Name: Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Isolierung zelltypspezifischer RNAs aus gefrorenem Gewebe ohne Zellsortierung mit dem NuTRAP-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Genexpression in spezifischen Zellpopulationen.

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Diese Arbeit wurde teilweise von NIH R00HD082686 unterstützt. Wir danken dem Sommerforschungsstipendium der Endocrine Society an H.S.Z. Wir danken auch Dr. Yuan Kang für die Zucht und Pflege der Mauskolonie.

Alle durchgeführten Tierversuche folgten den Protokollen, die von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) der Auburn University genehmigt wurden.
HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet einen Hoden (ca. 100 mg) bei P28 von Gli1-CreERT2; NuTRAP-Mäuse (Mus musculus). Das Volumen der Reagenzien muss möglicherweise basierend auf der Art der Proben und der Anzahl der Gewebe angepasst werden.
1. Gewebeentnahme
<ol><li>Euthanasieren Sie die Mäuse mit einerCO2-Kammer , desinfizieren Sie die Bauchoberfläche mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Öffnen Sie den Unterbauch mit einer Schere und entfernen Sie die Hoden. Verwenden Sie flüssigen Stickstoff (LN2), um die Hoden sofort einzufrieren.</li>
	<li>Lagern Sie Proben in der Dampfphase von LN2 bis zur Verwendung.</li>
</ol>2. Zubereitung von Reagenzien und Perlen
<ol><li>Bereiten Sie die Homogenisierungsstammlösung vor: Fügen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 und 1 mg/ml Heparin hinzu. Lagern Sie die Lösung bei 4 °C bis zur Verwendung (bis zu 1 Monat).</li>
	<li>Bereiten Sie den Homogenisierungsarbeitspuffer aus der Stammlösung (Schritt 2.1) frisch vor Gebrauch vor: Fügen Sie DTT (Endkonzentration: 1 mM), Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml), rekombinante Ribonuklease (Endkonzentration: 200 Einheiten/ml) und Proteaseinhibitorcocktail (Endkonzentration: 1x) zur Homogenisierungsstammlösung hinzu, um die erforderliche Menge des Homogenisierungsarbeitspuffers herzustellen. Lagern Sie den frisch zubereiteten Arbeitspuffer bis zum Gebrauch auf Eis.</li>
	<li>Bereiten Sie die salzarmen und salzreichen Waschpuffer vor:<ol><li>Zur Herstellung eines salzarmen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl und 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 1 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.</li>
		<li>Zur Herstellung eines salzreichen Waschpuffers mischen Sie 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mMMgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Fügen Sie vor Gebrauch DVB-T (Endkonzentration: 2 mM) und Cycloheximid (Endkonzentration: 100 μg/ml) hinzu.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein G-Perlen vorbereiten (Materialtabelle):<ol><li>Jede Probe benötigt 50 μL Protein-G-Perlen. Legen Sie die erforderliche Menge an Perlen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell von der Lösung, indem Sie das Röhrchen für 30-60 s auf dem Rack belassen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit jeweils 1 ml eiskaltem, salzarmem Waschpuffer.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Gewebelyse und Homogenisierung
<ol><li>Fügen Sie 2 mL eiskalten Homogenisierungsarbeitspuffer (frisch zubereitet aus Schritt 2.2) zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel.</li>
	<li>Das Homogenat in ein 2-ml-Rundbodenröhrchen überführen und 10 min bei 4 °C bei 12.000 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Überstand wird in ein neues 2-ml-Röhrchen überführt. Speichern Sie 100 μL in eine 1,5 mL Röhre als "Eingang".</li>
	<li>Inkubieren Sie den Überstand im 2-ml-Röhrchen mit dem Anti-GFP-Antikörper (5 μg/ml; 1:400) bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) über Nacht.</li>
</ol>4. Immunpräzipitation
<ol><li>Das Homogenat/Antikörper-Gemisch wird in ein neues 2-ml-Rundbodenröhrchen überführt, das die gewaschenen Protein-G-Perlen aus Schritt 2.4 enthält. Bei 4 °C auf einem End-over-End-Rotator (24 U/min) für 2 h inkubieren.</li>
	<li>Trennen Sie die magnetischen Kügelchen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als "negativen Bruch". Die negative Fraktion enthält (1) RNAs in EGFP-negativen Zellen und (2) RNAs in EGFP-positiven Zellen, die nicht an Ribosomen gebunden sind.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml salzreichen Waschpuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen kurz an, um die Perlen zu waschen. Legen Sie das Rohr in ein Magnetgestell.</li>
