Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Die Untersuchung des Outputs der Immunsynapse beschränkte sich meist auf mikroskopische Methoden. BSLBs haben unser Repertoire an Werkzeugen erweitert, mit denen die Ausgabe von T-Zell-Immunsynapsen untersucht werden kann, einschließlich Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Proteomik und RNA-Sequenzierungstechnologien. Als solche können BSLBs in einer Vielzahl von immunologischen Fragen und bei der Identifizierung der Zusammensetzung und biochemischen Regulation des T-Zell-Outputs verwendet werden.

Dazu gehören beispielsweise die Untersuchung chimärer Antigenrezeptoren, Medikamente, die bestimmte Signalwege hemmen, oder die genetische Ablation von Interessanten. Einer der kritischsten Aspekte dieses Protokolls ist die Optimierung der Proteinkalibrierungen und des mehrfarbigen Durchflusszytometrie-Panels, die für die Verfolgung des transsynaptischen Partikels von Interesse erforderlich sind. Dies erfordert die systematische Iteration von Proteinkonzentrationen, Antikörperkonzentrationen und Instrumenteneinstellungen.

Beginnen Sie mit der Verdünnung eines Mikroliters Perlenlösung mit 1.000 Mikroliter PBS. Zählen Sie die Kügelchen mit einer Hämozytometerkammer und berechnen Sie ihre Konzentration pro Milliliter. Berechnen Sie dann das Volumen der Silica-Perlen, die für 500.000 endgültige BSLBs pro Titrationspunkt benötigt werden.

Übertragen Sie das erforderliche Volumen an Silica-Kügelchen in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Silica-Perlen dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS und zentrifugieren Sie die Perlen. Bereiten Sie drei Bände Liposomen-Master-Mix vor, die einen letzten 12,5-Mol-Prozentsatz nickelhaltiger Phospholipide enthalten.

Verwenden Sie die Liposomen-Mastermischung, um die gewaschenen Silica-Perlen wieder zu versenken. Mischen Sie es dann vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Gesamtvolumens nach oben und unten pipettieren. Fügen Sie dem Röhrchen mit einer sterilen Technik Argon- oder Stickstoffgas hinzu, um die Luft zu verdrängen und die Lipide während des Mischens vor Oxidation zu schützen.

Argon zu den 0,4-millimolaren Lipidvorräten hinzufügen. Lagern Sie die Brühe und manipulieren Sie sie mit einer sterilen Technik. Bewegen Sie die BSLBs zum vertikalen Mischer und mischen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Orbitalmischung bei 10 U / min.

Drehen Sie dann die Perlen herunter, indem Sie sie 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur auf einer Tisch-Minizentrifuge zentrifugieren. Blockieren Sie die gebildeten BSLBs, indem Sie einen Milliliter 5% BSA mit 100 Mikromol Nickelsulfat hinzufügen, um NTA-Stellen auf den BSLBs zu sättigen. Waschen Sie dreimal mit HBS-HSA-Puffer, um die überschüssige Blockierungslösung zu entfernen.

Nehmen Sie eine neue U-Boden- oder V-Boden-96-Well-Platte und bereiten Sie zweifache serielle Verdünnungen der Proteine vor. Resuspendieren Sie die hergestellten BSLBs in einem Volumen, so dass 100 Mikroliter HBS-HSA-Puffer 500.000 BSLBs enthalten. Nehmen Sie dann eine weitere U-Bottom- oder V-Bottom-96-Well-Platte und übertragen Sie 100 Mikroliter der BSLB-Suspension so in die Wells, dass jede Bohrung 500.000 BSBLs erhält.

Drehen Sie die zweite Platte bei Raumtemperatur für zwei Minuten bei 300x G hinunter.Entsorgen Sie den Überstand und übertragen Sie 100-Mikroliter-Volumen von der Proteintitrationsplatte auf die Platte, die die sedimentierten BSLBs enthält. Mischen Sie vorsichtig, um eine übermäßige Blasenbildung während des Pipettierens zu vermeiden. Verwenden Sie Aluminiumfolie, um es vor Licht zu schützen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 1.000 U / min zu inkubieren.

Waschen Sie dann die Platte dreimal, indem Sie einen HBS-HSA-Puffer auf die Platte geben, und drehen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten bei 300x G herunter.Zählen Sie die Zellen nach dem Waschen. Verdünnen Sie sie dann mit einem synaptischen Transfer-Assay-Medium auf eine Endkonzentration von 2,5 Millionen pro Milliliter. Sobald die BSLBs mit der Proteinmischung beladen sind, waschen Sie die BSLBs zweimal mit HBS-HSA-Puffer, um die überschüssigen ungebundenen Proteine zu entfernen.

Resuspend 500.000 BSLBs pro Vertiefung in 200 Mikroliter HBS-HSA-Puffer. Übertragen Sie 100 Mikroliter BSLBs pro Bohrloch auf eine neue U-Bodenplatte mit 96 Bohrlöchern, um ein Duplikat herzustellen, so dass die endgültige Menge an BSLB pro Bohrloch 250.000 beträgt. Drehen Sie die BSLBs bei 300x G für zwei Minuten bei Raumtemperatur herunter.

Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die BSLBs mit 100 Mikrolitern T-Zell-Suspension. Mischen Sie vorsichtig, um die Bildung von Blasen zu verhindern. Die Co-Kulturen 90 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Schützen Sie die Zellen vor Licht und kühlen Sie die Co-Kulturen ab, indem Sie sie zunächst bei Raumtemperatur für mindestens 15 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie die Co-Kulturen bei Raumtemperatur für fünf Minuten bei 500x G.Entsorgen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Co-Kulturen in Calcium- und Magnesium-Ionen-freiem 2% BSA PBS bei Raumtemperatur zur Blockierung. Legen Sie die Zellen für 45 Minuten auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.

