Name: Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 45 s
Description: Lernen Sie ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung bei Mäusen kennen. Diese reproduzierbare Technik ermöglicht die Evaluation von Entzündungsprozessen und Heilungsmechanismen.

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Finanzierung: Gefördert durch: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. und R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) und Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health oder Sigma Xi dar.

Alle Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees an der University of Houston und dem Baylor College of Medicine genehmigt. Die in der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) zur Verwendung von Tieren in der Seh- und Augenforschung dargelegten Richtlinien wurden bei der Handhabung und Verwendung der Mäuse befolgt.
1. Vorbereitung
<ol><li>Herstellung von Fluoresceinlösung<ol>
<li>Bereiten Sie 1% ige Fluoresceinlösung vor, indem Sie 10 mg Natriumfluoresceinsalz in 1 ml steriler Kochsalzlösung oder steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen. HINWEIS: Bereiten Sie Natriumfluoresceinlösung am Tag der Anwendung oder einen Tag vorher vor, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Wenn sie einen Tag vor der Anwendung zubereitet wird, lagern Sie die Fluoresceinlösung bei 4 °C lichtgeschützt. Umwickeln Sie Rohre mit Aluminiumfolie, um Fotobleichen zu verhindern.</li>
		<li>Teilen Sie die Lösung in Aliquots auf, die für die Verwendung in einem einzigen Experiment geeignet sind. Pro Maus und Zeitpunkt werden 1-1,5 μL Fluoresceinlösung verwendet. Verwenden Sie die folgende Formel, um das Volumen von Aliquot zu berechnen, das für ein einzelnes Experiment geeignet ist: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq01.jpg"> HINWEIS: Wenn beispielsweise sechs Mäuse in einem einzigen Experiment untersucht werden, bei dem die Wundgröße zu fünf Zeitpunkten überwacht wird, wäre das für dieses einzelne Experiment geeignete Aliquot-Volumen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63112/63112eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zubereitung von Ketamin / Xylazin Cocktail für die Anästhesie von Mäusen.<ol>
<li>Um 10 ml Cocktail zuzubereiten, mischen Sie 2,0 ml Ketamin (100 mg / ml) mit 1,0 ml Xylazin (20 mg / ml) und fügen Sie 7,0 ml steriles PBS hinzu. Bereiten Sie einen Tag vor oder am Tag der Operation einen Ketamin / Xylazin-Cocktail zu. HINWEIS: Alle Lösungen sollten bei Raumtemperatur verwendet werden, sofern nicht anders angegeben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Anästhesie
<ol><li>Wiegen Sie die Maus (8-12 Wochen alte C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse), um die geeignete Menge an Anästhetikum zu bestimmen. Verwenden Sie die zweihändige Maus-Rückhaltetechnik, um Mäuse für die Injektion des Anästhetikums zurückzuhalten und zu handhaben18. Verabreichen Sie den Ketamin/Xylazin-Cocktail intraperitoneal (i.p.) in einer Endkonzentration von 80 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin.</li>
	<li>Warten Sie, bis eine Vollnarkose erreicht ist, bevor Sie eine Hornhautverletzung an der Maus durchführen. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex nach dem Einklemmen der Zehen beurteilen. Wenn eine angemessene Anästhesie erreicht ist, sollte sich die Maus nicht auf Zehenspitzen bewegen. HINWEIS: Da Mäuse während der Anästhesie schnell Körperwärme verlieren, ist es wichtig, eine Wärmequelle für Mäuse bereitzustellen, um Unterkühlung zu verhindern. Legen Sie Mäuse während der Anästhesie- und Erholungsphasen auf eine Wärmequelle (Heizkissen).</li>
</ol>3. Entstehung einer Hornhautwunde
