.

Diese Methode kann durch die Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Markierungsreagenzien und Antikörpern weiter implementiert werden, um die DMG-Zellinteraktion zu untersuchen, die durch direkte Zellen und Kontakt vermittelt wird. Unsere Methode bietet neue Werkzeuge, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Migration und Invasion von DMG in 3D zu untersuchen und neue Richtungen zur Hemmung ihres infiltrativen Phänotyps zu eröffnen.