	<li>Entfernen Sie den Waschpuffer. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch zwei weitere Male. Die Beads enthalten nun den Beads-Ribosom-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen.</li>
</ol>5. RNA-Extraktion
HINWEIS: Die folgenden Schritte wurden aus dem RNA-Isolierkit (Table of Materials) adaptiert. Behandeln Sie jede Fraktion (d. H. Input, positiv und negativ) als unabhängige Probe und isolieren Sie RNAs unabhängig.
<ol><li>Inkubieren Sie die Beads aus Schritt 4.4 mit 50 μL Extraktionspuffer (aus dem RNA-Isolierkit) in einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) für 30 min, um RNAs aus Beads freizusetzen.</li>
	<li>Trennen Sie die Beads mit einem Magnetgestell, übertragen Sie den Überstand, der den Beads-Ribosom-RNA-Komplex enthält, in ein 1,5 ml Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 x g für 2 min, dann pipetten Sie den Überstand zu einem neuen 1,5 ml Röhrchen. Dieses Röhrchen enthält den "positiven Anteil" des TRAP-Schritts. HINWEIS: Für den Input und die negativen Fraktionen extrahieren Sie RNA aus 25 μL Proben unter Verwendung von 1 mL Extraktionspuffer. In einem Thermomixer (42 °C, 500 U/min) 30 min inkubieren.</li>
	<li>Vorkonditionierung der RNA-Reinigungssäule: Pipettieren Sie 250 μL Konditionierungspuffer auf die Reinigungssäule. 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 x g für 1 min.</li>
	<li>Pipet gleiches Volumen von 70% EtOH in den Überstand aus Schritt 5.3 (ca. 50 μL 70% EtOH für die positive Fraktion und 1 ml 70% EtOH für die Eingangs- und die negativen Fraktionen). Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Die Mischung aus Schritt 5.4 in die Säule pipettieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Säule bei 100 x g für 2 Minuten, damit RNA an die Membran in der Säule bindet, und zentrifugieren Sie dann sofort bei 16.000 x g für 30 s. Verwerfen Sie den Durchfluss. HINWEIS: Für die Eingabe und die negativen Fraktionen fügen Sie jedes Mal 250 μL der Mischung in die Säule ein. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7, bis alle Gemische verwendet sind.</li>
	<li>100 μL Waschpuffer 1 (W1) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>75 μL DNase-Lösungsmischung werden direkt in die Membran der Reinigungskolonne pipettiert. Inkubieren bei RT für 15 min.</li>
	<li>40 μL W1 in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 30 s zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>100 μL Waschpuffer 2 (W2) in die Säule pipettieren und bei 8.000 x g für 1 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss.</li>
	<li>100 μL W2 in die Säule pipettieren und bei 16.000 x g für 2 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Durchfluss. Zentrifugieren Sie dieselbe Säule bei 16.000 x g für 1 Minute, um alle Spuren des Waschpuffers vor dem Elutionsschritt zu entfernen.</li>
	<li>Die Säule wird in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.</li>
	<li>Pipettieren Sie 12 μL RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule. Die Pipettenspitze sollte die Membran nicht berühren. Inkubieren bei RT für 1 min und Zentrifugieren bei 1000 x g für 1 min. Dann setzen Sie die Zentrifugation bei 16.000 x g für 1 min fort, um die RNA zu eluieren.</li>
</ol>6. RNA-Konzentration und -Qualität
<ol><li>Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA10 zu beurteilen.</li>
</ol>7. Speicherung und weitere Analyse
<ol><li>Lagern Sie die RNA bei -80 °C (bis zu 1 Jahr) bis zur weiteren Analyse (z. B. Microarray, quantitative PCR (qPCR) und RNA-seq usw.). HINWEIS: Einzelheiten zur qPCR-Analyse, einschließlich der cDNA-Synthese, finden Sie in Lyu et al.11. Primer für qPCR sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
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<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Die Nützlichkeit der Ganzgewebe-Transkriptom-Analyse könnte gedämpft werden, insbesondere bei der Untersuchung komplexer heterogener Gewebe. Wie man zelltypspezifische RNAs erhält, wird zu einer dringenden Notwendigkeit, die leistungsstarke RNA-seq-Technik zu entfesseln. Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs beruht in der Regel auf der Sammlung eines bestimmten Zelltyps mittels Mikromanipulation, fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM)18. Andere mode...

