Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Bei Retinopathien sind vaskuläre Veränderungen das erste Anzeichen, das von Klinikern erkannt wird. Sie folgen dem Fortschreiten der Krankheit und wählen eine Behandlung entsprechend diesen Veränderungen. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um verschiedene Stadien der Pathologie zu untersuchen.

In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie man verschiedene vaskuläre Veränderungen misst. Dafür werden wir zwei Tiermodelle einsetzen. Eines davon ist das Mausmodell der sauerstoffinduzierten Retinopathie, das die Retinopathie der Frühgeburtlichkeit und einige Aspekte der proliferativen diabetischen Retinopathie reproduziert.

Hier werden wir avaskuläre Bereiche, neovaskuläre Bereiche und die Dilatation und Tortuosität der Arteriolen messen. In unserem Labor wurde ein Mausmodell für das metabolische Syndrom entwickelt, das eine nichtproliferative Retinopathie induziert. Gefäßdichte und Verzweigung wurden in dieser Arbeit evaluiert.

Wenn Mäuse opfern, enukleatieren Sie mit einer Schere. Enukleierte Augen mit frisch zubereitetem Paraformaldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur fixieren. Entfernen Sie unter dem Seziermikroskop die Hornhaut mit einer Schere, indem Sie entlang des Limbus schneiden und die gesamte Netzhaut sezieren.

Verwerfen Sie das vordere Segment des Auges und trennen Sie dann die Netzhaut von der RPE-Aderhaut. Legen Sie die Netzhaut in 200 Mikroliter-Röhrchen. Dann blockieren und permeabilisieren Sie die Netzhaut in 100 Mikrolitern TBS mit 5% Rinderserumalbumin Triton während sechs Stunden bei vier Grad mit sanfter Bewegung im Shaker.

Dann drehen Sie die Tube um, um die Netzhaut in die Tasse zu legen und die blockierende Lösung mit Pipette zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter Lösung hinzu, die Isolektin enthält. Wickeln Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um die Proben vor Licht zu schützen.

Inkubieren Sie die Netzhaut mit Lektinlösung über Nacht bei vier Grad mit sanfter Bewegung im Shaker. Waschen Sie die Netzhaut mit 100 Mikrolitern TBS-Triton für 20 Minuten mit sanfter Bewegung im Shaker. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.

Legen Sie die Netzhaut in einen Objektträger und fügen Sie einen Tropfen PBS hinzu. Führen Sie unter dem Seziermikroskop vier gleich weit entfernte Schnitte von den Rändern der Netzhaut in Richtung Sehnerv durch. Um die Blütenblätter der Netzhaut zu entfalten, verwenden Sie eine Pinzette oder kleine Stücke Filterpapier.

Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorseite nach unten zeigt. Entfernen Sie die restliche PBS mit Filterpapier von der Folie. Fügen Sie dann einen Montagemedian und einen Deckglas hinzu.

Lassen Sie es eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie Die Dias bei vier Grad lichtgeschützt auf. Legen Sie am konfokalen Mikroskop den Objektträger mit der Vorderseite nach unten in die Platte.

Fokussieren Sie den oberen Plexus des retinalen Gefäßsystems und wählen Sie einen Bereich aus, um die Bildaufnahme zu starten. Stellen Sie allgemeine Laserparameter in der Software ein. Legen Sie die Koordinaten in X-, Y- und Z-Achse fest.

Initialisieren Sie den Scanvorgang. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie das Bild und speichern Sie es mit einer bevorzugten Erweiterung. Gehen Sie in der ImageJ FIJI-Software zur Menüleiste und klicken Sie auf Datei, Öffnen.

Wählen Sie das zu bearbeitende Bild aus. Wählen Sie im Fenster Importoption für Bioformate die Option OME-XML-Metadaten anzeigen aus, und klicken Sie auf OK.In Fenster OME-Metadaten nach Pixelgrößeninformationen suchen. Kopieren Sie diese Daten.

Gehen Sie zur Bildkalibrierung zur Menüleiste und wählen Sie Bildeigenschaften. Kopieren Sie die Informationen und klicken Sie auf OK. Weisen Sie dem Bild eine bevorzugte Lut zu. Um alle Stapel in einem einzigen Bild zu visualisieren, gehen Sie zur Menüleiste und wählen Sie Bild, Stapel, Z-Projekt.

Wählen Sie im angezeigten Projektionsfenster alle Stapel aus, in denen Gefäße visualisiert werden. Wählen Sie unter Projektionstyp die Option Durchschnittliche Intensität und klicken Sie auf OK. Gehen Sie zur Menüleiste, Bild, Anpassen, Helligkeit / Kontrast. Klicken Sie auf Übernehmen und speichern Sie die Änderungen.

Kopieren Sie die für Helligkeit und Kontrast ausgewählten Parameter. Diese müssen für alle Bilder identisch sein. Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus.

Wählen Sie den Netzhautbereich aus, in dem keine gebildeten Gefäße vorhanden sind. Drücken Sie T auf der Tastatur, um die ausgewählten Bereiche im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Informationen zum avaskulären Bereich abzurufen.

Wiederholen Sie diese Schritte, um die Gesamtfläche der Netzhaut zu messen. Wählen Sie in der Menüleiste das Werkzeug Zauberstab aus. Zoomen Sie in das Bild, um Neoschiffe besser zu visualisieren.

Wählen Sie die Neoschiffe nacheinander mit dem Zauberstab-Werkzeug aus. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Bereichsdaten abzurufen.

