Shotgun Proteomics Probenverarbeitung automatisiert durch einen Open-Source-Laborroboter

Dieses Protokoll verwendet Automatisierung, um proteinbiochemische Vorbereitungen vor Massenspektrometrie-Experimenten durchzuführen, was einen höheren Durchsatz und eine geringere Variabilität für Proteomstudien ermöglicht. Dieses Protokoll verwendet ein kostengünstiges, programmierbares Liquid-Handling-System, das für mehr Labore erschwinglich ist. Wir bieten Open-Source-Python-Skripte, die für die weitere Entwicklung modifiziert werden können.

Das Verfahren wird Milton Amaya, ein Masterstudent in unserem Labor, demonstrieren. Öffnen Sie zunächst die noSP3_Digestion. py-Skript im Texteditor und geben Sie die experimentspezifischen Variablen nach Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an.

Öffnen Sie dann die Opentrons-App und laden Sie das Skript auf die Registerkarte Protokoll in der Opentrons-App hoch. Als nächstes platzieren Sie die erforderliche Labware und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist. Legen Sie dann die Ammoniumbicarbonatlösung in die A1-Vertiefung des Vier-in-Eins-Röhrchengestells mit der 15-Milliliter plus 50-Milliliter-Röhrchenhalterplatte und legen Sie die Proteinprobe in die A1-Vertiefung des Vier-in-Eins-Röhrchengestells mit einer Zwei-Milliliter-Röhrchenhalterplatte.

Legen Sie manuell zwei Milliliter Protein Low-Bind-Röhrchen in die Vertiefungen des Aluminiumblocks, der oben auf dem Temperaturmodul platziert ist, beginnend mit A1 und vertikal nach unten. Platzieren Sie dann die DTT-Lösung in der A6-Vertiefung des Vier-in-Eins-Rohrgestells mit einer Zwei-Milliliter-Rohrhalterplatte. Beobachten Sie, wie der Roboter ein entsprechendes Volumen des Ammoniumbicarbonatpuffers auf die Probenröhrchen im Aluminiumblock überträgt.

Überprüfen Sie dann manuell, ob das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Sicherstellen, dass DTT in A6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde" anzeigt, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Nachdem Sie die Position der DTT-Röhre bestätigt und die Röhrenkappe geöffnet haben, klicken Sie in der Opentrons-App auf die Schaltfläche Fortsetzen, um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 Mikroliter der DVB-T-Lösung in jede Probenbohrung überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden.

Überprüfen Sie als Nächstes, ob das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung Sicherstellen, dass Kappen auf Probenröhrchen geschlossen werden angezeigt wird. Schließen Sie dann manuell die Kappen der Röhren und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Warten Sie, bis das Temperaturmodul des Roboters beginnt, den Aluminiumblock zu erwärmen und die Temperatur 55 Grad Celsius erreicht, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation, damit die Proben auf 55 Grad Celsius kommen können.

Der Roboter hält diese Temperatur dann 30 Minuten lang, um eine Proteinreduktion per DVB-T zu ermöglichen. Bereiten Sie während der Inkubation eine Iodoacetamidlösung vor und wickeln Sie sie manuell mit Aluminiumfolie ein, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Nach der Inkubation, wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Warnmeldung anzeigt, Stellen Sie sicher, dass die Kappen auf den Probenröhrchen geöffnet werden, heben Sie die Kappen der Probenröhrchen auf und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.

Überprüfen Sie als Nächstes manuell, ob das Programm des Roboters mit der Warnmeldung "Sicherstellen, dass Iodoacetamid in B6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde" angehalten ist, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Nachdem Sie die Rack-Position des Iodoacetamid-Röhrchens bestätigt und die Röhrchenkappe geöffnet haben, klicken Sie auf Fortsetzen und stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 Mikroliter der Iodoacetamid-Lösung in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Meldung "Kappen auf Probenröhrchen schließen", die Probenröhrchen verschließen und mit Folie abdecken, dann den gesamten Aluminiumblock mit einem sauberen Stück Folie abdecken und auf Fortsetzen klicken, um fortzufahren.

Warten Sie 30 Minuten, bis die Proben bei 22 Grad Celsius inkubiert sind, und stellen Sie sicher, dass das Temperaturmodul des Roboters nach Abschluss der Iodoacetamid-Inkubation deaktiviert wird. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Warnmeldung anzeigt, Stellen Sie sicher, dass Trypsin in C6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurde, bevor Sie das Protokoll wieder aufnehmen, legen Sie die Trypsin-Lösung in die C6-Vertiefung des Zwei-Milliliter-Rohrgestells mit geöffneter Rohrkappe und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Wenn dann das Programm des Roboters angehalten wird und die Warnmeldung angezeigt wird, Öffnen Sie die Kappen auf den Probenröhrchen auf dem Temperaturmodul, heben Sie die Probenröhrchen auf und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.

Standby, während der Roboter 10 Mikroliter Trypsin in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden. Nach dem Trypsin-Aufschluss über Nacht die Proben mit einer Tischmikrozentrifuge kurz drehen und die Proben auf ein magnetisches Röhrchengestell legen. Nach zwei Minuten den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in einen neuen Satz proteinarmer Mikrozentrifugenröhrchen geben und die Proben im Kühlschrank aufbewahren.