<ol><li>Wunde nur das rechte oder linke Auge. Bewahren Sie die Konsistenz mit dem Auge (d. H. Links oder Rechts), das beim Wechsel von Maus zu Maus verwundet ist. HINWEIS: Da Abschürfungen die Hornhautnerven schädigen und die Sehschärfe verringern, kann das Verwunden beider Augen zu erheblichen Beschwerden und Beeinträchtigungen führen. Da Analgetika das Potenzial haben, Entzündungsreaktionen zu unterdrücken, kann ihre Verwendung in bestimmten Experimenten, die darauf abzielen, Hornhautentzündungen zu verstehen, ein Hindernis sein. Die Vermeidung von Analgetika in Hornhautwundexperimenten wurde von unserem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.</li>
	<li>Um die Epithelhornhautwunde zu erzeugen<ol>
<li>Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop das Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm (siehe Abbildung 1), um die Mitte der Hornhaut abzugrenzen, und halten Sie das Auge mit Daumen und Zeigefinger weit geöffnet, um die Augenlider zu halten. Drehen Sie das Trephin vorsichtig, um einen Eindruck auf das Hornhautepithel zu machen. HINWEIS: Es muss darauf geachtet werden, dass bei der Verwendung von Trephin kein übermäßiger Druck ausgeübt wird, da dies zu einer Perforation der Hornhaut führen kann. Außerdem muss darauf geachtet werden, das Trephin zentral zu positionieren. Die Schüler können als Wahrzeichen genutzt werden, um das Zentrum der Hornhaut zu lokalisieren.</li>
		<li>Halten Sie unter einem Seziermikroskop den stumpfen Golfschläger-Spud (siehe Abbildung 1) auf etwa 45° von der Oberfläche der Hornhaut innerhalb des mit dem Trephin abgegrenzten Bereichs. Kratzen Sie vorsichtig und kontinuierlich das Epithel innerhalb des abgegrenzten Bereichs mit dem Spud, um das Epithel zu debridieren. HINWEIS: Wenden Sie im Debridement keine übermäßige Kraft an, da dies auch zu einer Hornhautperforation führen kann. Die Augen von Mäusen können während des Verwundungsprozesses austrocknen, was das Debridement erschwert. Tragen Sie in einem solchen Fall steriles PBS auf die Augenoberfläche auf, um eine optimale Hydratation aufrechtzuerhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig01.jpg"> Abbildung 1: 2 mm Trephine und stumpfer Golfschläger-Spud. Das Trephin wird verwendet, um eine kreisförmige Region im Hornhautzentrum abzugrenzen, und der Golfschläger-Spud wird verwendet, um das Epithel innerhalb der abgegrenzten Region zu entfernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
4. Überwachung des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung
<ol><li>Pipette 1-1,5 μL 1% ige Fluoresceinlösung auf die verwundete Oberfläche und bilden Sie Hornhaut mit einem Digitalmikroskop mit einer blauen Lichtquelle ab.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder innerhalb der ersten Minute nach der Zugabe von Fluoresceinlösung, um eine Ausbreitung auf das umgebende Epithel zu vermeiden, was zu einer Überschätzung der Wundgröße führt. Verwundete Hornhäute werden zu bestimmten Zeiten (d. h. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h und 30 h) nach der Verwundung abgebildet. HINWEIS: Zu jedem Zeitpunkt wird die Bildgebung unter Narkose durchgeführt; Ketamin / Xylazin wird zum Zeitpunkt der Wundung verwendet, während Isofluran zu späteren Zeitpunkten verwendet wird. Mäuse werden für die Dauer der Wundverschlussüberwachung einzeln in separaten Käfigen untergebracht. Wenn sie zusammen untergebracht werden, neigen Mäuse dazu, die Augen des Wurfgeschwisters zu lecken, ein Verhalten, von dem gezeigt wurde, dass es die Wundheilung in verschiedenen Geweben beeinflusst19,20.</li>
	<li>Analysieren Sie aufgenommene Bilder und verfolgen Sie den Wundbereich mit einer Bildanalysesoftware. Die Wundfläche für jeden Zeitpunkt wird als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche bei 0 h ausgedrückt.</li>
</ol>5. Immunfluoreszenzbildgebung und -analyse
<ol><li>Euthanasieren Sie Mäuse nach einer IACUC-zugelassenen Methode (in diesem Fall Kohlendioxid-Überdosierung gefolgt von zervikaler Dislokation) zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Verwundung.</li>
