Name: Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Lernen Sie die Live-Bildgebung von SARS-CoV-2-Infektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit lumineszenten Reportern. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung viraler Dynamik und die Bewertung therapeutischer Ansätze.

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Wir möchten den Mitgliedern unseres Instituts (Texas Biomedical Research Institute) für ihre Bemühungen danken, unsere Einrichtungen während der COVID-19-Pandemie voll funktionsfähig und sicher zu halten. Wir möchten uns auch bei unserem Institutional Biosafety Committee (IBC) und Spell (IACUC) für die zeiteffiziente Überprüfung unserer Protokolle bedanken. Wir danken Dr. Thomas Moran von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für die Bereitstellung des monoklonalen SARS-CoV-Kreuzreaktiv-1C7C7-Nukleokapsids (N)-Protein-Antikörpers. Die SARS-CoV-2-Forschung im Martinez-Sobrido-Labor wird derzeit durch die NIAID/NIH-Zuschüsse RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 und R43AI165089-01 unterstützt; das Verteidigungsministerium (DoD) gewährt W81XWH2110095 und W81XWH2110103; die San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; das Texas Biomedical Research Institute Forum; das Health Science Center der University of Texas in San Antonio; die San Antonio Medical Foundation; und vom Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), einem NIAID-finanzierten Exzellenzzentrum für Influenza-Forschung und -Reaktion (CEIRR, Vertrag # 75N93021C00014).

