Drosophila melanogaster Larven-Injektionsprotokoll
19. Oktober 2021
Drosophila melanogaster erwachsene Fliegen wurden ausgiebig als Modellorganismen verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die antimikrobiellen angeborenen Immunantworten des Wirts und mikrobiellen Infektionsstrategien zugrunde liegen. Um das Larvenstadium von D. melanogaster als zusätzliches oder alternatives Modellsystem zu fördern, wird eine Larveninjektionstechnik beschrieben.
Dieses Protokoll befasst sich mit den Schwierigkeiten und Herausforderungen bei der Mikroinjektion von Larven, indem es eine präzise Methode beschreibt, die die Verwendung der Drosophila melanogaster Larve als Modell für verschiedene Immun- und molekulare Studien ermöglicht. Dies ist eine einfache Injektionstechnik, die eine effiziente, kostengünstige und schnelle Methode darstellt, um eine Vielzahl von Substanzen wiederholt einheitlich zu verabreichen, was konsistente und zuverlässige Ergebnisse ermöglicht. Beginnen Sie mit der Auswahl der Larven im dritten Stadium und waschen Sie sie mit Ringers Lösung in einer kleinen Petrischale.
Legen Sie ein Filterpapier in eine Petrischale und befeuchten Sie es mit 5 ml Ringer-Lösung. Legen Sie dann die Larven auf das Filterpapier. Bereiten Sie Kapillaren mit 3,5-Zoll-Glaskapillarröhrchen in einem Mikropipettenabzieher vor.
Öffnen Sie die Glaskapillare mit Hilfe einer geraden gezackten Mittelpunktpinzette. Füllen Sie die offene Kapillare mit einer Einwegspritze aus Kunststoff mit Mineralöl. Dann schleudern Sie das Öl mit einem Nanoliter-Injektor aus dem Kapillarrohr.
Füllen Sie die Kapillare mit dem gewünschten bakteriellen Präparat für die Injektion. Übertragen Sie die betäubten Larven auf ein Filterpapier, das mit Ringer-Lösung angefeuchtet ist. Üben Sie mit einer Pinzette festen Druck auf die dorsale Seite des hinteren Endes der Larven aus, wo die Trachealspirakel sichtbar sind.
Führen Sie dann die Nadel horizontal in Richtung des hinteren Endes der Larven ein und injizieren Sie die Bakterienvorräte. Entfernen Sie die Pinzette, um das Verschütten von Hämolymphe oder Darm zu vermeiden. Ziehen Sie dann die zuvor in Larven eingeführte Nadel zurück.
Infizieren Sie 20 Larven für jede experimentelle Bedingung. Übertragen Sie die injizierten Larven vorsichtig mit einem Pinsel auf ein separates feuchtes Filterpapier. Fügen Sie die Lösung von Ringer nach Bedarf hinzu, um eine Austrocknung zu verhindern.
Inkubieren Sie die Petrischale in einem Inkubator bei 25 C.Drosophila melanogaster Larven, die mit Photorhabdus asymbiotica infiziert waren, zeigten 24 Stunden nach der Injektion eine Überlebensrate von 57%, während Larven, denen Escherichia coli injiziert wurde, gleichzeitig eine Überlebensrate von 85% aufwiesen. Die Bedeutung dieser Methode besteht darin, dass die Nadel ungefähr parallel zur Larve gehalten wird. Der Druck, der ausgeübt wird, um die Larve zu halten, ist sehr gering, was die Möglichkeit von Hämolymphleckage, tödlichen Verletzungen oder unzureichender Abgabe der gewünschten Substanz verringert.
Diese Technik kann mit Übung perfektioniert werden.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Injektionstechnik an Larven von Drosophila melanogaster, die darauf abzielt, den Einsatz von Larven in immunologischen und molekularen Untersuchungen zu erleichtern. Die Methode begegnet den Herausforderungen bei der Mikroinjektion von Larven und stellt einen zuverlässigen Ansatz für die Applikation von Substanzen bereit.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Drosophila melanogaster ist ein weit verbreitetes Modellorganismus.
- Das Verständnis der antimikrobiellen angeborenen Immunantworten ist entscheidend.
- Larvenstadien liefern zusätzliche Erkenntnisse über mikrobielle Infektionsstrategien.
- Mikroinjektionstechniken sind für die experimentelle Konsistenz unerlässlich.
Zweck der Studie
- D. melanogaster-Larven als Modellsystem etablieren.
- Eine detaillierte Methode für die Mikroinjektion von Larven bereitstellen.
- Die Zuverlässigkeit immunologischer und molekularer Untersuchungen verbessern.
Verwendete Methoden
- Wählen Sie Larven des dritten Larvenstadiums für die Injektion aus.
