Name: Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie die ex utero Kultivierung von Mausembryonen für Entwicklungsbiologie von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung früher Entwicklungsprozesse außerhalb des Uterus.

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Diese Arbeit wurde von Pascal und Ilana Mantoux finanziert; Europäischer Forschungsrat (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Professur des Israel Cancer Research Fund (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, das Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella und Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David und Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Nachlass von Zvia Zeroni.

Alle Tierversuche wurden nach den Tierschutzrichtlinien des Weizmann Institute of Science durchgeführt und vom zuständigen Weizmann Institut IACUC genehmigt (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Gesunde schwangere Frauen wurden gebeten, ihre Einverständniserklärung zur Entnahme von Blut aus ihrer Nabelschnur zu geben, wie vom Rambam Medical Center Helsinki Committee genehmigt (#RMB-0452-15). Gesunde Erwachsene wurden um ihre informierte Zustimmung gebeten, Blut gemäß den Richtlinien des Helsinki-Komitees des Weizmann Institute of Science sammeln zu lassen (#1566-3).
1. Medienaufbereitung
<ol><li>Bereiten Sie das Dissektionsmedium mit 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) ohne Phenolrot und L-Glutamin vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin / Streptomycin und filtern Sie es mit einem 0,22 μm-Filter. HINWEIS: Halten Sie das Dissektionsmedium bis zu 1 Monat bei 4 °C.</li>
	<li>Ex-utero-Embryokulturmedium (EUCM) jeden Kulturtag in einer biologischen Haube frisch zubereiten, wobei 25 % des embryonalen Mediums plus 50 % Rattenserum und 25 % menschliches Nabelschnurblutserum (HCS) oder menschliches Erwachsenenblutserum (HBS) verwendet werden.</li>
	<li>Um ein embryonales Medium herzustellen, fügen Sie 5 ml Glutamin, 5 ml HEPES und 5 ml Penicillin / Streptomycin in 500 ml DMEM ohne Phenolrot und L-Glutamin hinzu. 10-15 ml Aliquots zubereiten und bei 4 °C bis zu zwei Monate aufbewahren. HINWEIS: Verdoppeln Sie die Antibiotikakonzentration bei Kontamination.</li>
	<li>Das Rattenserum bei 56 °C für 30-45 min hitzeinaktivieren und durch einen 0,22 μm Polyvinylidendifluoridfilter filtriert. Verwenden Sie das Serum zur Kultur am selben Tag der Inaktivierung. Tauen Sie HCS oder HBS auf und verwenden Sie es sofort für Experimente. HINWEIS: Kommerzielles Rattenserum liefert konsistente Ergebnisse (mindestens 4 Chargen wurden ohne offensichtliche Variation getestet). Alternativ kann hochwertiges Rattenserum wie zuvor beschrieben im eigenen Haus bezogen werden8,14. Wenn HCS nicht verfügbar ist, ersetzen Sie es durch intern gesammeltes HBS. Rattenserum, HCS und HBS können einmal wieder eingefroren und bei -20 °C zur Anwendung an einem anderen Tag aufbewahrt werden. Tauen und kombinieren Sie das refrozen Serum mit einem größeren Volumen frisch aufgetautem Serum und frieren Sie es nicht wieder ein.</li>
</ol>2. Entnahme von menschlichem Nabelschnurblutserum und menschlichem Erwachsenenblutserum
<ol><li>Um HCS zu isolieren, sammeln Sie Nabelschnurblut von gesunden schwangeren Frauen am Tag der geplanten Kaiserschnittgeburt.<ol>
<li>Klemmen Sie die Nabelschnur 5-7 cm vom Nabel und transsektieren Sie die Nabelschnur unmittelbar nach der Geburt des Säuglings zwischen die Klemmen.</li>