Protokolle mit transgenen K18-hACE2-Mäusen wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) des Texas Biomedical Research Institute (TBRI) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Experimente folgen den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats40. Bei der Arbeit mit Mäusen ist die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich.
1. Verwendung von transgenen K18 hACE2-Mäusen
<ol><li>Kaufen und pflegen Sie 4-6 Wochen alte weibliche B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J-Mäuse (K18 hACE2 transgene Mäuse) in einer Tierpflegeeinrichtung der Biosicherheitsstufe (BSL)-2 unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen.<ol>
<li>Nach der Ankunft in den BSL2-Einrichtungen können sich die Tiere 7 Tage lang akklimatisieren und sie für Infektionen und andere experimentelle Verfahren in die BSL-3-Tiereinrichtung bringen.</li>
		<li>Platzieren Sie nach den IACUC-Protokollen 4 Mäuse pro Käfig. Um sicherzustellen, dass das Tier nach einer Infektion der Mäuse mit rSARS-CoV-2 und der In-vivo-Bildgebung verstorben ist, sollten die Tiere mit einer tödlichen Dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg) eingeschläfert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Biologische Sicherheit
HINWEIS: In diesem Manuskript wird rSARS-CoV-2 unter Verwendung der BAC-basierten reverse-genetischen Systeme für den SARS-CoV-2 USA-WA1/2020-Stamm erzeugt, wie zuvor beschrieben37. Alle In-vivo-Verfahren mit rSARS-CoV-2/Nluc- oder rSARS-CoV-2/Venus-Infektionen müssen in einer biologischen Sicherheitswerkbank unter BSL-3-Bedingungen durchgeführt werden.
<ol><li>Reinigen Sie die Biosicherheitskabine nacheinander mit 2% Wexizid und 70% Ethanol-Desinfektionsmittel, bevor und nachdem Sie alle in diesem Artikel beschriebenen experimentellen Verfahren durchgeführt haben.</li>
	<li>Sterilisieren Sie das gesamte Seziermaterial (Schere, Sezierzange usw.) und den Homogenisator vor und nach jedem Gebrauch.</li>
	<li>Reinigen Sie die Isolierkammer und desinfizieren Sie sie vor und nach jedem Gebrauch mit MB10-Tabletten gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Entsorgen Sie das gesamte biologische Material, das während der Verfahren gemäß den IBC- und IACUC-Richtlinien entstanden ist.</li>
</ol>3. In-vivo-Charakterisierung von rSARS-CoV-2
<ol><li>Maus-Infektionen<ol>
<li>Legen Sie weibliche 4-6 Wochen alte transgene K18 hACE2-Mäuse in markierte Käfige, identifizieren Sie die Mäuse in jedem Käfig mit einem Ohrlochcode und platzieren Sie 4 Mäuse pro Käfig. Verwenden Sie eine Gruppe von Mäusen für Körpergewicht und Überleben und eine andere Gruppe von Tieren für die virale Titration und Bildgebung.</li>
		<li>Rasieren Sie vor der Infektion die Brust der Mäuse auf der Bauchseite von der Brustwarze bis zum Leistenbrustwarzenbereich, um das Biolumineszenzsignal zu erleichtern.</li>
		<li>Bereiten Sie das rSARS-CoV-2-Inokulum mit 105 plaquebildenden Einheiten (PFU)/Maus unter sterilen Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 50 μL mit steriler 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) vor. HINWEIS: Berechnen Sie die Menge an rSARS-CoV-2, die in der viralen Verdünnung verwendet werden soll, mit der Formel: Virus benötigt = (105 PFU pro Maus / 50 μL) x Endvolumen) / Virustiter.</li>
		<li>Halten Sie das Virus-Inokulum auf Eis gekühlt.</li>
		<li>Verwenden Sie die Schein-infizierten (1x PBS) und rSARS-CoV-2/WT-infizierten Mäuse als interne Kontrollen. Legen Sie die Schein-infizierten Mäuse in einen separaten Käfig als rSARS-CoV-2-infizierte Mäuse.</li>
		<li>Betäuben Sie die Mäuse mit 5% Isofluran-Gassedierung in einer Anästhesiekammer und halten Sie sie mit 3% Isofluran aufrecht.</li>
		<li>Sobald die Haltungsreaktion und der Aufrichtungsreflex bestätigt sind, platzieren Sie die Maus in der dorsalen Liegeposition.</li>
		<li>Scrut den Hals der Maus zwischen Zeigefinger und Daumen und halten Sie den Schwanz mit dem kleinen Finger gegen die Handfläche, um das Tier in einer dorsalen Position zu halten.</li>
		<li>Legen Sie die Pipettenspitze mit 50 μL des Virusimpfstoffs in das Nasenloch und stoßen Sie die Lösung langsam aus. Stellen Sie sicher, dass das Virus-Inokulum eingeatmet wird und es keinen Reflux gibt, indem Sie beobachten, wie der Inokulum-Tropfen verschwindet.</li>
	</ol></li>
	<li>Biolumineszenzüberwachung von transgenen Mäusen mit rSARS-CoV-2/Nluc infizierte K18 hACE2-Mäuse (Abbildung 1 und Abbildung 2) HINWEIS: Dieses Experiment folgt der schematischen Darstellung und verwendet die in Abbildung 1 dargestellten Viren. Für das in vivo Bildgebungssystem (IVIS) ist ein Isofluran-Anästhesieaufsatz erforderlich. Einzelheiten zu den erforderlichen Instrumenten und Systemen finden Sie in der Materialtabelle .<ol>
<li>Starten Sie die Bildgebungssoftware und richten Sie die Parameter ein, klicken Sie auf Bildmodus auf Biolumineszenz, öffnen Sie den Filter und stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch ein.</li>
		<li>Legen Sie die Mäuse nach der Initialisierung der IVIS-Maschine in die Isolierkammer, während sie sich noch in der Biosicherheitskabine befinden. Induzieren Sie Mäuse mit Isofluran bei einer Konzentration von 5%. Sobald der Verlust der Haltungsreaktion und des Aufrichtenden Reflexes bestätigt ist, halten Sie mit 3% Isofluran aufrecht.</li>
		<li>Sobald die Mäuse betäubt sind, entfernen Sie sie aus der Isolationskammer und verabreichen Sie retro-orbital das 1:10 in 1x PBS (Endvolumen 100 μL / Maus) verdünnte Luciferase-Substrat mit einer 25-G-Nadel.</li>
		<li>Nach der Verabreichung des Luciferase-Substrats legen Sie die Mäuse mit nach oben gerichteter Brust und Nasenhöhle in den Verteilerkegel zurück, um das Tier während des bildgebenden Verfahrens betäubt zu halten.</li>
		<li>Übertragen Sie die Isolierkammer auf die IVIS-Maschine, und wählen Sie nach dem Schließen der IVIS-Imager-Tür sofort im zu initialisierenden Softwareprogramm die Option Erfassen (Abbildung 2A).</li>
		<li>Um die aufgenommenen Biolumineszenzbilder zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool (Region of Interest) in der Software, um das genaue Signal zu bestimmen und den Fluss zu messen (Abbildung 2B).</li>
		<li>Klicken Sie auf Messen und lassen Sie das System mit der Bewertung der Biolumineszenz in Photonen beginnen, um die absolute Photonenemission zu liefern, die mit den Ausgangsmessungen der verschiedenen Parameter vergleichbar ist.</li>
		<li>Zeigen Sie Mäuse 1-, 2-, 4- und 6-Tage nach der Infektion.</li>
		<li>Nach der Bildgebung die Mäuse zurück in den Käfig legen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluoreszenzanalyse bei transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Venus infiziert sind (Abbildung 3 und Abbildung 4) HINWEIS: Dieses Experiment folgt der schematischen Darstellung und rSARS-CoV-2 in Abbildung 3. Einzelheiten zu den erforderlichen Instrumenten und Systemen finden Sie in der Materialtabelle .<ol>
<li>Starten Sie die Bildgebungssoftware und richten Sie die Parameter ein, stellen Sie die Anregungs- (500 nm) und Emissionsfilter (530 nm) ein, klicken Sie auf den Bildmodus auf Fluoreszenz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein.</li>
		<li>Intraperitoneales Einschläfern der Mäuse mit einer tödlichen Dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg). Nach der Euthanasie die Einschneidestelle mit 70% Ethanol desinfizieren.</li>