- Spülen Sie die Larven mit Ringer-Lösung ab.
- Bereiten Sie Kapillaren unter Verwendung von Glas-Kapillarrohren vor.
- Injizieren Sie die Substanzen gleichmäßig in die Larven hinein.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine effiziente Substanzapplikation.
- Die Ergebnisse sind über verschiedene Experimente hinweg konsistent und zuverlässig.
- Kostengünstige Methode, geeignet für verschiedene Studien.
- Erleichtert die Untersuchung immunologischer Reaktionen in Larven.
Schlussfolgerungen
- Die Injektionstechnik an Larven ist ein wertvolles Werkzeug für Forscher.
- Sie erweitert die Anwendbarkeit von D. melanogaster in wissenschaftlichen Untersuchungen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können diese Methode nutzen, um tiefere Einblicke zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Larven von Drosophila melanogaster bieten ein kostengünstiges, genetisch gut handhabbares Modell zur Untersuchung der angeborenen Immunität und der Wirt-Pathogen-Interaktionen, das eine Zielvalidierung in einem frühen Stadium mit geringerer ethischer und finanzieller Belastung ermöglicht. Das Injektionsprotokoll für Larven verbessert die Reproduzierbarkeit von Immunreaktions-Assays und unterstützt die mechanistische Absicherung antimikrobieller und immunmodulatorischer Kandidaten. Dieser Ansatz verbindet die Entdeckungsbiologie mit der präklinischen Bewertung, indem er quantifizierbare Überlebens- und Infektionsendpunkte in einem krankheitsrelevanten System bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die mit angeborenen Immunwegen und Virulenzmechanismen zusammenhängen.
- Operationaler Wert: Bietet ein skalierbares System zur funktionellen Zielvalidierung unter Verwendung von Modellen mit mikrobiellem Challenge.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem quantitative Daten zu Infektion und Überleben für die Bewertung von Leitverbindungen generiert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bietet standardisierte Verfahren zur Vorbereitung und Injektion von Larven für eine konsistente Substanzexposition.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung von Überlebensraten und Pathogenlast als abhängige Variablen in Screening-Kampagnen.
- Reproduzierbarkeit: Verringert die technische Variabilität durch kontrollierte Injektionsmechanik und Umweltbedingungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert für den Menschen relevante angeborene Immunantworten auf bakterielle Pathogene wie Photorhabdus asymbiotica und Escherichia coli.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht den Übergang von der Validierung von Zieltreffern zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung in einem ganzheitlichen Organismuskontext.
- Mechanistische Ent风险minderung: Klärt vor Studien an Säugetieren die Wirtsschutzwege und den Beitrag von Virulenzfaktoren auf.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Larveninjektionsmethode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, unterstützt die hypothesengetriebene Zielvalidierung und ermöglicht reproduzierbare Testformate für die Wirkstoffscreening-Phase vor der Lead-Optimierung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die funktionelle Validierung immunbezogener Zielstrukturen durch kontrollierte Pathogenherausforderung in Larven.
- Screening: Erzeugt Dosis-Wirkungs- und Überlebensdaten, die für das High-Content-Screening immunmodulatorischer oder antimikrobieller Wirkstoffe geeignet sind.
- Analytik: Bietet quantitative Überlebenskennzahlen (z. B. 24-Stunden-Überlebensraten), die Vergleiche zwischen experimentellen Bedingungen und Behandlungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Etabliert ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung des therapeutischen Einflusses auf Infektionsausgänge vor dem Übergang zum Nagetiermodell.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine standardisierte, kostengünstige Plattform dar, die in mehreren Projekten der Immunologie und Infektionsforschung anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten bei Wirt-Pathogen-Interaktionen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren sicher, indem definierte Injektionsparameter und Umweltbedingungen festgelegt werden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige Wirksamkeits- und Toxizitätssignale in einem Ganzorganismus-Modell bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf Überlebens- und Infektionseliminationsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Larven, in Anästhesietechniken und Mikroinjektionstechniken.
- Hängt vom Zugang zu Mikropipettenzuggeräten, Nanoliter-Injektoren und Werkzeugen zur Herstellung von Glas-Kapillaren ab.
- Erfordert die standardisierte Herstellung von Ringer-Lösung und die Inkubation unter kontrollierten Umweltbedingungen bei 25 °C für konsistente Ergebnisse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Untersuchung unterschiedlicher mikrobieller Stämme oder Substanzviskositäten.
- Ist durch die geringe Größe der Larven und die begrenzte Injektionsvolumina eingeschränkt, was die Verabreichung großer Moleküle oder Partikel einschränken kann.