	<li>Ernten Sie Augäpfel, indem Sie vorsichtig auf die seitliche Canthus drücken, um den Augapfel mit einer gebogenen Irisschere zu verschieben. Führen Sie die Schere hinter den Augapfel, um den Sehnerv fest zu greifen, und schneiden Sie dann den Nerv durch, wodurch der Augapfel entfernt werden kann.</li>
	<li>Fixieren Sie jeden Augapfel in 1 ml 1x PBS mit 2% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur und waschen Sie ihn dann dreimal in 1 ml 1x PBS für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine chirurgische Klinge, um einen Schnitt in der Sklera zu machen, etwa 500 μm distal zum Limbus, und schneiden Sie dann durch den Globus. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Irismaterie aus der Hornhaut und schneiden Sie dann das Skleralgewebe vorsichtig ab, wobei Sie sicherstellen, dass der Limbus intakt bleibt.</li>
	<li>Machen Sie vier partielle radiale Schnitte, die jeweils etwa 1 mm lang sind, die sich von der peripheren Hornhaut erstrecken und kurz vor der Mitte anhalten, damit die Hornhaut abflachen kann.</li>
	<li>Permeabilisieren und blockieren Sie Hornhäute in 1 ml 2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01% TritonX-100 in 1x PBS für 15 Minuten, gefolgt von einer Blockierung in 2% BSA in 1x PBS für weitere 45 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie Hornhäute über Nacht bei 4 ° C in einem Cocktail aus direkt markierten einzigartigen fluorochromkonjugierten Antikörpern, die in 1x PBS mit 2% BSA hergestellt werden. HINWEIS: Antikörper zielen darauf ab, bestimmte Zellen und Gewebe von Interesse zu markieren. Zum Beispiel sind Endothel, Neutrophile und Blutplättchen mit Anti-CD31 21,22, Anti-Ly-6G 23,24 bzw. Anti-CD41 25,26 Antikörpern markiert. 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wird dem Antikörpercocktail hinzugefügt, um Kerne sichtbar zu machen.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Hornhaut dreimal in 1x PBS für jeweils 15 Minuten waschen.</li>
	<li>Montieren Sie Hornhäute auf einem Objektträger in einem Tropfen Anti-Fade-Fluoreszenz-Montagemedium, Abdeckung mit einem Deckglas und Bild mit der gewünschten Vergrößerung (4x bis 100x Objektiv) mit einem Fluoreszenz-Lichtmikroskop. Nehmen Sie Bilder der Hornhaut in voller Dicke in verschiedenen Regionen auf, wie in Abbildung 2A dargestellt. HINWEIS: Das in Abbildung 2A dargestellte Muster der mikroskopischen Analyse wird zur Analyse spezifischer regionaler Veränderungen bei Entzündungen und Zellteilung verwendet. Sowohl die DAPI- als auch die Ly-6G-Färbung werden verwendet, um die extravaskulären Neutrophilen zu identifizieren. Bei DAPI-Färbung haben sphärische Neutrophile einen ausgeprägten hufeisen- oder donutförmigen Kern (Abbildung 2B).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig02.jpg"> Abbildung 2: Hornhautbildgebungsstrategie und Neutrophileninfiltration nach zentralem Abrieb . (A) Schematische Darstellung eines Hornhaut-Wholemounts mit neun mikroskopisch kleinen Feldern über den Durchmesser der Hornhaut. Der graue Bereich stellt den ursprünglichen Wundbereich dar. Die Breite jeder Region beträgt 500 μm. (B) Beachten Sie die ausgeprägte Hufeisen- oder Donutform von Neutrophilenkernen mit DAPI-Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63112/63112fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Zweck dieses Methodenpapiers war es, ein Protokoll zur Herstellung einer zentralen Hornhautepithelabriebwunde in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud zu beschreiben. Dieses murine Modell wurde verwendet, um Hornhautentzündungen und ihren Beitrag zur Wundheilung zu untersuchen. Diese Art von Modell kann verwendet werden, um Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen und bei Pathologien 17,28,29,41,42 zu untersuchen.<sup class...