		<li>Ziehen Sie mit einer Pinzette die Haut, machen Sie einen Schnitt vom Brustbein zum Bauch und schneiden Sie den Schnitt von den Seiten mit einer Schere. Schneiden Sie die Lebervene ab, um die Blutmenge in der Lunge zu minimieren und hohe Hintergrundsignale während der Bildgebung zu vermeiden.</li>
		<li>Schneiden Sie mit einer Schere das Brustbein ab und öffnen Sie den Brustkorb. Als nächstes schneiden Sie das Ende der Luftröhre mit einer Schere ab und entfernen Sie die Lunge mit einer Pinzette.</li>
		<li>Legen Sie die ausgeschnittenen Lungen in eine 6-Well-Platte, die 2 ml 1x PBS enthält, und spülen Sie sie ab, um überschüssiges Blut zu entfernen. Minimieren Sie die Möglichkeit einer Kontamination zwischen den Proben, indem Sie chirurgische Werkzeuge zwischen den Proben mit 70% Ethanol desinfizieren und reinigen.</li>
		<li>Nachdem Sie das IVIS-Gerät initialisiert haben, legen Sie die Lungen in ein schwarzes Tablett und trennen Sie die Gewebe voneinander.</li>
		<li>Legen Sie das Tablett in die Isolierkammer innerhalb der Biosicherheitskabine und übertragen Sie dann die Isolierkammer in das IVIS. Schließen Sie die Tür und klicken Sie auf Erfassen , um das Bildgebungssystem zu starten (Abbildung 4A).</li>
		<li>Um die Fluoreszenz zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool und zeichnen Sie ROIs um jede der einzelnen Lungen. Messen Sie jeden ROI manuell und verwenden Sie dann die angegebenen durchschnittlichen Strahlungseffizienzwerte und subtrahieren Sie von denen der Schein-infizierten Mäuse (Abbildung 4B).</li>
		<li>Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie das Gewebe auf Eis für die Analyse am selben Tag oder in eine Kryotube zum Einfrieren von Trockeneis, um es bei -80 ° C für die spätere Verarbeitung zu lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Lungenhellfeldbildgebung und Pathologie-Scoring von transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert sind (Abbildung 2A-C) und rSARS-CoV-2/Venus (Abbildung 4A-C)<ol>
<li>Nach der Bildgebung der Biolumineszenz von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT infiziert und simuliert infiziert sind, bringen die Mäuse in ihre Käfige zurück. Fahren Sie mit der Euthanasie und der ex vivo Hellfeldbildgebung von Mäuselungen fort (Abbildung 2A).</li>
		<li>Nach der Ex-vivo-Fluoreszenz der Lunge infizierter Mäuse werden Hellfeldbilder der Lunge aufgenommen (Abbildung 4A).</li>
		<li>Analysieren Sie die groben Läsionen auf der Oberfläche der Lunge mit ImageJ (Abbildungen 2C und 4C).</li>
		<li>Öffnen Sie das Lungenbild, das analysiert werden soll, in ImageJ.</li>
		<li>Berechnen Sie das Verhältnis von Pixel zu cm, verwenden Sie das Geraden-Werkzeug und messen Sie die tatsächliche Länge des Bildes.</li>
		<li>Klicken Sie nach der Auswahl auf Analyze > Measure , um die Länge der Pixel für die Länge zu berechnen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Analyse > Skalierung festlegen und geben Sie die aus dem vorherigen Schritt berechneten Zahlen ein.</li>
		<li>Verwenden Sie das Freehand-Auswahlwerkzeug und wählen Sie die gesamte Lungenoberfläche aus. Klicken Sie auf Analysieren > Messen , um die gesamte Lungenfläche zu messen.</li>
		<li>Klicken Sie auf > Auswahl bearbeiten > Machen Sie Invers , um den Rest des Lungenbereichs auszuwählen, und drücken Sie dann die Entf- oder Rücktaste, um den Hintergrund zu entfernen.</li>
		<li>Entfernen Sie den ausgewählten Bereich und klicken Sie dann auf Bild > > Farbschwelle anpassen.</li>
		<li>Um den pathologischen Läsionsbereich auszuwählen, passen Sie die Helligkeit auf ein Minimum (zwischen 1 und 50) und ein Maximum (zwischen 50 und 200) an, abhängig von den vorhandenen Stau- und Blutungsgraden.</li>
		<li>Sobald pathologische Läsionen ausgewählt sind, klicken Sie unten im Schwellenwertfarbfeld auf Auswählen und dann auf Analysieren > Messen , um pathologische Bereiche zu messen.</li>
		<li>Berechnen Sie den Prozentsatz der groben Läsionen mit der Formel: % der pathologischen Fläche = (Messung der pathologischen Fläche/Gesamtlungenoberfläche) x 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Virale Titrationen (Abbildung 2D und Abbildung 4D)<ol>
<li>Schließen Sie bei der Bildgebung die Euthanasie der Mäuse ab und sammeln Sie Lunge, Gehirn und Nasenschleimhaut.</li>
		<li>Legen Sie die Lunge, das Gehirn und die Nasenschleimhaut in separate sterile Gewebehomogenisatoren und fügen Sie 1 ml kaltes 1x PBS hinzu.</li>
		<li>Homogenisieren Sie die Proben durch Zentrifugieren bei 21.500 x g für 10 Minuten, um Zellablagerungen zu pelletieren. Sammeln und übertragen Sie die Überstände in ein neues steriles Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.</li>
		<li>Wenn am selben Tag virale Titrationen durchgeführt werden, lagern Sie die Überstände bei 4 ° C. Alternativ wird der Überstand der homogenisierten Proben bei -80 °C eingefroren, bis er später ausgewertet wird.</li>
		<li>Unter Verwendung der aus den Gewebehomogenaten erhaltenen Überstände werden 10-fache serielle Verdünnungen durchgeführt und konfluente Monoschichten von Vero E6-Zellen mit 1 ml jeder Verdünnung des Überstands infiziert (6-Well-Plattenformat, 1,2 × 106 Zellen / Well, Verdreifachungen).</li>
		<li>Das Virus 1 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Inkubator adsorbieren lassen.</li>
		<li>Nach der viralen Adsorption die Zellen mit 1 ml 1x PBS waschen und in 2 ml Postinfektionsmedien mit 1% Agar im befeuchteten 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C für 72 h inkubieren.</li>
		<li>Nach der Inkubation die Platten in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 h bei 4 °C inaktivieren, stellen Sie sicher, dass die gesamte Platte untergetaucht ist.</li>
		<li>Nehmen Sie Platten aus BSL3 und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml 1x PBS und permeabilisieren Sie mit 1 ml 0,5% Triton X-100 für 10 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Blockieren Sie die Zellen mit 1 ml 2,5% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS für 1 h bei 37 °C, gefolgt von einer Inkubation in 1 ml von 1 μg/ml des SARS-CoV-Nukleokapsids (N)-Protein-kreuzreaktiven monoklonalen Antikörpers (1C7C7), verdünnt in 2,5% BSA für 1 h bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml 1x PBS und entwickeln Sie die Plaques mit dem ABC-Kit und dem DAB-Peroxidase-Substrat-Kit gemäß den Anweisungen der Hersteller.</li>
		<li>Berechnen Sie die viralen Titer als PFU/ml. HINWEIS: Berechnen Sie mit der Formel PFU/mL = Verdünnungsfaktor x Anzahl der Plaques x (1 ml/Inokulumvolumen).</li>
	</ol></li>
	<li>Nluc-Aktivität in Geweben von transgenen K18-hACE2-Mäusen, die mit rSARS-CoV-2/Nluc infiziert sind (Abbildung 2E)<ol>
<li>Quantifizierung des Vorhandenseins von Nluc in den Organhomogenaten aus Schein-, rSARS-CoV-2/WT- und rSARS-CoV-2/Nluc-infizierten transgenen K18 hACE2-Mäusen unter Verwendung eines Luciferase-Assays gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewertung von Morbidität und Mortalität (Abbildung 2F, G und Abbildung 4E, F)<ol>
<li>Intranasal infizieren 4-6 Wochen alte weibliche transgene K18 hACE2-Mäuse mit 105 PFU von rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc oder Scheininfektionen, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben.</li>
		<li>Überwachen und wiegen Sie die Mäuse über 12 Tage gleichzeitig, um die Gewichtsschwankungen aufgrund der Nahrungsaufnahme zu minimieren. Euthanasieren Sie die Mäuse, die 25% ihres anfänglichen Körpergewichts verlieren, seit sie einen humanen Endpunkt erreicht haben, und beachten Sie, dass diese Mäuse einer Virusinfektion erliegen.</li>
