Zelltypspezifische RNAs aus eingefrorenen heterogenen Gewebeproben ohne Zellsortierung isolieren
8. Dezember 2021
Dieses Protokoll zielt darauf ab, zelltypspezifisch translatierende ribosomale mRNAs mit dem NuTRAP-Mausmodell zu isolieren.
Dieses Protokoll zielt darauf ab, qualitativ hochwertige zelltypspezifische RNAs aus einer kleinen Anzahl von Zellen in einem komplexen Gewebe ohne Zellsortierung zu erhalten. Es verwendet ein kürzlich verfügbares Mausmodell, das es Forschern ermöglicht, eine ribosomgebundene RNA mittels GLP-Pulldown zu isolieren. Die Methode eignet sich auch zur Isolierung von Ribosomen-gebundenen RNAs aus beliebigen EGFP-exprimierenden Zellen.
Fügen Sie zunächst zwei Milliliter eiskalter Homogenisierungsarbeitspuffer zu einem Glasgewebeschleifer-Set hinzu. Legen Sie die gefrorene Probe schnell in die Mühle und homogenisieren Sie das Gewebe mit 30 Schlägen auf Eis mit einem losen Stößel. Das Homogenat in ein Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr überführen und bei 12.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Dann wird der Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Rohr überführt, ohne das Pellet zu stören, wobei 100 Mikroliter als Input reserviert werden. Inkubieren Sie den Überstand mit dem Anti-GFP-Antikörper bei vier Grad Celsius auf einem End-over-End-Rotator über Nacht. Das Homogenat-Antikörper-Gemisch wird in ein neues Zwei-Milliliter-Rundbodenrohr mit gewaschenen Protein-G-Perlen überführt und zwei Stunden lang vier Grad Celsius auf Rotator bei 24 U/min inkubiert.
Trennen Sie die magnetischen Perlen mit einem Magnetgestell vom Überstand. Speichern Sie den Überstand als die negative Fraktion, die die RNAs in EGFP-negativen Zellen und die RNAs in EGFP-positiven Zellen enthält, die nicht an Ribosomen gebunden sind. Fügen Sie einen Milliliter Salzwäschepuffer zu den Perlen hinzu und wirbeln Sie das Rohr kurz an, um die Perlen zu waschen.
Legen Sie dann die Röhre in ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschschritte noch zwei weitere Male, um den Ribosomen-RNA-Komplex aus EGFP-positiven Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die Beads mit 50 Mikrolitern Extraktionspuffer aus dem RNA-Isolationskit in einem ThermoMixer für 30 Minuten, um RNAs aus den Beads freizusetzen.
Trennen Sie die Perlen mit einem Magnetgestell und überführen Sie den Überstand in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 3000 g für zwei Minuten. Dann pipetten Sie den Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr.
Um die RNA-Reinigungskolonne vorzukonditionieren, pipetten Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann zentrifugieren Sie die Säule bei 16.000 g für eine Minute. Pipettieren Sie ein gleiches Volumen von 70% Ethanol in den Zellextrakt und mischen Sie gut durch Pipettieren.
Pipettieren Sie bis zu 200 Mikroliter der Mischung in die vorkonditionierte RNA-Reinigungskolonne. Um den Verlust von Proben zu reduzieren, füllen Sie die Säule nicht mehr als 80% ihrer Kapazität. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrmals, bis alle RNAs in derselben Spalte jeder Fraktion gesammelt sind.
Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten, um RNA an die Membran in der Säule zu binden. Dann setzen Sie die Zentrifugation für 30 Sekunden fort. Entsorgen Sie den Durchfluss und pipettieren Sie 100 Mikroliter Waschpuffer in die Säule.
Eine Minute zentrifugieren und dann den Durchfluss verwerfen. Pipettieren Sie 75 Mikroliter DNA-Lösung direkt in die Membran der Reinigungskolonne. Bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.
Dann pipetten Sie 40 Mikroliter Waschpuffer in die Säule und zentrifugieren Sie weitere 30 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss. 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne pipettieren und bei 8.000 g für eine Minute zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Durchfluss. Kaufen Sie PET 100 Mikroliter Waschpuffer zwei in die Kolonne und zentrifugieren Sie bei 16.000 g für zwei Minuten. Verwerfen Sie den Durchfluss und zentrifugieren Sie die gleiche Kolonne bei 16.000 g für eine Minute, um alle Spuren des Waschpuffers zu entfernen.