Die Hornhaut ist das transparente vordere Drittel des Auges. Die Hornhaut erfüllt mehrere Funktionen, einschließlich des Schutzes der inneren Strukturen des Auges und der Bildung einer strukturellen Barriere, die das Auge vor Infektionen schützt1. Noch wichtiger ist, dass die Hornhaut für das Sehen entscheidend ist und etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges liefert 2,3. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch täglich einer Vielzahl von Verletzungen ausgesetzt, die zu einer Störung ihrer Barrierefunktion, einem Verlust der Transparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Der Verlust der Transparenz der Hornhaut ist weltweit eine der Hauptursachen für Sehstörungen 4,5. Hornhautabschürfungen sind ein häufiger Grund für Besuche in der Notaufnahme (ER) und machen die Hälfte der augenbezogenen Fälle aus, die in der Notaufnahme6 vorgestellt wurden. Es wird geschätzt, dass in den Vereinigten Staaten jährlich über 1 Million Menschen an Augenverletzungen leiden7. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung ihrer Transparenz und Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung 8,9. Auch die zunehmende Beliebtheit von refraktiven Operationen stellt eine einzigartige traumatische Herausforderung an die Hornhaut10 dar. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung.
Zu diesem Zweck wurden mehrere Tiermodelle der Hornhautwundheilung entwickelt 11,12,13,14,15. Murine Modelle der Hornhautwundheilung haben sich als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Verschiedene Arten von Hornhautwunden wurden bei der Untersuchung der Hornhautwundheilung eingesetzt, die jeweils für die Untersuchung verschiedener Aspekte des Wundheilungsprozesses geeignet sind. Die häufigsten Arten von Wundmodellen, die in Hornhautwundheilungsstudien verwendet werden, sind die mechanischen und chemischen Wundmodelle. Chemische Hornhautwunden, die meist die Entstehung von alkalischen Verbrennungen an der Hornhaut beinhalten, sind nützlich für die Untersuchung von Hornhautgeschwüren, Trübung und Neovaskularisation13. Mechanische Hornhautwunden betreffen Debridement (Abrieb) Wunden und Keratektomiewunden14,15,16. Eine intakte oder gebrochene Hornhautepithel-Basalmembran definiert Debridement- bzw. Keratektomie-Wunden. Bei Debridementwunden bleibt die epitheliale Basalmembran intakt, während bei Keratektomiewunden die Basalmembran mit Penetration meist in das vordere Stroma durchbrochen wird. Debridement-Wunden sind am nützlichsten für die Untersuchung der Re-Epithelisierung, der Epithelzellproliferation, der Immunantwort und der Nervenregeneration nach Hornhautwunden. Keratektomie-Wunden hingegen sind am nützlichsten für die Untersuchung der Hornhautnarben14,15.
Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut publiziert und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheit17 zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD31-Antikörper</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD41-Antikörper</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>553847</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G-Antikörper</td><td>BD Bioscience, Pharmingen</td><td>551459</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Weitfeld-Dekonvolutionsfluoreszenzmikroskop</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Leica Mikrosysteme</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Toploading-Waagen (Waage)</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Ethanol</td><td>ThermoFisher wissenschaftliche</td><td>T038181000CS</td><td></td></tr><tr><td>Golfschläger-Spud</td><td>Stephens instruments</td><td>S2-1135</td><td></td></tr><tr><td>Iriskurvenschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>31212</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson veterinärmedizinisch</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Patterson veterinärmedizinisch</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluoresceinsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46970</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Klinge (Scapel-Klinge)</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>TritonX -100</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-295-34</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11923-13</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Patterson Veterinär</td><td>Nr. 07-808-1947</td><td></td></tr></tbody></table>