		<li>Euthanasieren Sie nach 12 Tagen die Mäuse, die eine Virusinfektion überleben, und berechnen Sie den Prozentsatz der Körpergewichtsänderung und des Überlebens.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+biology+and+replication%3A+implications+for+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).</li>
<li>Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus-2+%28SARS-CoV-2%29%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update.</a> Cureus. 12 (3), 7423(2020).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+genetic+recombination%2C+and+pathogenesis+of+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses.</a> Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).</li>
<li>Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+pathogenic+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of pathogenic coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characterisation+and+epidemiology+of+2019+novel+coronavirus%3A+implications+for+virus+origins+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding.</a> Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).</li>
<li>Evans, J. P., Liu, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+host+factors+in+SARS-CoV-2+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of host factors in SARS-CoV-2 entry.</a> Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).</li>
<li>Petersen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+SARS-CoV-2+with+SARS-CoV+and+influenza+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).</li>
<li>Alfaraj, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+predictors+of+mortality+of+Middle+East+Respiratory+Syndrome+Coronavirus+%28MERS-CoV%29+infection%3A+A+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Travel+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study.</a> Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).</li>
<li>Harvey, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+variants%2C+spike+mutations+and+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).</li>
<li>Dong, E., Du, H., Gardner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+web-based+dashboard+to+track+COVID-19+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time.</a> Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).</li>
<li>Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARS-CoV-2+%28COVID-19%29+by+the+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers.</a> Elife. 9, 57309(2020).</li>
<li>Roussel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+fear+versus+data%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: fear versus data.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).</li>
<li>Scialo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+One+year+in+the+pandemic.+What+have+we+learned%2C+the+new+vaccine+era+and+the+threat+of+SARS-CoV-2+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants.</a> Biomedicines. 9 (6), 611(2021).</li>
<li>Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19</a> (2021).</li>
<li>Dougan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bamlanivimab+plus+Etesevimab+in+Mild+or+Moderate+Covid-19%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19.</a> New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID+antibody+treatments+show+promise+for+preventing+severe+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease.</a> Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).</li>
<li>Tuccori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+preclinical+discovery+and+development+of+bamlanivimab+for+the+treatment+of+novel+coronavirus+infection+%28COVID-19%29%3A+reasons+for+limited+clinical+use+and+lessons+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).</li>
<li>Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+inpatient+administration+of+casirivimab+and+imdevimab+antibody+cocktail+for+the+treatment+of+COVID-19+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia.</a> Cureus. 13 (5), 15280(2021).</li>
<li>O'Brien, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+REGEN-COV+antibody+combination+in+early+SARS-CoV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection.</a> medRxiv. , (2021).</li>
<li>Beigel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remdesivir+for+the+treatment+of+Covid-19+-+Final+report%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report.</a> New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+convalescent+plasma+therapy+on+time+to+clinical+improvement+in+patients+with+severe+and+life-threatening+COVID-19%3A+A+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial.</a> Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).</li>
<li>Polack, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+the+BNT162b2+mRNA+Covid-19+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine.</a> New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+February+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+and+bioluminescent+bireporter+Influenza+A+Virus+to+evaluate+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections.</a> Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).</li>
<li>Nogales, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+fluorescent-expressing+influenza+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus.</a> Virus Research. 213, 69-81 (2016).</li>
<li>Welsh, D. K., Noguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular bioluminescence imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).</li>
<li>Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+real-time+in+vivo+imaging+of+an+influenza+reporter+virus+reveals+dynamics+of+replication+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread.</a> Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).</li>
<li>Schoggins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+reporter+viruses+reveal+viral+dynamics+in+interferon+receptor-deficient+mice+and+sensitivity+to+interferon+effectors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).</li>
<li>Luker, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+of+herpes+simplex+virus+type+1+infection+and+therapy+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice.</a> Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid+antiviral+screening+assay+based+on+eGFP+reporter+virus+of+Mayaro+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus.</a> Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).</li>
<li>Kirui, J., Freed, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+validation+of+a+highly+sensitive+bioluminescent+HIV-1+reporter+vector+that+simplifies+measurement+of+virus+release%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release.</a> Retrovirology. 17 (1), 12(2020).</li>
<li>Shang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+eGFP+enterovirus+71+for+antiviral+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening.</a> Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).</li>
<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+SARS-CoV-2+from+a+single+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome.</a> mBio. 11 (5), 02168(2020).</li>
<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen, finanziellen und nicht-finanziellen oder persönlichen Interessenkonflikten in Bezug auf die beschriebene Arbeit durchgeführt wurde.