		<li>Ziehen Sie manuell Blut mit einer 14-G-Nadel mit großer Bohrung und einer 50-ml-Spritze direkt aus der Nabelvene, während die Plazenta vor Ort bleibt, um Spuren einer Hämolyse zu vermeiden. HINWEIS: Sammeln Sie Blut, nachdem das Kind aus dem Operationsfeld entfernt wurde, und Nabelschnurblut für klinische Tests entnommen wurde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Geben Sie das gesammelte Blut auf 5 ml prokoagulatorische sterile Reagenzgläser und übertragen Sie sie sofort für 15 min auf 4 ° C, um eine vollständige Koagulation zu ermöglichen. Zentrifugieren Sie die koagulierten Reagenzgläser bei 2.500 × g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entsorgen Sie Röhrchen mit Anzeichen einer Hämolyse (rosa-rotes Serum). Sammeln Sie das Serum (gelbe Farbe) mit einer 5 ml Pipette und filtrieren Sie es durch einen 0,22 μm Filter. Das Serum sofort in einem 56 °C warmen Wasserbad für 45 min wärmeinaktivieren.</li>
	<li>1-1,5 ml Aliquots des inaktivierten Serums zubereiten und bei -80 °C bis zu sechs Monate aufbewahren. Bei Bedarf bei -70 °C mit Trockeneis versenden.</li>
	<li>Für die Serumentnahme aus menschlichem Blut bei Erwachsenen entnehmen Sie Blut von gesunden Erwachsenen und isolieren Sie sofort das Serum nach dem gleichen Protokoll, das für nabelschnurblutserum beschrieben ist. Lagern Sie das HBS als wärmeinaktivierte und filtrierte Aliquots bei -80 °C bis zu sechs Monate. HINWEIS: Menschliches Nabelschnurserum und humanes Serum für Erwachsene, die frisch im Haus zubereitet wurden, lieferten bessere Ergebnisse als kommerziell erhältliches Serum. Sammeln Sie HCS von gesunden Frauen, über 18 Jahren und unter 40 Jahren, die für die Kaiserschnittgeburt vorgesehen sind. Schließen Sie Frauen aus, die vaginal geboren haben, und Frauen mit chronischen Krankheiten oder aktiven Erkrankungen, einschließlich Schwangerschaftsdiabetes oder Bluthochdruck.</li>
</ol>3. Ex-utero-Walzenkultur von Embryonen von E7.5 bis E11
<ol><li>Einrichtung des Rollenkultur-Inkubators und des Gasreglers<ol>
<li>Kultur E7.5 oder mehr fortgeschrittene Embryonen mit dem Rollkultur-Inkubatorsystem. Schalten Sie den Rotator und die Heizeinheit bei 37 °C für mindestens 1 h ein, bevor die Embryonendissektionen durchgeführt werden. Geben Sie autoklaviertes Wasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas. HINWEIS: Stellen Sie ein Thermometer neben die rotierende Trommel und überprüfen Sie häufig die Stabilität der Temperatur im Inkubator. Öffnen Sie den Inkubator so schnell wie möglich, da eine längere Öffnungszeit die Temperatur erhöht und die Embryonalentwicklung beeinträchtigt. Wenn nötig, fügen Sie mehr autoklaviertes Wasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas hinzu, um sie während der Kultur auf mindestens die Hälfte der Kapazität zu halten. Schützen Sie die Embryonen im Inkubator vor Licht, indem Sie den Inkubator mit einem Tuch abdecken.</li>
		<li>Schalten Sie das Gasreglermodul ein, indem Sie den Hauptschalter drücken und anschließend die Sauerstoff-/Stickstoff- und CO2-Regler einschalten (Abbildung 1A). Stellen Sie die Sauerstoff- und CO2-Werte mit den jeweiligen Reglern auf 5% ein. Öffnen Sie den Gasregler und stellen Sie den Gasdruck auf ~ 6,5-7 Pfund pro Quadratzoll (psi) ein, indem Sie den Spannungsschalter im Druckmessumformer bewegen (Abbildung 1B). Bestätigen Sie den Gasdruckwert mit einem digitalen Manometer.</li>
		<li>Überwachen Sie den Gasfluss, indem Sie die Geschwindigkeit der Blasen überprüfen, die im ausgelassenen, mit Wasser gefüllten Reagenzglas entstehen, das im Präzisionsinkubator zugewiesen ist. Stellen Sie die richtige Blasenrate ein, indem Sie das Gasdurchflussventil am Deckel der Wasserflasche schließen/öffnen. Stellen Sie sicher, dass der Gasstrom die Bildung von Blasen mit einer Geschwindigkeit von 2-4 Blasen pro Sekunde ermöglicht, oder stellen Sie den Blasenfluss an der ersten Stelle ein, an der das Blubbern in das mit Wasser gefüllte Auslassrohr austritt.</li>
