Name: Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator die Bioenergetik von Osteoblasten untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Sauerstoffverbrauch und ATP-Produktion in Echtzeit.

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Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 und dem National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (zu ERR) unterstützt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator kann verwendet werden, um die zelluläre Energetik unter verschiedenen Bedingungen zu erforschen. Das Protokoll veranschaulicht die effiziente Isolierung von BMSCs, die Kultivierung von Zellen in geeigneten Zellkulturplatten und ihre Differenzierung zu reifen Osteoblasten, die für verschiedene Assays mit dem extrazellulären Flussanalysator verwendet werden können. Darüber hinaus werden die kritischen Schritte des Echtzeit-Zellstoffwechselflussassays, einschließlich der Hydratat...

Die Knochenbildung durch den Osteoblasten geht mit einer koordinierten Zerstörung oder Resorption der Knochen durch Osteoklasten einher. Das Gleichgewicht zwischen osteoblastischer Knochenbildung und Osteoklastenresorption ist ein gekoppelter Prozess, der den Knochenumsatz oder -umbau beschreibt, der für die Skeletthomöostase unerlässlich ist. Osteoblast-Dysfunktion führt zu einer gestörten Knochenbildung und führt zu verschiedenen Krankheiten, einschließlich Osteoporose 1,2,3. Die Ex-vivo/In-vitro-Differenzierung von Knochenmark-Stroma-Stammzellen (BMSCs) zu Osteoblasten-Vorläufern und reifen Osteoblasten führt im Laufe der Zeitzur Bildung und Ablagerung der mineralisierten Knochenmatrix im Kulturgefäß 4,5,6. Diese Knochenbildung durch das Osteoblast erfordert eine erhebliche Menge an zellulärer Energie. Insbesondere wurde gezeigt, dass Kollagensynthese und -sekretion stark von zellulärem ATP abhängen: ADP-Verhältnisse, und vermutlich erfordern der Transport und die Sekretion von mineralisierten Vesikeln zusätzliches ATP 7,8,9,10,11. Viele Forscher haben gezeigt, dass der Prozess der Osteoblastogenese und der Osteoblastenfunktion eine ausreichende Energiezufuhr erfordert, um den metabolischen Bedarf an Knochenbildung zu decken 12,13,14,15,16. Daher ist es das Ziel dieser Methode, den bioenergetischen Status von primären, murinen Stromazellen während der Osteoblastendifferenzierung mit dem Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator zu charakterisieren. Diese Techniken tragen dazu bei, ein besseres Verständnis der Skeletthomöostase zu entwickeln, was letztendlich zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Optionen führen kann, die in der Lage sind, Skeletterkrankungen zu verbessern.
Der Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator kann verwendet werden, um die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) lebender Osteoblasten zu messen, was der mitochondrialen bzw. glykolytischen ATP-Produktion entspricht. Grundlegend für diese Methodik ist die Tatsache, dass ein H + -Ion pro Laktat während der Glykolyse bei der Umwandlung von Glukose in Laktat freigesetzt wird, was den in den ECAR-Werten widergespiegelten Medien-pH-Wert verändert. Umgekehrt erzeugt die oxidative Phosphorylierung über die Mitochondrien während des TCA-Zyklus (Tricarbonsäure) CO 2 durch die Verwendung oder den Verbrauch von Sauerstoff, und daher spiegelt die Überwachung der OCR diesen Stoffwechselprozess wider. Der Analysator misst sowohl OCR als auch ECAR in der extrazellulären Mikroumgebung gleichzeitig und in Echtzeit, was ein enormes Potenzial bei der Untersuchung der zellulären Bioenergetik ermöglicht 6,17. Darüber hinaus ist die Durchführung dieser Assays relativ einfach und je nach experimentellem Ziel leicht anpassbar. Ähnliche Techniken wurden angewendet, um die metabolische Regulation des Immunsystems durch T-Zellen18,19, die Krebsinitiation und -progression 20 sowie mehrere andere Zelltypen, die zu metabolischen Syndromen beitragen, besser zu verstehen 21,22.
Zu den Vorteilen des Echtzeit-metabolischen Flussanalysators gegenüber alternativen Techniken gehören (1) die Fähigkeit, die zelluläre Bioenergetik lebender Zellen in Echtzeit zu messen, (2) die Fähigkeit, Assays mit einer relativ kleinen Anzahl von Zellen durchzuführen (erfordert nur 5.000 Zellen), (3) Injektionsanschlüsse zur parallelen Manipulation mehrerer Behandlungen in einem Hochdurchsatz-96-Well-System, (4) Verwendung eines radioaktiven markierungsfreien automatisierten Zellbildgebungsgeräts zur Normalisierung18, 23,24 Die folgenden Methoden zielen darauf ab, eine verallgemeinerte, aber detaillierte Beschreibung der Überwachung der zellulären Bioenergetik in murinen BMSCs während der Osteoblastendifferenzierung mit dem Analysator zu liefern. Es wird routinemäßig durchgeführte Assays umfassen; Wie bei vielen Techniken und Methoden wird jedoch dringend empfohlen, dass einzelne Labore spezifische Details für ihre Experimente festlegen.
Auswahl an Assays und verschiedenen Arten von Assays verfügbar: Eine Vielzahl von Assay-Kits und Reagenzien steht zur Verfügung, um die Bioenergetik von Zellen zu untersuchen und gleichzeitig die Zuverlässigkeit und Konsistenz der experimentellen Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus bietet die Desktop-Software auch Assay-Vorlagen, die leicht angepasst werden können. Der Assay kann basierend auf den Bedürfnissen des Benutzers definiert werden, um verschiedene metabolische Parameter zu messen. Diese Assays können auf verschiedene Weise modifiziert werden, basierend auf dem experimentellen Ziel und / oder der wissenschaftlichen Fragestellung. Zum Beispiel können mit vier Injektionsports mehrere Verbindungen in die Assay-Medien injiziert werden, um die zelluläre Reaktion zu analysieren, die für jeden Stoffwechselweg spezifisch ist.