Dieses Protokoll demonstriert die Machbarkeit der Verwendung dieser rSARS-CoV-2-exprimierenden Reportergene zur Überwachung von Virusinfektionen in vivo. Beide Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo. Die beschriebenen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) und in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) Bildgebungssysteme stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Dynamik der SARS-CoV-2-Infektion, der viralen Patho...

Das Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein umhülltes, positiv-sense, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Betacoronavirus-Linie in der Familie der Coronaviridae 1 gehört. Diese virale Familie ist in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronavirus1 unterteilt. Alpha- und Betacoronaviren infizieren hauptsächlich Säugetiere, während Gamma- und Deltacoronaviren fast ausschließlich Vögel infizieren2. Bisher haben sieben Coronaviren (CoV) Artenbarrieren überschritten und sind als humane Coronaviren (HCoV) entstanden: zwei Alpha-CoVs (HCoV-229E und HCoV-NL63) und fünf Beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Middle East respiratory syndrome coronavirus [MERS-CoV] und SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV und SARS-CoV-2 sind hochpathogen und verursachen eine schwere Infektion der unteren Atemwege7. Vor der Entstehung von SARS-CoV-2 gab es zwei durch CoVs verursachte epidemische Ausbrüche: SARS-CoV in Guangdong Providence, China, von 2002-2003, mit einer Todesfallrate (CFR) von etwa 9,7%; und MERS-CoV im Nahen Osten von 2012 bis heute, mit einem CFR von etwa 34%7,8. SARS-CoV-2 hat einen Gesamt-CFR zwischen 3,4% und 49%, wobei die zugrunde liegenden Bedingungen zu einem höheren CFRvon 8,9 beitragen. Seit seiner Entdeckung im Dezember 2019 in Wuhan, China, ist SARS-CoV-2 für über 242 Millionen Infektionen beim Menschen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle bei Menschen weltweitverantwortlich 7,10,11,12. Insbesondere seit Ende 2020 haben neue SARS-CoV-2-Varianten der Besorgnis (VoC) und Varianten von Interesse (VoI) die Virusmerkmale, einschließlich Übertragung und Antigenität 9,13, und die allgemeine Richtung der COVID-19-Pandemie beeinflusst. Für die Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen gibt es derzeit nur eine US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) therapeutisches antivirales (Remdesivir) und ein Emergency Use Authorization (EUA) Medikament (Baricitinib, in Kombination mit Remdesivir zu verabreichen)14. Es gibt auch 6 zugelassene monoklonale EUA-Antikörper: REGEN-COV (Casirivimab und Imdevimab, zusammen verabreicht), Sotrovimab, Tocilizumab und Bamlanivimab und Etesevimab, die zusammenverabreicht werden 15,16,17,18,19. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen prophylaktischen Impfstoff, Pfizer-BioNTech, und zwei weitere prophylaktische Impfstoffe (Moderna und Janssen) wurdenvon der EUA zugelassen 20,21,22,23,24. Mit der unkontrollierten Infektionsrate und dem Aufkommen von VoC und VoI stellt SARS-CoV-2 jedoch immer noch eine Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar. Daher sind dringend neue Ansätze erforderlich, um effiziente Prophylaxe- und Therapeutika zur Kontrolle der SARS-CoV-2-Infektion und der noch anhaltenden COVID-19-Pandemie zu identifizieren.
Die Untersuchung von SARS-CoV-2 erfordert aufwändige Techniken und sekundäre Ansätze, um das Vorhandensein des Virus in infizierten Zellen und/oder validierten Tiermodellen der Infektion zu identifizieren. Die Verwendung der umgekehrten Genetik hat es ermöglicht, rekombinante Viren zu erzeugen, um wichtige Fragen in der Biologie von Virusinfektionen zu beantworten. Zum Beispiel haben Techniken der umgekehrten Genetik Mittel zur Verfügung gestellt, um die Mechanismen von Virusinfektionen, Pathogenese und Krankheiten aufzudecken und zu verstehen. Ebenso haben Ansätze der Reverse Genetik den Weg geebnet, rekombinante Viren ohne virale Proteine zu entwickeln, um ihren Beitrag zur viralen Pathogenese zu verstehen. Darüber hinaus wurden Techniken der Umkehrgenetik eingesetzt, um rekombinante Viren zu erzeugen, die Reportergene für In-vitro- und In-vivo-Anwendungen exprimieren, einschließlich der Identifizierung prophylaktischer und/oder therapeutischer Ansätze zur Behandlung von Virusinfektionen. Fluoreszierende und biolumineszierende Proteine sind aufgrund ihrer Empfindlichkeit, Stabilität und einfachen Detektion aufgrund der Verbesserung neuer Technologien die am häufigsten verwendeten Reportergene25,26. In vitro hat sich gezeigt, dass fluoreszierende Proteine als bessere Option für die Lokalisierung von Viren in infizierten Zellen dienen, während Luciferasen für Quantifizierungsstudien bequemer sind27,28,29. In vivo werden Luciferasen gegenüber fluoreszierenden Proteinen für die Bildgebung ganzer Tiere bevorzugt, während fluoreszierende Proteine für die Identifizierung infizierter Zellen oder Ex-vivo-Bildgebung 30,31,32 bevorzugt werden. Die Verwendung von Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren hat in vielen Familien als leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Viren gedient, darunter Flaviviren, Enteroviren, Alphaviren, Lentiviren, Arenaviren und Influenzaviren 28,33,34,35,36.
Um den Bedarf an sekundären Ansätzen zur Untersuchung von SARS-CoV-2 und zur Charakterisierung der Echtzeit-SARS-CoV-2-Infektion in vivo zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2-Proteine erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine unter Verwendung unserer zuvor beschriebenen bakteriellen künstlichen Chromosomen (BAC) -basierten umgekehrten Genetik exprimieren, die als eine einzige Kopie in E. coli beibehalten werden. um die Toxizität von Virussequenzen während ihrer Ausbreitung in Bakterienzu minimieren 37,38. Insbesondere rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigten in vivo eine rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität. Die hohe Venusexpression von rSARS-CoV-2/Venus ermöglichte den Nachweis einer Virusinfektion in der Lunge infizierter transgener K18 hACE2-Mäuse mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS)39. Die Spiegel der Venusexpression korrelierten gut mit viralen Titern, die in der Lunge nachgewiesen wurden, was die Machbarkeit der Verwendung der Venusexpression als gültiger Ersatz der SARS-CoV-2-Infektion zeigt. Mit rSARS-CoV-2/Nluc konnten wir die Dynamik der Virusinfektion in Echtzeit verfolgen und die SARS-CoV-2-Infektion in vivo mit dem gleichen IVIS-Ansatz bei transgenen K18-hACE2-Mäusen longitudinal bewerten.