Hochdurchsatzansätze, einschließlich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und Microarray, haben es ermöglicht, Genexpressionsprofile auf genomweiter Ebene abzufragen. Für komplexe Gewebe wie Herz, Gehirn und Hoden liefern die zelltypspezifischen Daten mehr Details zum Vergleich der Verwendung von RNAs aus dem gesamten Gewebe 1,2,3. Um die Auswirkungen der zellulären Heterogenität zu überwinden, wurde seit Anfang der 2010er Jahre die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) entwickelt4. TRAP ist in der Lage, Ribosom-gebundene RNAs aus bestimmten Zelltypen ohne Gewebedissoziation zu isolieren. Diese Methode wurde für die Translatomanalyse (mRNAs, die zur Translation in das Ribosom rekrutiert werden) in verschiedenen Organismen verwendet, einschließlich der Ausrichtung auf eine extrem seltene Population von Muskelzellen in Drosophila-Embryonen5, der Untersuchung verschiedener Wurzelzellen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana6 und der Durchführung einer Transkriptomanalyse von Endothelzellen in Säugetieren7.
TRAP erfordert eine genetische Veränderung, um das Ribosom eines Modellorganismus zu markieren. Evan Rosen und Kollegen entwickelten kürzlich ein Mausmodell namens Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, das seit 2017 über das Jackson Laboratory erhältlich ist. Durch Kreuzung mit einer Cre-Mauslinie können Forscher dieses NuTRAP-Mausmodell verwenden, um Ribosomen-gebundene RNAs und Zellkerne aus Cre-exprimierenden Zellen ohne Zellsortierung zu isolieren. In Cre-exprimierenden Zellen, die auch das NuTRAP-Allel tragen, ermöglicht das EGFP/L10a-markierte Ribosom die Isolierung translatierender mRNAs unter Verwendung von Affinitäts-Pulldown-Assays. An derselben Zelle ermöglicht die Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markierte Kernmembran, die ebenfalls mCherry-positiv ist, die nukleare Isolierung durch affinitäts- oder fluoreszenzbasierte Reinigung. Das gleiche Forscherteam erzeugte auch eine ähnliche Mauslinie, in der die Kernmembran nur mit mCherry ohne Biotin8 markiert ist. Diese beiden genetisch veränderten Mauslinien ermöglichen die Charakterisierung gepaarter epigenomischer und transkriptomischer Profile bestimmter Zelltypen.
Der Hedgehog (Hh)-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle bei der Gewebeentwicklung9. GLI1, ein Mitglied der GLI-Familie, fungiert als transkriptioneller Aktivator und vermittelt die Hh-Signalisierung. Gli1+ Zellen können in vielen hormonsezernierenden Organen gefunden werden, einschließlich der Nebenniere und des Hodens. Um zelltypspezifische DNAs und RNAs aus Gli1+-Zellen mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren, wurden Gli1-CreERT2-Mäuse mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt. Shh-CreERT2-Mäuse wurden auch mit den NuTRAP-Mäusen gekreuzt, um Schalligel (Shh) exprimierende Zellen zu isolieren. Das folgende Protokoll zeigt, wie Gli1-CreERT2 verwendet wird. NuTRAP-Mäuse isolieren Ribosomen-gebundene RNAs aus Gli1+-Zellen in erwachsenen Maushoden.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR-Primer</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (Forward Primer/Reverse Primer)</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-freier Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR-Primer</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (Forward Primer/Reverse Primer)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Dithiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Glasmahlwerk</td><td>Set DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR Primer</td><td>GACAGGAGCAGGAGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (Forward Primer/Reverse Primer)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Maus Clariom S Assay Microarrays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray Service</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>RNasefreie</td><td>Wasser-Growcells</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR-Primer</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (Forward Primer/Reverse Primer</td></tr><tr><td>Superscript IV Reverse Transkriptase</td>, <td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master</td><td>Mix Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR Primer</td><td>GAATGTGTGTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (Vorwärts-Primer/Rückwärts-Primer)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