		<li>Füllen Sie die Kulturflaschen mit 2 mL Kulturmedium und stecken Sie sie zur Vorgleichstellung für 1 h in die ausgehöhlte Drehtrommel. Verwenden Sie die ausgehöhlten Silikonspäne, um die Flaschen an der Trommel zu verschließen. Halten Sie die leeren Räume in der rotierenden Trommel mit den massiven Spundwänden abgedichtet. HINWEIS: Das Fehlen von Blasen im Auslassrohr (kein Gas kommt durch das System) oder ein außergewöhnlich hoher Gasfluss können die Embryonalentwicklung beeinträchtigen. Im Falle eines fehlenden Blasenflusses zum Auslassreagenzglas überprüfen Sie, ob alle Silikonpfunde ordnungsgemäß in der rotierenden Trommel positioniert sind und das System abdichten, und überprüfen Sie, ob die Wasserflasche ordnungsgemäß geschlossen und alle Schläuche korrekt angeschlossen sind. Ein Mangel an Blubbern, das in die Wasserflasche gelangt, kann auf eine Fehlfunktion des Gasreglers hinweisen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissektion von Mausembryonen von schwangeren Mäusen<ol><li>Das Dissektionsmedium in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 1 h vorquilibrieren. Lassen Sie den Deckel leicht geöffnet, um den Gasaustausch zu ermöglichen.</li>
		<li>Opfern Sie die schwangere Frau durch zervikale Luxation, reinigen Sie den Bauch der Frau mit 70% Ethanol und schneiden Sie die Haut und Die Bauchdecke mit einer Schere ab. Lokalisieren Sie ein Ende der Gebärmutter und schneiden Sie an der Kreuzung zwischen dem Eierstock und der Gebärmutter. Als nächstes schneiden Sie entlang der Gebärmutter bis zum anderen Ende und übertragen Sie sie in eine 100 mm Petrischale, die mit dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) bei Raumtemperatur gefüllt ist. HINWEIS: Die Verwendung von nicht hormonprimierten, natürlich gepaarten Weibchen wird empfohlen.</li>
		<li>Waschen Sie die Conceptuse schnell in DPBS und schneiden Sie sie paarweise, um die Handhabung des Embryos zu erleichtern. Alle Konzeptpaare in eine 60-mm-Petrischale auf vorgeglichenes Seziermedium verschieben und in einzelne Conceptuse schneiden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Gebärmutterwand der Conceptusse, indem Sie das Gebärmuttergewebe mit einer groben Pinzette reißen. Verwenden Sie eine feine mikrochirurgische Pinzette, um die Spitze der birnenförmigen Decidua zu schneiden. Führen Sie die Pinzette neben dem Embryo parallel zu seiner langen Achse ein und öffnen Sie die Pinzette, um die Decidua in zwei Hälften zu teilen.</li>
		<li>Lassen Sie schließlich den intakten Ektoplazentakegel am Eizylinder befestigt, indem Sie den Embryo aus der Decidua greifen und den parietalen Dottersack mit einer feinen Pinzette vom Embryo abziehen. HINWEIS: Um eine Beeinflussung des Embryos zu vermeiden, führen Sie Dissektionen an einem Mikroskop durch, das mit einer Heizplatte bei 37 °C innerhalb von maximal 30-40 min ausgestattet ist. Sezieren Sie jeweils einen Wurf Embryonen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Embryonen unmittelbar nach der Dissektion mit einer Pasteurpipette aus Glas auf eine neue Platte, die mit einem ausgeglichenen Dissektionsmedium gefüllt ist, um zu verhindern, dass die Embryonen an den Gewebetrümmern haften bleiben.</li>