<table><tbody><tr><td>0,5 % Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Bei Raumtemperatur lagern (RT)</td></tr><tr><td>1 % DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10 % Formalinlösung, neutral gepuffert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>5% Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Epithelzellen der afrikanischen grünen Affenniere (Vero E6)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura Imaging Software 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td>Bildanalyse-Software</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Lagern bei 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Bei 4 > lagern; C</td></tr><tr><td>Anästhesiegasgerät</td><td>Veterinäranästhesiesysteme, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18-hACE2-Mäuse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Version 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>MARS Data Analysis Software</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 Tabletten</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay Reagenz</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Dieses Reagenz wird zur Messung der Nluc-Aktivität verwendet. Bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well-Mikrotiterplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well-Mikrotiterplatten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution Homogenisator</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Weichgewebe-Homogenisierung CK14 &ndash; 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4002 ABC-Kit</td><td>und DAB-Peroxidase-Substrat-Kit</td></tr></tbody></table>

live-bildgebung und quantifizierung von virusinfektionen in transgenen k18-hace2-mäusen mit reporter-exprimierendem rekombinantem sars-cov-2

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie wurde durch das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht. Bis heute war SARS-CoV-2 weltweit für über 242 Millionen Infektionen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle verantwortlich. Ähnlich wie bei anderen Viren erfordert die Untersuchung von SARS-CoV-2 die Verwendung experimenteller Methoden, um das Vorhandensein von Viren in infizierten Zellen und / oder in Tiermodellen nachzuweisen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2 erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine exprimiert. Diese Reporter-exprimierenden rSARS-CoV-2 ermöglichen die Verfolgung von Virusinfektionen in vitro und in vivo basierend auf der Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen. Hier beschreibt die Studie die Verwendung von rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zum Nachweis und zur Verfolgung einer SARS-CoV-2-Infektion im zuvor beschriebenen transgenen K18-Modell der Infektion mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) unter Verwendung von In-vivo-Bildgebungssystemen (IVIS). Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigen rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität und virale Replikation in vivo. Wichtig ist, dass die Nluc- und Venusexpression es uns ermöglicht, Virusinfektionen in vivo und ex vivo bei infizierten Mäusen direkt zu verfolgen. Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Biologie von SARS-CoV-2 in vivo zu untersuchen, Virusinfektionen und assoziierte COVID-19-Erkrankungen zu verstehen und wirksame prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen zur Bekämpfung der SARS-CoV-2-Infektion zu identifizieren.

rSARS-CoV-2/Nluc-Infektion in transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abbildungen 1 und 2) Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten), das zur Beurteilung von Infektionen in vivo verwendet wird. Abbildung 1B zeigt das schematische Flussdiagramm, das zur Bewertung der rSARS-CoV-2/Nluc-Infektionsdynamik in transgenen K18-hACE2-Mäusen angewe...