Zellenergie-Phänotyp-Test: Dieser Assay misst den metabolischen Phänotyp und das metabolische Potenzial der lebenden Zellen. Dieser Assay wird auch als erster Schritt empfohlen, um eine verallgemeinerte Vorstellung vom pfadspezifischen Stoffwechsel zu erhalten. Eine Mischung aus Oligomycin-A-an-Inhibitor der ATP-Synthase und Carbonylcyanid 4-(Trifluormethoxy)-phenylhydrazon (FCCP)-einem mitochondrialen Entkopplungsmittel wird injiziert, um das Zellenergiepotential zu verstehen. Die Injektion von Oligomycin A hemmt die Synthese von ATP, was zu einer Erhöhung der Glykolyserate (ECAR) führt, damit die Zellen ihren Energiebedarf decken können; Auf der anderen Seite führt die Injektion von FCCP zu einer höheren OCR aufgrund der Depolarisation der mitochondrialen Membran. Im Wesentlichen zeigt dieser Assay die Grundstoffwechselatmung und nach den doppelten Injektionen, Pushes oder Stress die metabolische Reaktion. Basierend auf diesen Parametern zeichnet die Software dann OCR und ECAR der Zellen auf, indem sie die Zellen im Laufe der Zeit als aeroben, ruhenden, glykolytischen oder energetischen Zustand klassifiziert25,26.
ATP-Echtzeit-Analyse der Produktionsrate: Dieser misst die zelluläre ATP-Produktion gleichzeitig aus Glykolyse und mitochondrialer Atmung. Dieser Assay misst quantitativ die metabolischen Verschiebungen aus den beiden Energiebahnen und liefert Daten über die mitochondrialen und glykolytischen ATP-Produktionsraten im Laufe der Zeit. Der Assay erhält basale OCR- und ECAR-Daten, gefolgt von der Berechnung der mitochondrialen ATP-Produktionsrate durch Injektion von Oligomycin A und der glykolytischen ATP-Produktionsrate durch Injektion von Rotenon + Antimycin A-Mischung (totale Hemmung der mitochondrialen Funktion), was zu einer mitochondrialen Versauerung führt17,27.
Zellmitochondrien-Stresstest (oder Zell-Mito-Stresstest): Dies misst die mitochondriale Funktion durch ATP-verknüpfte Atmung, quantifiziert die zelluläre Bioenergetik, identifiziert mitochondriale Dysfunktion und misst die Reaktion der Zellen auf Stress. Verschiedene Parameter, einschließlich basale und freie Atemkapazität, ATP-gebundene Atmung, maximale Atmung und nicht-mitochondrialer Sauerstoffverbrauch, können in einem Assay erhalten werden. Dieser Assay beinhaltet sequentielle Injektionen von Oligomycin A, FCCP (mitochondriales Entkopplungsmittel), einer Mischung aus Rotenon/Antimycin-A-Hemmern, um deren Wirkung auf die mitochondriale Funktion effizient zu analysieren28.
Flexibilität mito fuel flex test: Dies misst die mitochondriale Atmungsrate durch die Oxidation der drei primären mitochondrialen Brennstoffe durch das Vorhandensein und Fehlen ihrer Inhibitoren. Die sequentielle Hemmung von Glukose, Glutamin und Fettsäuren hilft bei der Messung der Abhängigkeit, Kapazität und Flexibilität von Zellen und der Abhängigkeit der Zellen in verschiedenen zellulären Wegen, um den Energiebedarf zu decken. Wenn die Mitochondrien die Anforderungen des blockierten Weges von Interesse nicht durch Oxidation anderer Brennstoffe erfüllen können, treten die Zellen in einen Abhängigkeitszustand ein. Die Kapazität der Zellen wird durch Hemmung der beiden anderen alternativen Wege berechnet, gefolgt von der Hemmung des interessierenden Signalwegs. Die Flexibilität der Zellen hilft beim Verständnis der Fähigkeit der Mitochondrien, den Brennstoffbedarf des gehemmten Weges zu kompensieren und zu decken. Es wird berechnet, indem die Abhängigkeit von Zellen von der Kapazität der Zellen subtrahiert wird. Drei verschiedene Inhibitoren werden unabhängig voneinander oder als Mischung aus zwei verwendet, um die Assay-Parameter effektiv zu berechnen. 2-Cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensäure (UK5099) hemmt die Oxidation von Glukose, indem sie den Pyruvatträger in der Glykolyse blockiert. Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES)-ethylsulfid hemmt den Glutaminoxidationsweg und Etomoxir hemmt die Oxidation langkettiger Fettsäuren29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Methodik zur Kultivierung und Vorbereitung von Osteoblasten für die Analyse. Murine BMSCs werden aus langen Knochen isoliert, kultiviert und in 96-Well-Platten bei 25.000 Zellen / Well-Dichte ausgesät. Die Kultivierung dieser Zellen in Osteoblast-spezifischen Medien beginnt, wenn sie eine 80% -100% ige Konfluenz erreichen, um ihre Differenzierung zu beginnen. Die Assays werden in verschiedenen Stadien der Differenzierung durchgeführt. Die Kartuschenplatten werden einen Tag vor dem Assay mit Feuchtigkeit versorgt. Am Tag des Assays werden verschiedene Inhibitoren in die Ports der Sensorkartuschen injiziert, basierend auf den Assay-Anforderungen, und der 96-Well-Kalibrierplatte wird ein Kalibrierpuffer hinzugefügt. Nach der Kalibrierung wird der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay durchgeführt, gefolgt von der Abbildung der Zellkultur-Mikroplatte mit dem Mikroplatten-Imager, um Echtzeit-Daten des Zellstoffwechselflussanalysators mit der Zellzahl zu normalisieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>2-Cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensäure</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethylsulfid</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5 imaging</td> reader <td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Microplate Imager</td></tr><tr><td>Etomoxir Natriumsalzhydrat</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Ölsäure-Albumin aus Rinderserum</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Seepferdchen XF 1,0 M Glukoselösung</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Seepferdchen XF 100mM Pyruvat Lösung</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 200mM Glutamin-Lösung</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF DMEM-Medien</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>DMEM-Assay-Medien mit 5 mM HEPES, pH 7,4, ohne Phenolrot, Natriumbicarbonat, Glukose, Pyruvat und L-Glutamin</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>Echtzeit-Metabolic Flux Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>Enthält XFe96 Sensorkartuschen, Zellkultur-Mikrotiterplatten und Seahorse XF Calibrant Lösung</td></tr><tr><td>Die Software für die Zellbildgebung 1.1.0.11</td><td>Agilent Technologies - BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave Software 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerinphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung eines echtzeit-zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der bioenergetik des osteoblast

