Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Diese Methode ermöglicht es den Forschern, die Zellkontraktion mehrerer Patientenzelllinien gleichzeitig zu untersuchen. Es ermöglicht uns, Krankheiten schneller und effizienter zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Zellkontraktion in Echtzeit zu quantifizieren.

Innerhalb einer Stunde können wir die Kontraktionswerte von Dutzenden von Zellen erhalten. Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass die Muskelzellkontraktion bei einer Gruppe von Patienten mit Aortenaneurysmen verringert ist. Dies kann ein neuer Biomarker oder ein Ziel für die medizinische Therapie sein.

Beginnen Sie mit der Sterilisation von zwei Paar chirurgischer Pinzetten und eines Skalpells, indem Sie sie in 70% Ethanol tauchen und anschließend trocken wischen. Dann pipettieren Sie zwei Milliliter SMC-Medium in einer Petrischale, in der die Gewebedissektion durchgeführt wird. Als nächstes pipettieren Sie 2,5 Milliliter SMC-Medium in zwei T-25-Kolben.

Wirbeln Sie die Kolben herum, so dass das kleine Volumen des Mediums die gesamte Oberfläche bedeckt. Untersuchen Sie die Biopsie visuell und identifizieren Sie die drei Aortenschichten durch das Vorhandensein von atherosklerotischen Plaques auf der intimen Seite und schleimigem Bindegewebe auf der Adventitialseite, um die Schichten zu unterscheiden. Um SMCs von den Medien zu isolieren, entfernen Sie die anderen beiden Schichten, indem Sie das Gewebe zuerst mit der Intima-Plaque-Seite nach oben legen, dann entfernen Sie die feste Plaque, indem Sie sie mit einer Pinzette vom Gewebe wegziehen, während Sie das Gewebe mit dem zweiten Paar Pinzetten nach unten drücken, bis die rosa einheitliche mediale Schicht sichtbar ist.

Drehen Sie nun das Gewebe um und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie die zufällige Schicht abziehen, wobei Sie sicherstellen müssen, dass alle sichtbaren Teile in so vielen Versuchen wie nötig entfernt werden, da sich diese Schicht nicht leicht vom Medium löst. Sobald die Medienschicht isoliert ist, schneiden Sie das Gewebe in Würfel, indem Sie das Medium mit einer Pinzette nach unten drücken und das Gewebe mit dem Skalpell in eine Richtung schneiden, um saubere unidirektionale Schnitte zu machen, um Schäden zu minimieren. Legen Sie 10 bis 20 dieser Gewebestücke mit einer Pinzette in das obere Viertel der T-25-Flak.

Nach der Sterilisation von zwei Paar chirurgischer Pinzetten und eines Skalpells, wie zuvor beschrieben, pipettieren Sie zwei Milliliter Fibroblastenmedium in einer Petrischale, in der die Gewebedissektion durchgeführt wird. Dann pipettieren Sie 2,5 Milliliter Fibroblastenmedium in zwei T-25-Kolben und wirbeln Sie die Kolben herum, so dass das kleine Volumen des Mediums die gesamte Oberfläche bedeckt. Untersuchen Sie die Biopsie visuell, um die Epidermis mit einer erkennbaren Hautoberfläche, manchmal mit sichtbaren Haaren, zu identifizieren, und suchen Sie dann auf der gegenüberliegenden Seite nach gelbem und schleimigem Unterhautfett.

Die Schicht zwischen der Epidermis und dem subkutanen Fett ist die Dermis, die Quelle lebensfähiger Fibroblasten. Um Fibroblasten von der Dermis zu isolieren, entfernen Sie die anderen beiden Schichten, indem Sie das Gewebe auf die Dermisseite legen, um alle drei Schichten sichtbar zu machen. Halten Sie dann das Gewebe mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die gesamte Epidermis in einer sauberen Linie ab, ohne das Gewebe zu beschädigen.

Drehen Sie nun das Gewebe um und wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie in die Dermis parallel zur Grenze mit dem subkutanen Fett schneiden. Sobald die Dermis isoliert ist, schneiden Sie das Gewebe in Würfel, drücken Sie das Gewebe mit einer Pinzette nach unten und schneiden Sie das Gewebe mit dem Skalpell in eine Richtung. Legen Sie dann 10 bis 20 dieser Gewebestücke mit der Pinzette in das obere Viertel des T-25-Kolbens.

Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler und säen Sie die SMCs dreifach mit einer Aussaatdichte von 30.000 Zellen pro Well in 200 Mikrolitern SMC-Medium in der gelatinebeschichteten ECIS-Platte. Legen Sie die Platte mit den SMCs in den 96-Well-Halter des ECIS im Zellkultur-Inkubator. Doppelklicken Sie auf die ECIS Applied BioPhysics Software, um das Programm zu öffnen, und drücken Sie die Setup-Taste.

Überprüfen Sie, ob alle Elektroden mit dem Halter im linken unteren Bereich mit der Aufschrift Well Configuration in Kontakt stehen. Wenn die Elektroden nicht richtig angeschlossen sind, stellen Sie die Platte in der Halterung ein, bevor Sie mit der Messung beginnen. Wählen Sie nun den Plattentyp im selben Bedienfeld aus, indem Sie auf Array-Typ klicken.

Als nächstes bereiten Sie zwei Pipetten vor, die auf zwei Mikroliter und 150 Mikroliter Volumen eingestellt sind. Bevor Sie mit der Stimulation beginnen, drücken Sie in der Software auf Markieren und geben Sie einen Kommentar ab. Um die Zellen zu stimulieren, entfernen Sie den Deckel und legen Sie ihn auf eine sterile Oberfläche im Inkubator.

Dann induzieren Sie die SMC-Kontraktion, indem Sie so schnell wie möglich zwei Mikroliter der Ionomycin-Arbeitslösung in jeden Brunnen pipettieren. Sobald alle Zellen stimuliert wurden, mischen Sie das Medium in den Vertiefungen mit der zweiten Pipette. Um die Reproduzierbarkeit interexperimenteller Messungen zu bestimmen, wurden zwei unabhängige Messungen aller eingeschlossenen Kontroll- und Patientenzelllinien als Bland-Altman-Diagramm dargestellt, was zeigt, dass diese Methode keine Variabilität außerhalb des Konfidenzintervalls zeigte, mit Ausnahme einer Ausreißerzelllinie.

Zwei Wells, die mit demselben Experiment gesät und gleichzeitig stimuliert wurden, zeigten praktisch die gleiche vertragliche Reaktionskurve. Um zu validieren, ob es sich bei der gezeigten Reaktion um eine Kontraktion und nicht um osmotischen Stress aufgrund der Ionomycinstimulation handelte, wurde das Medium nach der Stimulation ersetzt und das Verhalten der Zellen aufgezeichnet, was zeigte, dass sich die stimulierten Zellen wieder über die Elektrode auszubreiten begannen. Die kontraktile Reaktion bei SMCs, die von gesunden, nicht erweiterten Aorten abgeleitet wurde, zeigte eine mediane Reaktion von 61% im Vergleich zur medianen Reaktion von 52% bei Patienten mit abdominaler Aortenaneurysma.

Die mittlere kontraktile Reaktion der Kontrollgruppe wurde verwendet, um vier Patienten zu identifizieren, die niedrigere Kontraktionswerte als die Normalwerte aufwiesen. Die Western-Blot-Analyse und die anschließende Quantifizierung bestätigten, dass die Zellen SMC-Marker exprimieren. Zur Bestimmung der proliferativen Kapazität des SMC wurde für Ki67 eine qPCR durchgeführt.

Die Ki67-Expression war in allen Zellen nachweisbar, korrelierte aber nicht mit der kontraktilen Ausgabe. Wenn Sie die Zellen zur Kontraktion anregen, denken Sie daran, nicht zu viele Brunnen gleichzeitig zu pipettieren und zu versuchen, so schnell wie möglich zu pipettieren. Dieses Verfahren erfordert möglicherweise etwas Übung.

Mit dieser Methode haben wir die Patienten basierend auf ihrer Kontraktion und der Verringerung der normalen Kontraktion aufgeteilt, was es uns ermöglichte, diese Patienten und die Verbindungen zu ihren klinischen Merkmalen wie dem Rauchen zu untersuchen.