Dieses Protokoll beschreibt die Dynamik von Virusinfektionen unter Verwendung von Luciferase- und Fluoreszenz-exprimierenden rekombinanten (r)SARS-CoV-2 und einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS) in transgenen K18 hACE2-Mäusen, um den Bedarf an sekundären Ansätzen zu überwinden, die zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo erforderlich sind.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Unser Protokoll beschrieb die Verwendung von fluoreszierendem oder lumineszierend exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2 für die In-vivo- und Ex-vivo-Live-Bildgebung und das virale Tracking im transgenen K18-ACE2-Mausmodell der SARS-CoV-2-Infektion. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anwendung und Durchführbarkeit des viralen Nachweises und Trackings für In-vivo- und Ex-vivo-Studien von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der transgenen ACE2-Maus. Die Verwendung der In-vivo-Bildgebung von SARS-CoV-2 im transgenen K18-Modell der humanen ACE2-Maus stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Therapeutika zur Behandlung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo zu evaluieren.Die Implementierung von Reportern SARS-CoV-2 stellt eine ausgezeichnete Option dar, um Pathogenität, Virusreplikation und Trophismus in vivo zu bewerten. Für In-vivo-Studien mit Luciferase, die SARS-CoV-2 exprimieren, wird empfohlen, die Mäuse zu rasieren und nach der Substratinjektion eine sofortige Bildgebung durchzuführen, um das Biolumineszenzsignal zu verbessern. Beginnen Sie mit der Biolumineszenzüberwachung, indem Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) initiieren und die Parameter einrichten, klicken Sie auf den Bildmodus auf Biolumineszenz, öffnen Sie dann den Filter und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto.Als nächstes entfernen Sie eine bereits rasierte und betäubte Maus aus der Isolationskammer und verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel, um 100 Mikroliter des 1 bis 10 in PBS verdünnten Luciferase-Substrats retro-orbital auf die Maus zu verabreichen. Legen Sie dann die Maus zurück in die Isolierkammer, übertragen Sie die Isolationskammer an die IVIS-Maschine, die mit einer Heizkomponente ausgestattet ist, um Unterkühlung zu verhindern, und schließen Sie die IVIS-Imager-Tür, um die Bildgebung zu initialisieren, indem Sie im Softwareprogramm Acquire auswählen. Um die aufgenommenen Biolumineszenzbilder zu analysieren, verwenden Sie das ROI- oder Region of Interest-Tool in der Software, um das genaue Signal zu bestimmen und den Fluss zu messen.Starten Sie die Imaging-Software und richten Sie die Parameter ein. Klicken Sie im Bildmodus auf Fluoreszenz, stellen Sie die Anregung auf 500 Nanometer und die Emissionsfilter auf 530 Nanometer ein und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Führen Sie Nektroskopie durch und entfernen Sie Lungen von Mäusen.Legen Sie die ausgeschnittenen Lungen in eine 6-Well-Platte, die zwei Milliliter 1X PBS enthält, und spülen Sie sie ab, um überschüssiges Blut zu entfernen. Desinfizieren und reinigen Sie chirurgische Werkzeuge zwischen den Proben mit 70% Ethanol. Nachdem Sie das IVIS-Gerät initialisiert haben, legen Sie die Lungen auf ein schwarzes Blatt und trennen Sie die Gewebe voneinander.Legen Sie dann das Tablett in die Isolierkammer in der Biosicherheitskabine und übergeben Sie dann die Isolierkammer in das IVIS. Schließen Sie die Tür des IVIS-Imagers und klicken Sie auf Erfassen, um das Bildgebungssystem zu starten. Um die Fluoreszenz zu analysieren, verwenden Sie das ROI-Tool und zeichnen Sie ROIs um jede der einzelnen Lungen.Messen Sie jeden ROI manuell und verwenden Sie dann die angegebenen durchschnittlichen Strahlungseffizienzwerte und subtrahieren Sie von den Schein-infizierten Mäusen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, legen Sie das Gewebe in eine Kryotube, um das Trockeneis einzufrieren, um es bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verarbeitung zu lagern. Unter Verwendung des aus den Gewebehomogenaten erhaltenen Supernats führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung durch und infizieren konfluierende Monoschichten von Vero E6-Zellen mit einem Milliliter jeder überstehenden Verdünnung in Verdreifachungen.Lassen Sie das Virus eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator adsorbieren. Sobald dies erledigt ist, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter 1X PBS und inkubieren Sie die Zellen dann in zwei Millilitern Postinfektionsmedien mit 1% Agar im befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für 72 Stunden. Nach der Inkubation inaktivieren Sie die Platten in 10% neutralem gepuffertem Formalin für 24 Stunden bei vier Grad Celsius, um sicherzustellen, dass die gesamte Platte untergetaucht ist.Nehmen Sie die Platten aus der Biosicherheitsstufe drei und waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes blockieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einem Milliliter 2,5 Rinderserumalbumin oder BSA und PBS für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation in einem Milliliter von einem Mikrogramm pro Milliliter des SARS-CoV-Nukleokapsidproteins kreuzreaktiver monoklonaler Antikörper 1C7C7, der in 2,5 BSA für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdünnt wurde. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter 1X PBS und entwickeln Sie die Plaques mit den ABC- und Diaminobenzol- oder DAB-Peroxidase-Substrat-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers und berechnen Sie dann die viralen Titer als plaquebildende Einheiten pro Milliliter.In der Studie wurde beobachtet, dass die biolumineszente Nanoluciferase oder Nluc leicht nachgewiesen wurde und Mäuse mit dem rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, aber nicht diejenigen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Mock infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten die Nluc-Intensität an verschiedenen Tagen nach der Infektion. Die groben Läsionen auf der Lungenoberfläche von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Nluc infiziert waren, waren vergleichbar mit denen in der rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Gruppe.Darüber hinaus wurden virale Titer nachgewiesen und die rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäuse waren vergleichbar mit denen, die an verschiedenen Tagen nach der Infektion mit dem rSARS-CoV-2-Wildtyp in allen Organen infiziert waren. Gleichzeitig wurde die Nluc-Aktivität nur in den Organen von rSARS-CoV-2 Nluc-infizierten Mäusen nachgewiesen. Eine separate Gruppe von Schein- und Virus-infizierten Mäusen wurde 12 Tage lang auf Veränderungen des Körpergewichts und des Überlebens überwacht.Mäuse, die mit rSARS-CoV-2 Nluc und rSARS-CoV-2 Wild-Typ infiziert sind, verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und alle erliegen zwischen sieben und acht Tagen nach der Infektion einer Virusinfektion. Nach einer rSARS-CoV-2-Venusinfektion wurde die Venusexpression in allen Lungen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, leicht nachgewiesen, aber nicht von solchen, die mit rSARS-CoV-2 Wildtyp oder Scheininfektion infiziert waren. Die quantitativen Analysen zeigten, dass die Intensität der Venus zwei Tage nach der Infektion ihren Höhepunkt erreicht und im Verlauf der Infektion und der Lunge infizierter Mäuse abnimmt.Bilder der Lungenoberfläche zeigten, dass grobe Läsionen von Mäusen, die mit rSARS-CoV-2 Venus infiziert waren, mit denen von rSARS-CoV-2-Wildtyp-infizierten Mäusen vergleichbar waren. Auch die Infektion mit rSARS-CoV-2 Venus führte zu vergleichbaren viralen Titern wie bei Mäusen, die in allen Organen mit dem Wildtyp rSARS-CoV-2 infiziert waren. Die mit rSARS-CoV-2 Venus und rSARS-CoV-2 Wildtyp infizierten Mäuse verloren bis zu 25% ihres Körpergewichts und erlagen am neunten Tag nach der Infektion einer Virusinfektion ohne Überleben.Die Ergebnisse von Reportern, die SARS-CoV-2 exprimieren, haben sich als gültige Surrogate einer Virusinfektion erwiesen. Dies könnte somit zu einer schnellen Identifizierung und Bewertung von Gegenmaßnahmen zur Behandlung der SARS-CoV-2-Infektion führen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Dieses Video demonstriert eine Methode zur Verfolgung von Virusinfektionen in Mausmodellen mit einem rekombinanten Luciferase- und Fluoreszenzprotein-exprimierenden bi-Reporter-Influenza-A-Virus. Diese Methode ermöglicht sowohl in vivo- als auch ex vivo-Studien, die es den Forschern ermöglichen, Einblicke in die virale Dynamik und die Auswirkungen von Interventionen zu gewinnen.