Die Säule wird in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Pipettieren Sie 12 Mikroliter RNase-freies Wasser direkt auf die Membran der Reinigungssäule, um sicherzustellen, dass die Pipettenspitze die Membran nicht berührt. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und eine Minute bei 1000 g zentrifugieren.
Dann bei 16, 000 G für eine Minute, um die RNA zu eluieren. Verwenden Sie einen Bioanalysator, um die Qualität und Quantität der extrahierten RNA zu beurteilen. Lagern Sie die RNAs in einem 80-Grad-Gefrierschrank oder senden Sie sie zur weiteren Analyse aus.
Mäusen, die beide gentechnisch veränderten Genallele tragen, Gli1-CreERT2 und NuTRAP, wird uns einmal täglich Tamoxifen injiziert, jeden zweiten Tag für drei Injektionen. Immunfluoreszenzanalysen von gesammelten Geweben zeigen, dass das EGFP in interstitiellen Zellen in den Hoden exprimiert wurde. EGFP wurde auch in Nebennierenkapselzellen in Gli1-CreERT2, NuTRAP-Mäusen gefunden.
In Sonic Hedgehog-CreERT2, NuTRAP-Mäusen Die EGFP-positive Zellpopulation befindet sich im äußeren Kortex der Nebenniere unter der Kapsel, was die Expression von EGFP-präexprimierenden Zellen bestätigt. Nach der Extraktion der zelltypspezifischen RNAs wurde die extrahierte RNA zur Microarray-Analyse geschickt. Die Ergebnisse zeigten, dass etwa 3000 Gene in der positiven Fraktion angereichert waren, verglichen mit Genen in der negativen Fraktion, während etwa 4.000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren.
Unter den differentiell exprimierten Genen waren die Leydig-Zell-assoziierten Gene Hsd11b1 und Hsd3b6 in der positiven Fraktion angereichert. In der negativen Fraktion wurden die Sertoli-Zell-assoziierten Gene Desert Hedgehog und Gstm6 angereichert. Beim Vergleich der negativen Fraktion mit dem Input wurden nur wenige differentiell exprimierte Gene identifiziert.
Die quantitative RT-PCR in Echtzeit wurde verwendet, um die Expression von Schlüsselgenen in den positiven und negativen Fraktionen zu bestätigen. Ähnlich wie im Microarray-Assay wurden steroidogene Enzyme 3-beta-Hydroxysteroid-Dehydrogenase und Cholesterin-Seitenkettenspaltungsenzym in der positiven Fraktion angereichert. In der Zwischenzeit wurden der Sertoli-Zellmarker SRY-Box-Transkriptionsfaktor neun und der Keimzellmarker synaptonemales Komplexprotein drei in der negativen Fraktion angereichert.
Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, einen frischen Homogenisierungsarbeitspuffer vorzubereiten Fügen Sie DTT, rekombinante Ribonuclease Cycloheximid und Proteinase-Inhibitor-Cocktail nur vor Gebrauch zur Homogenisierungs-Stammlösung hinzu. Es ist auch wichtig, frisches niedriges Salz und die hohen Salzwäschepuffer vor Gebrauch vorzubereiten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung translationsassoziierte, zelltypspezifischer mRNAs unter Verwendung des NuTRAP-Mausmodells, die es ermöglicht, hochwertige RNAs aus kleinen Zellpopulationen ohne die Notwendigkeit einer Zellsortierung zu gewinnen. Die Methode eignet sich besonders zum Untersuchen von EGFP-exprimierenden Zellen und zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene, die mit bestimmten Zelltypen assoziiert sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Das NuTRAP-Mausmodell ermöglicht die Isolierung von ribosomengebundenen RNA-Molekülen.
- Dieser Ansatz vermeidet die Komplikationen der Zellsortierung in heterogenen Geweben.
Verwendete Methoden
- GLP-Pull-down zur Isolierung ribosomengebundener RNA
- NuTRAP-Mausmodell
- Mikroarray-Analyse und RT-PCR zur Validierung der Genexpression
Hauptergebnisse
- Etwa 3000 Gene waren in der positiven RNA-Fraktion angereichert, während 4000 Gene in der negativen Fraktion angereichert waren.