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Die Knochenbildung durch Osteoblasten ist ein wesentlicher Prozess für den richtigen Knochenerwerb und Knochenumsatz, um die Skeletthomöostase aufrechtzuerhalten und letztendlich Frakturen zu verhindern. In dem Interesse, sowohl die maximale Knochenmasse zu optimieren als auch verschiedene Muskel-Skelett-Erkrankungen (d.h. postmenopausale Osteoporose, Anorexia nervosa, Typ-1- und Typ-2-Diabetes mellitus) zu bekämpfen, wurden auf dem Gebiet der Knochenbiologie unglaubliche Anstrengungen unternommen, um Osteoblasten während ihres gesamten Differenzierungsprozesses vollständig zu charakterisieren. Angesichts der primären Rolle reifer Osteoblasten bei der Sekretion von Matrixproteinen und Mineralisierungsvesikeln wurde festgestellt, dass diese Prozesse eine unglaubliche Menge an zellulärer Energie oder Adenosintriphosphat (ATP) aufnehmen. Der gesamte zelluläre Energiestatus wird oft als zelluläre Bioenergetik bezeichnet und umfasst eine Reihe von Stoffwechselreaktionen, die die Substratverfügbarkeit erfassen, um ATP abzuleiten, um den zellulären Bedarf zu decken. Daher beschreibt die aktuelle Methode den Prozess der Isolierung primärer, muriner Knochenmarkstromazellen (BMSCs) und der Überwachung ihres bioenergetischen Status mit dem Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator in verschiedenen Stadien der Osteoblastendifferenzierung. Wichtig ist, dass diese Daten gezeigt haben, dass sich das metabolische Profil während der Osteoblastendifferenzierung dramatisch ändert. Daher ist die Verwendung dieses physiologisch relevanten Zelltyps erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie der bioenergetische Status einer Zelle die Gesamtfunktion regulieren kann.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Diagramme für routinemäßig durchgeführte Assays, um das zelluläre bioenergetische Profil der Kontroll- vs. Behandlungsgruppe mit ihren jeweiligen Standardfehlern zu verstehen . (A) Der Zellenergie-Phänotyp-Test. Das Diagramm stellt die Glykolyse (ECAR) vs. mitochondriale Atmung (OCR) der Kontroll- ...