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Dieses Video demonstriert die Anwendung der Hybridisierungskettenreaktion (HCR)-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von subgenomischer SARS-CoV-2-RNA. Die Kombination von HCR mit Immunfluoreszenztechniken hat das Potenzial, Einblicke in Wirt-Virus-Interaktionen auf Einzelzellebene zu geben.

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Influenza-A-Viren (IAVs) sind ansteckende Atemwegserreger, die jährliche Epidemien und gelegentliche Pandemien verursachen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Verfolgung viraler Infektionen in vivo mit einer neuartigen rekombinanten Luziferase und fluoreszenz-exzierenden Bi-Reporter IAV (BIRFLU). Dieser Ansatz bietet Forschern ein ausgezeichnetes Werkzeug, um IAV in vivo zu studieren.

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Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Das hier beschriebene Protokoll skizziert eine schnelle und effektive Methode zur Messung neutralisierender Antikörper gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein, indem die Fähigkeit rekonvaleszenter Serumproben bewertet wird, die Infektion durch ein verbessertes grün fluoreszierendes proteinmarkiertes vesikuläres Stomatitisvirus zu hemmen, das mit Spike-Glykoprotein pseudotypisiert ist.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

Im Folgenden stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Injektion von seitlichen Schwanzvenen aus der Maus zur systemischen Verabreichung von Adeno-assoziierten Viren (AAV) bei adulten Mäusen vor. Darüber hinaus beschreiben wir Protokolle von häufig verwendeten Assays zur Beurteilung der AAV-Transduktion.

Konsistente Verabreichung des Adeno-assoziierten Virus durch laterale Schwanzveneninjektion bei erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die Live-Bildgebung von SARS-CoV-2-Infektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit lumineszenten Reportern. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung viraler Dynamik und die Bewertung therapeutischer Ansätze.

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2 (Video) | JoVE Journal

Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2

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