Bereiten Sie die Antikörper-Master-Mischung mit eiskaltem 0,22-Mikrometer-gefiltertem 2% BSA und PBS als Färbepuffer vor. Dieser Master-Mix bietet zusätzliche Blockierung. Drehen Sie die Co-Kulturen bei 500x G für fünf Minuten und vier Grad Celsius herunter.

Verwerfen Sie die Überstände und verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um die Zellen in der Färbemastermischung mit optimierten Antikörperkonzentrationen wieder zu versuspenden. Dazu gehören isotypmarkierte Zellen und BSLBs, fluoreszierende und nicht fluoreszierende BSLBs sowie zellen und BSLBs, die allein gefärbt wurden. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Hälfte des Volumens nach oben und unten pipettieren.

Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis und schützen Sie sie vor Licht. Waschen Sie die Zellen und BSLBs zweimal mit eiskaltem 2% BSA PBS. Drehen Sie sie bei 500x G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius nach unten.

Überprüfen Sie nach der Zentrifugation die auf dem Boden der Vertiefungen sedimentierte Kokultur. Dann resuspendieren Sie die gewaschenen Co-Kulturen in 100 Mikroliter PBS und erwerben Sie sofort. Aktivieren Sie die Log-Skala für seitlich gestreutes Licht und den Time-of-Flight-Parameter für seitlich und vorwärts gestreute Lichter.

Erwerben Sie MESF-Standards, um sicherzustellen, dass sowohl die gedämpfte als auch die hellste Population in den linearen Bereich des Instruments fallen. Erwerben Sie dann Kompensationsproben, berechnen Sie die Kompensation und wenden Sie die Kompensationsmatrix auf das Experiment an. Erwerben und speichern Sie mindestens 20.000 MESF-Standards für jeden Quantifizierungskanal.

Vermeiden Sie die Verwendung von FACS-Mantelflüssigkeit oder ähnlichem wie resuspend MESF-Perlen, da diese Salze und Alkohole enthalten, die die Fluorochrome zerstören, was zu breiteren Fluoreszenzspitzen und hohem Fehler führt. Stellen Sie für die Erfassung mit Hochdurchsatz-Probenehmern die Geräteerfassung auf Standard und die Probenerfassung auf 80 Mikroliter ein. Probendurchflussrate zwischen zwei und drei Mikrolitern pro Sekunde, Probenmischvolumen bei 50 Mikrolitern, Probenmischen von 150 Mikrolitern pro Sekunde und Mischen pro Vertiefung zwischen drei und fünf.

Erwerben Sie mindestens 10.000 einzelne BSLBs pro Probe. Exportieren Sie abschließend die FCS-Dateien. Ein Beispiel für quantitative durchflusszytometrische Messungen von ICAM-1 auf der Oberfläche von Tonsillar-B-Zellen und Helfer-T-Zellen ist hier dargestellt.

Die repräsentativen Bilder beschreiben die Gating-Strategie zur Analyse einzelner CXCR5 B-Zellen und follikulärer Helfer-T-Zellen, die aus menschlichen Gaumenmandeln isoliert wurden. Diese sequenzielle Gating-Strategie identifiziert einzelne Live-Ereignisse innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters. Die Dubletten, die Zelloberflächenexpression von ICAM-1 im Vergleich zu FMO-Kontrollen und FMO-Kontrollen, die mit relevanten Isotypen der Populationen markiert sind, sind hier dargestellt.

Gating und Messung von MFIs aus verschiedenen Standard-MESF-Populationen in den überlagerten Histogrammen der MESF-Populationen sind hier dargestellt. Die Werte stellen die MFIs für jede der fünf MESF-Populationen dar. Die lineare Regression von MESF über cMFI für die MESF-Populationen wird hier vorgestellt.

Die Steigung extrahiert MESF, die an Zellen gebunden sind, aus den FCM-Daten von ICAM-1 auf der Oberfläche von Tonsillar-B-Zellen in TFH. Die Umrechnung in absolute Moleküldichten folgt diesen einfachen mathematischen Operationen. Die repräsentativen Bilder zeigen die durchflusszytometrische Analyse von BSLBs rekonstituiert mit erhöhten Dichten rekombinanter monomerer ICAM-1 12 Histidine.

Regressionsanalysen der ICAM-1-Referenzkonzentration über der gemessenen Dichte sind hier dargestellt. Die Steigung wird verwendet, um Zielkonzentrationen von Protein zu berechnen, um die Dichte der Zellen zu erreichen. Die Flussdiagramme zeigen die kritischen Schritte zur Kokulturierung von T-Zellen mit BSLBs und rekonstituieren Modellmembranen bei der anschließenden Messung des Partikeltransfers mit Durchflusszytometrie.

Die Gating-Strategie zur Identifizierung einzelner BSLBs und Zellen innerhalb des kontinuierlichen Erfassungsfensters wird hier gezeigt. Einer der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls ist, dass Sie jedes Mal, wenn Sie Protein- oder Lipidvorräte ändern, eine neue Kalibrierungsanalyse durchführen müssen, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aufrechtzuerhalten. Um neue wirksame Moleküle zu entdecken, die von verschiedenen T-Zell-Untergruppen sezerniert werden, können BSLBs durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter isoliert werden, während sie einer transkriptomischen und proteomischen Analyse unterzogen werden.

Unsere Kollegen an der Universität Oxford haben diese Technologie verwendet, um neue Rezeptor-Ligand-Interaktionen zu untersuchen und zu demonstrieren und auch um die Auswirkungen genetischer Ablationen auf die Produktion der T-Zell-Immunsynapse zu untersuchen.