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Diese Methode ist nützlich, um die zelluläre Energetik, wie die ATP-Produktionsrate, zu bestimmen und auch die zelluläre Präferenz für einen bestimmten Metaboliten in Echtzeit zu bestimmen. Fügen Sie zunächst 200 Mikroliter XF-Kalibrant hinzu und inkubieren Sie die Gebrauchsplatte mindestens eine Stunde lang vor dem Assay. Bereiten Sie 80 Milliliter XF-Assay-Medien mit ergänztem XF-DMEM vor.Tauen Sie Oligomycin A, Rotenon und Antimycin A auf Eis auf. Pipettieren Sie die Verbindungen auf und ab, um sie vor dem Gebrauch zu lösen. Fügen Sie drei Milliliter vorbereitetes Assay-Medium zu jedem Röhrchen hinzu, das mit A und B gekennzeichnet ist.Geben Sie 26,4 Mikroliter 2,5 millimolar Oligomycin A in Röhrchen A und 3,1 Mikroliter 12,67 Millimolar Rotenon, 4,1 Mikroliter 9,4 Millimolar Antimycin A und 30 Mikroliter Hook's Fleck in Tube B.Laden Sie eine 10-fache Konzentration dieser Inhibitoren in den entsprechenden Injektionsport.Und schließlich werden 20 Mikroliter dieser Verbindungen in 200 Mikroliter Assay-Medien in die Zellen geladen. Entfernen Sie die Zellkultur-Mikrotiterplatte aus dem 37 Grad Celsius Inkubator und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Ass