Wählen Sie in der Menüleiste das Gerade-Linie-Werkzeug aus. Zoomen Sie in das Bild, um die Gefäßwand besser zu visualisieren. Führen Sie vor dem ersten Zweig drei Querlinien zum Hauptschiff durch.

Drücken Sie T auf der Tastatur, um die ausgewählten Bereiche im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Entfernungsdaten abzurufen. Klicken Sie in der Menüleiste mit der rechten Maustaste auf das Werkzeugsymbol gerade Linie und wählen Sie Segmentierte Linie.

Zeichnen Sie eine Linie innerhalb des Gefäßes vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung, die der Gefäßform folgt. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Wählen Sie in der Menüleiste das Gerade-Linie-Werkzeug aus.

Zeichnen Sie eine Linie vom Sehnerv bis zur ersten Gefäßverzweigung. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen. Klicken Sie im ROI-Manager auf Messen, um die Entfernungsdaten abzurufen.

Definieren Sie mit dem Oval-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, der auf alle experimentellen Bedingungen gleichermaßen angewendet wird. Der ausgewählte Bereich muss ein konzentrischer Kreis sein, der um den Sehnerv gezogen wird. Drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten Bereich im ROI Manager aufzuzeichnen.

Zählen Sie manuell die Anzahl der primären Zweige, die aus hauptschiffen innerhalb des Auswahlbereichs entstehen. Transformieren Sie das Bild in den 8-Bit-Modus. Gehen Sie in der Menüleiste zu Plugins und wählen Sie Gefäßanalyse, Gefäßdichte.

Definieren Sie mit dem Quadrat-Werkzeug der Menüleiste einen Bereich, in dem Sie die Gefäßdichte messen möchten. Klicken Sie auf OK. Das Programm zeigt ein neues Fenster mit den erforderlichen Informationen an. Im ersten experimentellen Beispiel wurde das Mausmodell der sauerstoffinduzierten Retinopathie verwendet.

Intravitreale Injektionen wurden am postnatalen Tag 12 durchgeführt, um die Wirksamkeit eines Medikaments als Antiangiogen zu bestimmen. Mäuse, denen Vehikel injiziert wurden, wurden als Kontrolle eingesetzt. Die avaskulären Bereiche sind definiert als die Zonen, denen retinale Blutgefäße fehlen.

Aus den aufgenommenen Bildern können avaskuläre Flächen quantifiziert werden, da die Summe der Regionen ohne Gefäße die Gesamtfläche der Netzhaut dividiert. Bereiche mit mechanischen Beschädigungen zeigen auch das Fehlen von Schiffen. Um beschädigte Bereiche zu identifizieren, analysieren Sie die Integrität neuronaler Schichten mit Hoechst-Färbung.

Neoschiffe sind kleinkalibrige Gefäße, die aus bereits bestehenden Gefäßen des Plexus vaskula superior stammen. Wir berechneten die von Neogefäßbüscheln eingenommene Fläche, indem wir den neovaskulären Bereich der Netzhaut quantifizierten, der von der Gesamtfläche der Netzhaut eingenommen wurde. Da die Form und Größe von Neoschiffen variabel ist, können sie gelegentlich Trümmern und Artefakten ähneln.

Um Neoschiffe zu unterscheiden, überprüfen Sie, ob das Büschel aus einem reifen Gefäß wächst. Für die Analyse der Dilatation haben wir den Hauptgefäßdurchmesser in drei Höhen vor dem ersten Ast gemessen. Forscher müssen eine vorbestimmte Entfernung definieren, um den Gefäßdurchmesser zu messen, um die Variabilität zwischen den Ergebnissen zu reduzieren.

Idealerweise sollte der am weitesten vom Sehnerv entfernte Punkt etwa 300 Mikrometer betragen. Wir schlagen vor, die Analyse durchzuführen und später durchschnittlich mindestens sechs Tiere pro Zustand durchzuführen. In Bezug auf die Tortuosität messen wir die Entfernung, die das Hauptgefäß nach seiner Form zurücklegt, in Bezug auf den geradlinigen Abstand zwischen dem Sehnerv und dem ersten Verzweigungspunkt.

Wie wir im Bild sehen können, gibt es Heterogenität in der Geschmeidigkeit der Hauptgefäße. Um ein repräsentatives Ergebnis zu erhalten, müssen mindestens sechs Mäuse pro Bedingung quantifiziert werden. Die neuesten Parameter, vaskuläre Verzweigung und Dichte, wurden in einem metabolischen Syndrommodell analysiert, das eine nicht-proliferative Retinopathie aufweist.

Für die Messung der Gefäßverzweigung definierten wir den Quantifizierungsbereich, indem wir einen konzentrischen Kreis zeichneten, und dann zählten wir nacheinander die primären Zweige, die aus einem zentralen Hauptgefäß hervorgingen. Aus den aufgenommenen Bildern wurde die Gefäßdichte als die von Gefäßen eingenommene Fläche dividiert durch die Fläche des ROI quantifiziert, die an verschiedenen Stellen in jeder Mikrofotografie positioniert war. Vermeiden Sie die Quantifizierung von Bereichen mit mechanischen Beschädigungen.

Wenn es mehr als zwei Bereiche mit Einstiche gibt, muss die Netzhaut verworfen werden. Zusammenfassend haben wir in diesem Artikel klassische, etablierte und reproduzierbare Techniken gezeigt, um einige der relevantesten Parameter unter Berücksichtigung der klinischen Praxis zu quantifizieren.