- Spezifische Gene, die mit Leydig-Zellen und Sertoli-Zellen assoziiert sind, wurden in den jeweiligen RNA-Fraktionen identifiziert.
- Schlüsselenzym-Gene zeigten eine Anreicherung, die mit den Ergebnissen des Microarrays übereinstimmte.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine zuverlässige Methode zur Isolierung zelltypspezifischer RNAs.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Genexpression in unterschiedlichen Hodenzelltypen bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung zelltypspezifischer RNAs aus heterogenen Geweben ohne Zellsortierung löst eine zentrale Herausforderung bei der Target-Validierung und der mechanistischen Entwederung. Die auf TRAP basierende NuTRAP-Methode ermöglicht eine reproduzierbare, quantitative transkriptomische Profilierung definierter Zellpopulationen und stützt die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsphase. Dieser Ansatz verringert biologisches Rauschen und verbessert die translationale Kohärenz von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in spezifischen Zelltypen innerhalb komplexer Gewebe.
- Operativer Wert: Vermeidet Artefakte durch Zellsortierung und erhält native RNA-Zustände für eine zuverlässige Target-Validierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Entdeckung von Biomarkern und die Aufklärung von Signalwegen in krankheitsrelevanten Systemen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, ribosomengebundene RNA-Eingaben für die Entwicklung nachgeschalteter Assays.
- Operativer Wert: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, die für die Bereitschaft zum Hochdurchsatz-Screening geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit begrenztem Ausgangsmaterial, wodurch eine Wiederverwendung in mehreren EGFP-exprimierenden Modellen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Bewahrt die Krankheitsrelevanz, indem zelltypspezifische Transkriptomprofile aus dem nativen Gewebekontext gewonnen werden.
- Operationaler Wert: Stellt eine lückenlose Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung sicher, indem eine einheitliche Logik der RNA-Isolierung angewandt wird.
- Risikominderung: Verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielstrukturbindung und den Ergebnissen phänotypischer Screenings.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein, insbesondere wenn eine Auflösung auf Zelltyp-Ebene für mechanistische Erkenntnisse entscheidend ist. Sie unterstützt die Hypothesenprüfung und die biologische Risikominderung vor Verbindungsscreening-Kampagnen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht präzise Hypothesentests in heterogenen Geweben durch Isolierung translatierender RNAs aus definierten Zellpopulationen.
- Screening: Erzeugt standardisierte, ribosomenassoziierte RNA-Pools, die für die Assay-Validierung und Reproduzierbarkeitsprüfungen geeignet sind.
- Analytik: Liefert quantitative Genexpressionsdaten (z. B. Microarray, RT-PCR), die einen Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und eine Priorisierung von Zielstrukturen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die frühe Entdeckung mit präklinischer Arbeit, indem zelltypspezifische Signale in komplexen Organen wie Hoden und Nebenniere erhalten bleiben.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Durch die Anwendbarkeit in mehreren Cre-Treiber- und NuTRAP-Linien ist es als skalierbare Plattform für zelltypspezifische Omics-Analysen geeignet.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem störende Signale aus heterogenem Gewebe reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen Laboren durch standardisierte Lyse-, Immunpräzipitations- und RNA-Rückgewinnungsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem sauberere und besser interpretierbare transkriptomische Daten für die Portfolio-Priorisierung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem echte, zelltypspezifische Signale isoliert werden und falsche Hinweise in nachfolgenden Validierungsschritten reduziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Gewebe, in Immunpräzipitation und in Methoden zur RNA-Konservierung.
- Setzt den Zugang zu Magnetständern, ThermoMixern, Zentrifugen und Säulen zur RNA-Reinigung voraus.
- Erfordert die standardisierte Zubereitung von Puffern (Homogenisierung, Waschen, Eluierung) unmittelbar vor der Anwendung, um RNase-Aktivität zu verhindern.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Validierung der EGFP-Expressionslevel und der Effizienz der Ribosomenbindung in neuen Cre-Treiber-Modellen.
- Praktische Einschränkungen umfassen die begrenzte Menge an Eingabegewebe sowie die Notwendigkeit optimierter Konzentrationen von Antikörpern und Kugeln.