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Beschreibung eines Verfahrens zur Profilierung die Funktion der Mitochondrien in den Zellen ist. Die Mitochondrien-Profil generiert bietet vier Parameter der mitochondrialen Funktion, die in einem Experiment gemessen werden kann: basale Atemfrequenz, ATP-linked Atmung, Proton auslaufen und Reservekapazität.

Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells

Dieses Protokoll bietet einen biochemischen Ansatz zur Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von primären leukämischen Zellen mit einem extrazellulären Fluss-Assay. Die Beurteilung des metabolischen Profils dieser Zellen hilft, ihre Bedürfnisse zu charakterisieren, was zu einer personalisierten Therapie führt.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Quelle:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumenteIn diesem Video wird erklärt, wie der Sauerstofffluss zur Beurteilung der mitochondrialen Atmung in lebenden und permeabilisierten Säugetierzellen verwendet wird. Es zeigt die sequentielle Verwendung von Digitonin, metabolischen Substraten, ADP, einem Entkoppler und einem Inhibitor zur Charakterisierung verschiedener respiratorischer Zustände. Das resultierende Sauerstoffflussprofil zeigt die...

Sauerstoffflussmessungen zur Bewertung der mitochondrialen Atmung in lebenden und permeabilisierten Zellen

Dieses Video demonstriert die Methode zur Analyse des Energiestoffwechsels in aktivierten menschlichen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator. Verschiedene Inhibitoren der Elektronentransportkettenkomplexe beeinflussen die ATP-Synthese, die über die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) gemessen wird und Einblicke in den Zellstoffwechsel und die Bioenergetik gibt.

Echtzeit-Überwachung des Energiestoffwechsels in humanen NK-Zellen mit einem extrazellulären Flussanalysator

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Wir präsentieren ein Protokoll zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, wodurch gezielte Abgabe von Substraten und Inhibitoren ermöglicht wird, um die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in kultivierten Zellen zu bewerten und so die Transportbarrieren der Plasmamembran zu überwinden, die diese Analyse typischerweise behindern. Mit dieser Technik zeigten wir, wie die Funktion von OXPHOS durch muscarinische Agonisten und Antagonisten moduliert wird.

cholinerge ligandabhängige Modulation der oxidativen Phosphorylierungskopplung in Digitonin-permeabilisierten BE(2)-C-Neuroblastomzellen

Wir präsentieren ein neuartiges und leistungsfähige Integration der Nanophotonik (QD-FRET) und Mikrofluidik, um die Bildung von Polyelektrolyt Polyplexe, die voraussichtlich zu einer besseren Kontrolle und die Synthese von einheitlichen und anpassbare Polyplexe für zukünftige Nukleinsäure-basierten Therapeutika bieten ist zu untersuchen.

Die Kombination QD-FRET-und Mikrofluidik, um DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time Monitor

Erfahren Sie, wie Sie mit einem Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysator die Bioenergetik von Osteoblasten untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Messung von Sauerstoffverbrauch und ATP-Produktion in Echtzeit.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

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