Öffnen Sie als Nächstes die SP3_peptide_cleanup. py Python-Skript in einem Texteditor und geben Sie die Experimentvariablen nach Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an. Laden Sie dann das Skript auf die Registerkarte Protokoll in der Opentrons-App hoch.

Platzieren Sie die erforderlichen Laborgeräte und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist, und stellen Sie sicher, dass das Magnetmodul eingeschaltet und mit dem Roboter verbunden ist. Legen Sie eine neue, zwei Milliliter, 96-Well tiefe Vertiefungsplatte auf die Oberseite des Magnetmoduls. Als nächstes legen Sie die verdauten Proben in das Zwei-Milliliter-Röhrchengestell, beginnend bei A1 und vertikal nach unten.

Stellen Sie dann sicher, dass der Roboter 55 Mikroliter der verdauten Proben zu den Vertiefungen in den Tiefbrunnenplatten auf dem Magnetmodul überträgt. Stellen Sie sicher, dass das Roboterprotokoll angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass vorbereitete Perlen in A6 des Zwei-Milliliter-Rohrracks in Steckplatz vier geladen wurden" anzeigt, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Dann die SP3-Perlen in einer Mini-Tischzentrifuge wirbeln und kurz drehen und bei geöffneter Kappe in den A6-Brunnen des Zwei-Milliliter-Rohrgestells legen.

Stellen Sie sicher, dass das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass 80 % Ethanol in A4 des 15-Milliliter plus 50-Milliliter-Röhrenracks geladen wurde, das sich in Steckplatz fünf befindet, vor der Wiederaufnahme des Protokolls" anzeigt. Legen Sie dann eine 80% ige Ethanollösung in die A4-Vertiefung im Röhrengestell und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Beobachten Sie, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam ändert, den Überstand aus jeder Vertiefung absaugt und in das Abfallrohr abgibt.

Warten Sie, bis der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit wieder auf standardisiert und das Magnetmodul abschaltet. Wenn das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Kappe auf Ammoniumbicarbonatrohr öffnen" anzeigt, öffnen Sie die Kappe der Ammoniumbicarbonatlösung und klicken Sie dann auf Fortsetzen, um fortzufahren. Standby, während der Roboter das Magnetmodul ausschaltet, 250 Mikroliter des Ammoniumbicarbonatpuffers in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.

Beobachten Sie dann, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam ändert und den Überstand von jedem Bohrloch in das Abfallrohr überträgt. Warten Sie, bis der Roboter 100 Mikroliter des Ammoniumbicarbonatpuffers in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt. Stellen Sie sicher, dass das Roboterprogramm angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass neue Sammelrohre in den Zwei-Milliliter-Aluminiumblock gelegt wurden, bevor sie das Protokoll fortsetzen" anzeigt.

Legen Sie dann unmittelbar nach dem letzten Probenröhrchen, das sich zunächst im Block befand, einen neuen Satz proteinretenarmer Mikrozentrifugenröhrchen in den Aluminiumblock und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren. Standby, während der Roboter jede Probe im Ammoniumbicarbonat-Puffer in die neuen Zwei-Milliliter-Röhrchen umgibt. Wenn das Programm des Roboters angehalten ist und die Meldung "Stellen Sie sicher, dass Trypsin in C6 des Zwei-Milliliter-Röhrenracks in Steckplatz vier geladen wurde, bevor das Protokoll fortgesetzt wird", legen Sie die Trypsinlösung in die C6-Vertiefung des Zwei-Milliliter-Rohrgestells mit geöffneter Rohrkappe und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.

Sobald das Programm abgeschlossen ist, wickeln Sie die Probenröhrchenkappen mit Paraffinfolie ein, geben Sie alle Proben in einen temperaturgesteuerten Mischer und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden mit 1.000 U / min Schütteln. Mit der BSA-Probe wurde ein Medium von 728 Peptidspektrumübereinstimmungen und 65 Peptiden mit Variationskoeffizienten von 5,2% bzw. 3,2% identifiziert. Mit einer komplexen Herzprobe wurde ein Medium von 9.526 Peptidspektrum-Übereinstimmungen, 7.558 Peptiden und 1.336 Proteinen in 10 Durchläufen mit 7,6% 5,9% bzw. 3,6% Variationskoeffizienten identifiziert.

Um die Variabilität bei der Peptidquantifizierung zu bestimmen, wurden die Variationskoeffizienten der extrahierten Ionenchromatogrammintensitäten für 10 Peptide berechnet, die einem einzigartigen Protein zugeordnet sind. Wenn die Variabilitäten der experimentellen Ergebnisse von Mensch und Roboter bei der Messung der Proteinkonzentration weiter mit dem BCA-Assay verglichen wurden, war der durchschnittliche Variationskoeffizient des Roboter-BCA-Assays niedriger als der manuelle BCA-Assay für den Menschen. Dieses Protokoll reduziert die Laborzeit für die Verarbeitung jeder Probe.

Es ebnet uns den Weg, Proteomik-Unterschiede in einem Panel von Zelllinien zwischen mehreren medikamentösen Behandlungen zu untersuchen.