ein epitheliales abriebmodell zur untersuchung der hornhautwundheilung

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

Die Hornhaut ist entscheidend für das Sehen und macht etwa zwei Drittel der Brechkraft des Auges aus. Entscheidend für die Rolle der Hornhaut im Sehvermögen ist ihre Transparenz. Aufgrund ihrer äußeren Position ist die Hornhaut jedoch sehr anfällig für eine Vielzahl von Verletzungen, die zum Verlust der Hornhauttransparenz und schließlich zur Erblindung führen können. Eine effiziente Hornhautwundheilung als Reaktion auf diese Verletzungen ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Hornhauthomöostase und die Erhaltung der Hornhauttransparenz und der Brechungsfähigkeiten. Bei kompromittierter Hornhautwundheilung wird die Hornhaut anfällig für Infektionen, Ulzerationen und Narbenbildung. Angesichts der grundlegenden Bedeutung der Hornhautwundheilung für die Erhaltung der Transparenz und des Sehvermögens der Hornhaut ist ein besseres Verständnis des normalen Hornhautwundheilungsprozesses eine Voraussetzung für das Verständnis der mit Infektionen und Krankheiten verbundenen beeinträchtigten Hornhautwundheilung. Um dieses Ziel zu erreichen, haben sich murine Modelle der Hornhautwunde als nützlich erwiesen, um unser Verständnis der Hornhautwundheilungsmechanismen unter normalen physiologischen Bedingungen zu verbessern. Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung eines zentralen Hornhautepithelabriebs bei der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. In diesem Modell wird ein kreisförmiges Trephin mit einem Durchmesser von 2 mm, zentriert über der Hornhaut, verwendet, um den Wundbereich abzugrenzen. Der Golfschläger-Spud wird mit Vorsicht verwendet, um das Epithel zu debriden und eine kreisförmige Wunde zu erzeugen, ohne die Hornhautepithel-Basalmembran zu beschädigen. Die resultierende Entzündungsreaktion verläuft als eine gut charakterisierte Kaskade von zellulären und molekularen Ereignissen, die für eine effiziente Wundheilung entscheidend sind. Dieses einfache Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und gut veröffentlicht und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Abbildung 3 zeigt eine Transmissionselektronenmikroskopaufnahme einer Hornhautwunde, die mit dem stumpfen Golfschläger-Spud erzeugt wurde und zeigt, dass die epitheliale Basalmembran nach einer Verletzung tatsächlich intakt ist.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63112/63112fig03.jpg"> Abbildung 3: Die epitheliale Basalmembran bleibt nach dem Hornhautabrieb intakt. </...

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer zentralen Hornhautepithelabriebwicklung in der Maus mit einem Trephin und einem stumpfen Golfschläger-Spud beschrieben. Dieses Hornhautwundheilungsmodell ist hochgradig reproduzierbar und wird nun verwendet, um eine kompromittierte Hornhautwundheilung im Zusammenhang mit Krankheiten zu bewerten.