zelltypspezifische rnas aus eingefrorenen heterogenen gewebeproben ohne zellsortierung isolieren

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Die zelluläre Heterogenität stellt das Verständnis der Funktion komplexer Gewebe auf Transkriptomebene vor Herausforderungen. Die Verwendung zelltypspezifischer RNAs vermeidet potenzielle Fallstricke, die durch die Heterogenität von Geweben verursacht werden, und löst die leistungsstarke Transkriptomanalyse aus. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie die TRAP-Methode (Translating Ribosome Affinity Purification) verwendet werden kann, um Ribosomen-gebundene RNAs aus einer kleinen Menge EGFP-exprimierender Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich für die Isolierung zelltypspezifischer RNAs mit dem kürzlich verfügbaren NuTRAP-Mausmodell und könnte auch verwendet werden, um RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen zu isolieren.

Die Gli1-CreERT2-Maus (Jackson Lab Stock Number: 007913) wurde zuerst mit der NuTRAP-Reportermaus (Jackson Lab Stock Number: 029899) gekreuzt, um Doppelmutantenmäuse zu erzeugen. Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele (d.h. Gli1-CreERT2 und NuTRAP) trugen, wurde Tamoxifen einmal täglich, jeden zweiten Tag, für drei Injektionen injiziert. Die Gewebeproben wurden am 7. Tag nach dem 1. Tag der Injektion entnommen. Die Immunfluoreszenzanalys...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.

Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, qualitativ hochwertige zelltypspezifische RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu erhalten. Es verwendet ein kürzlich verfügbares Mausmodell, das es Forschern ermöglicht, eine ribosomgebundene RNA mittels GLP-Pulldown zu isolieren. Die Methode eignet sich auch zur Isolierung von Ribosomen-gebundenen RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen.Fügen Sie zunächst zwei Milliliter eiskalter Homogenisierungsarbeitspuffer zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel. Das Homogenat in ein Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr überführen und bei 12.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Dann wird der Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr überführt, ohne das Pellet zu stören, wobei 100 Mikroliter als Input reserviert werden. Inkubieren Sie den Überstand mit dem Anti-GFP-Antikörper bei vier Grad Celsius auf einem End-over-End-Rotator über Nacht. Das Homogenat-Antikörper-Gemisch wird in ein neues Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr mit gewaschenen Protein-G-Perlen überführt und zwei Stunden lang vier Grad Celsius auf Rotator bei 24 U/min inkubiert.Trennen Sie die magnetischen Perlen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als die negative Fraktion, die die RNAs in EGFP-negativen Zellen und die RNAs in EGFP-positiven Zellen enthält, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Fügen Sie einen Milliliter Salzwäschepuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Rohr kurz an, um die Perlen zu waschen.Legen Sie dann die Röhre in ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male, um den Ribosomen-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die Beads mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit in einem ThermoMixer für 30 Minuten, um RNAs aus den Beads freizusetzen.Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell und überführen Sie den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 g für zwei Minuten. Dann pipetten Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr.Um die RNA-Reinigungskolonne vorzukonditionieren, pipetten Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 g für eine Minute. Pipettieren Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in den Zellextrakt und mischen Sie gut durch Pipettieren.Pipettieren Sie bis zu 200 Mikroliter der Mischung in die vorkonditionierte RNA-Reinigungskolonne. Um den Verlust von Proben zu reduzieren, füllen Sie die Säule nicht mehr als 80% ihrer Kapazität. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, bis alle RNAs in derselben Spalte jeder Fraktion gesammelt sind.Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten, um RNA an die Membran in der Säule zu binden. Dann setzen Sie die Zentrifugation für 30 Sekunden fort. Entsorgen Sie den Durchfluss und pipettieren Sie 100 Mikroliter Waschpuffer in die Säule.Eine Minute zentrifugieren und dann den Durchfluss verwerfen. Pipettieren Sie 75 Mikroliter DNA-Lösung direkt in die Membran der Reinigungskolonne. Bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.Dann pipetten Sie 40 Mikroliter Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie weitere 30 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss. 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne pipettieren und bei 8.000 g für eine Minute zentrifugieren.Verwerfen Sie den Durchfluss. Kaufen Sie PET 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne und zentrifugieren Sie bei 16.000 g für zwei Minuten. Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie die gleiche Kolonne bei 16.000 g für eine Minute, um alle Spuren des Waschpuffers zu entfernen.Die Säule wird in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pipettieren Sie 12 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze die Membran nicht berührt. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und eine Minute bei 1000 g zentrifugieren.Dann bei 16, 000 G für eine Minute, um die RNA zu eluieren. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA zu beurteilen. Lagern Sie die RNAs in einem 80-Grad-Gefrierschrank oder senden Sie sie zur weiteren Analyse aus.Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele tragen, Gli1-CreERT2 und NuTRAP, wird uns einmal täglich Tamoxifen injiziert, jeden zweiten Tag für drei Injektionen. Immunfluoreszenzanalysen von gesammelten Geweben zeigen, dass das EGFP in interstitiellen Zellen in den Hoden exprimiert wurde. EGFP wurde auch in Nebennierenkapselzellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-Mäusen gefunden.In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-Mäusen Die EGFP-positive Zellpopulation befindet sich im äußeren Kortex der Nebenniere unter der Kapsel, was die Expression von EGFP-präexprimierenden Zellen bestätigt. Nach der Extraktion der zelltypspezifischen RNAs wurde die extrahierte RNA zur Microarray-Analyse geschickt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 3000 Gene in der positiven Fraktion angereichert waren, verglichen mit Genen in der negativen Fraktion, während etwa 4.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren.Unter den differentiell exprimierten Genen waren die Leydig-Zell-assoziierten Gene Hsd11b1 und Hsd3b6 in der positiven Fraktion angereichert. In der negativen Fraktion wurden die Sertoli-Zell-assoziierten Gene Desert Hedgehog und Gstm6 angereichert. Beim Vergleich der negativen Fraktion mit dem Input wurden nur wenige differentiell exprimierte Gene identifiziert.Die quantitative RT-PCR in Echtzeit wurde verwendet, um die Expression von Schlüsselgenen in den positiven und negativen Fraktionen zu bestätigen. Ähnlich wie im Microarray-Assay wurden steroidogene Enzyme 3-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym in der positiven Fraktion angereichert. In der Zwischenzeit wurden der Sertoli-Zellmarker SRY-Box-Transkriptionsfaktor neun und der Keimzellmarker synaptonemales Komplexprotein drei in der negativen Fraktion angereichert.Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, einen frischen Homogenisierungsarbeitspuffer vorzubereiten Fügen Sie DTT, rekombinante Ribonuclease Cycloheximid und Proteinase-Inhibitor-Cocktail nur vor Gebrauch zur Homogenisierungs-Stammlösung hinzu. Es ist auch wichtig, frisches niedriges Salz und die hohen Salzwäschepuffer vor Gebrauch vorzubereiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Transkriptom-Analyse von Einzelzellen

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

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Isolierung von Adipose-Gewebekernen für einzellige Genomanwendungen

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus schockgefrorenem, archiviertem Lebergewebe für Einzelkern-RNA-seq, ATAC-seq und Gelenk-Multiomics (RNA-seq und ATAC-seq) vor.

Isolierung von Zellkernen aus schockgefrorenem Lebergewebe für Einzelzell-Multiomics

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Lernen Sie die Isolierung zelltypspezifischer RNAs aus gefrorenem Gewebe ohne Zellsortierung mit dem NuTRAP-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Genexpression in spezifischen Zellpopulationen.

Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren

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