Ein epitheliales Abriebmodell zur Untersuchung der Hornhautwundheilung

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Hornhautentzündungen und ihrem Beitrag zur Wundheilung unter normalen und pathologischen Bedingungen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise und reproduzierbare Epithelwunde erzeugt, ohne die Basalmembran zu durchbrechen. Dieses Modell der Hornhautverwundung ist unkompliziert und schnell durchzuführen.Das Verfahren wird Prinz Akowuah, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie zunächst eine 1% -Fluoresceinlösung vor, indem Sie 10 Milligramm Natriumfluoresceinsalz in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung oder PBS auflösen. Als nächstes bereiten Sie für die Anästhesie 10 Milliliter eines Ketamin-Xylazin-Cocktails vor, indem Sie zwei Milliliter Ketamin, einen Milliliter Xylazin und sieben Milliliter steriles PBS mischen.Nachdem Sie eine 8 bis 12 Wochen alte C57 Black 6 Wildtyp-Maus betäubt haben, bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex nach dem Einklemmen der Zehen beurteilen. Um die Epithelhornhautwunde zu erzeugen, legen Sie die betäubte Maus unter ein Dissektionsmikroskop. Wunden Sie nur das rechte oder linke Auge und halten Sie die Konsistenz mit dem Auge aufrecht, das verwundet wird, wenn Sie sich von Maus zu Maus bewegen.Halten Sie das Auge weit offen, indem Sie die Augenlider mit Daumen und Zeigefinger halten. Markieren Sie dann mit einem sterilen Trephin mit einem Durchmesser von zwei Millimetern das Zentrum der Hornhaut und drehen Sie das Trephin vorsichtig, um einen Eindruck auf das Hornhautepithel zu machen. Üben Sie keinen übermäßigen Druck aus, da dies zu einer Perforation der Hornhaut führen kann.Als nächstes halten Sie den sterilen stumpfen Golfschläger-Spud in einem Winkel von etwa 45 Grad von der Hornhautoberfläche und debriden Sie das Epithel durch sorgfältiges und kontinuierliches Kratzen innerhalb des abgegrenzten Bereichs mit dem Spud. Wenden Sie keine übermäßige Kraft an und halten Sie die Hydratation bei Bedarf mit sterilem PBS aufrecht. Zur Überwachung des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung pipettieren Sie 1 bis 1,5 Mikroliter 1%fluorescein-Lösung auf die verletzte Oberfläche und bilden die Hornhaut mit einem Digitalmikroskop mit einer blauen Lichtquelle ab.Stellen Sie sich die verwundete Hornhaut zu bestimmten Zeiten nach der Verwundung vor. Machen Sie Bilder innerhalb der ersten Minute nach der Zugabe von Fluoresceinlösung, um eine Ausbreitung der Lösung auf das umgebende Epithel zu vermeiden, was zu einer Überschätzung der Wundgröße führen kann. Als nächstes verfolgen Sie mit einer Bildanalysesoftware den Wundbereich und drücken den Wundbereich zu jedem Zeitpunkt als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche zur Nullstunde aus.Eine transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme der Hornhautwunde zeigt, dass die Epithel-Basalmembran auch nach der Verletzung intakt bleibt. Bei 8 bis 12 Wochen alten Wildtyp-Mäusen ist der Wundverschluss 24 Stunden nach der Verwundung abgeschlossen. Die Entzündungsreaktion auf Wunden ist durch Zellbildgebung am Limbus gekennzeichnet.Hier ist das limbale Gefäßsystem einer unverwundeten Hornhaut mit extravaskulären Neutrophilen und das einer verwundeten Hornhaut mit extravaskulären Blutplättchen und Neutrophilen 30 Stunden nach dem Abrieb gezeigt. Um dieses Protokoll erfolgreich zu reproduzieren, muss in jedem Mausbereich die gleiche Dehnung verwendet werden, und die Wundgröße und -tiefe muss wie beschrieben erzeugt werden.

an-epithelial-abrasion-model-for-studying-corneal-wound-healing

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier wird die Etablierung eines klinisch relevanten ex vivo Schein-Kataraktchirurgie-Modells beschrieben, das zur Untersuchung von Mechanismen der Verletzungsreaktion von Epithelgeweben in ihrer nativen Mikroumgebung verwendet werden kann.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

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Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

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Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Das vorliegende Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte auf, die bei der Wunde der Hornhaut eines embryonalen Kükens in Ovo erforderlich sind. Die regenerierenden oder vollständig wiederhergestellten Hornhäute können nach dem Wundvorgang mit verschiedenen zellulären und molekularen Techniken auf Regenerationspotenzial analysiert werden.

Untersuchung der narbenlosen Geweberegeneration bei embryonalen verwundeten Kükenhornhäuten

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

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