		<li>Wählen Sie die Embryonen im Stadium der Neuralplatte / frühen Kopffalte aus, die keine Schäden im Epiblasten zeigen, und übertragen Sie 5-6 Embryonen pro Flasche in die voremisch ausgerüsteten Glaskulturflaschen. HINWEIS: Um die Pasteurpipette aus Glas vorzubereiten, schneiden Sie die Öffnung der Pipette mit einem Glasschneider auf eine ausreichende Größe, um in die Embryonen zu passen, und bewahren Sie sie in Ethanol auf, um eine Kontamination zu vermeiden. Waschen Sie die Glaspipette mit PBS, bevor Sie Embryonen übertragen. Achten Sie beim Transfer der Embryonen in die Kulturflasche darauf, so wenig Volumen wie möglich vom Seziermedium zu übertragen, um eine Verdünnung der EUCM zu vermeiden.</li>
		<li>Legen Sie die Flaschen in das rotierende Kultursystem bei 37 °C, in eine Atmosphäre von 5% O2 und 5% CO2.</li>
		<li>Nehmen Sie jeden Tag der Kultur die Flaschen einzeln aus dem Inkubator, um die Embryonalentwicklung unter einem Stereomikroskop zu bewerten. Achten Sie darauf, das leere Loch in der Trommel mit einem festen Spund zu schließen, wenn Sie eine Flasche entfernen. Schneiden Sie die Spitze einer sterilen Pasteur-Pipette aus Kunststoff an die Embryonengröße an und bewegen Sie die Embryonen in eine Petrischale, um die Beobachtung zu erleichtern. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen immer von Medium bedeckt sind. HINWEIS: Minimieren Sie die Zeit, für die sich die Embryonen außerhalb des Inkubators befinden, um schädliche Auswirkungen auf die Embryonen aufgrund einer Abnahme der Körpertemperatur zu vermeiden. Behandeln Sie die Embryonen vorsichtig, um einen Bruch der Dottersack-Blutgefäße zu vermeiden, der das Überleben des Embryos beeinträchtigt.</li>
		<li>Am Kulturtag 1 (entspricht E8.5) transferieren Sie Gruppen von 3 Embryonen in eine neue Flasche mit 2 ml frischer und vorregulierter EUCM, die zusätzliche 3 mg/ml D-Glucose und ein Gasgemisch aus 13% O2, 5% CO2 enthält.</li>
		<li>Nach 48 h (entspricht E9.5) Transfergruppen von zwei Embryonen in eine neue Flasche mit frisch vorgewärmtem EUCM plus 3,5 mg/ml Glucose in einer Gasatmosphäre von 18% O2 und 5% CO2.</li>
		<li>Bei 72 h Kultur (entspricht E10,5) jeden Embryo in eine einzelne Flasche mit 1,5-2 ml frischem Medium, ergänzt mit 4 mg/ml Glucose und einer Gaszufuhr von 21% O2 und 5% CO2. HINWEIS: Embryonen erreichen ihr maximales Wachstum gegen Mitternacht des Kulturtages 4.</li>
		<li>Verwenden Sie eine feine Pinzette, um den Dottersack und das Amnion zu entfernen, und lösen Sie die Nabelschnur, um die Morphologie des Embryos richtig zu beobachten. Schalten Sie das Gasregulierungsmodul und den Präzisionsinkubator aus. HINWEIS: Das Kulturmedium für 1 Stunde durch Inkubation in einer Glasflasche in der Walzenkultur mit einer entsprechenden Gasatmosphäre entsprechend dem Embryostadium vorquilibrieren. Reinigen Sie die Kulturflaschen und alle Inkubatorgläser nach jedem Gebrauch, indem Sie drei Wäschen mit fließendem destilliertem Wasser durchführen, gefolgt von einer Nachtwäsche, die in 70% Ethanol getaucht ist. Dreimal mit fließendem destilliertem Wasser nachspülen, die Flaschen über Nacht trocknen lassen und per Autoklav sterilisieren. Ebenso autoklavieren Sie die Silikonstopfen regelmäßig. Reinigen Sie alle Dissektionswerkzeuge gründlich mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie trocken.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Erweiterte Embryokultur von E5.5/E6.5 bis E11
<ol><li>Kultur vorgastrullieren (E5.5) und frühe Gastrulation (E6.5) Embryonen bis zum frühen Somite-Stadium (E8.5) in statischen Platten.</li>
	<li>Das Dissektionsmedium für 1 h in einem Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C vorquilibrieren. HINWEIS: Um den Gasaustausch zu ermöglichen, schließen Sie den Deckel des Rohres nicht vollständig.</li>
	<li>Bereiten Sie die Kulturplatten vor, indem Sie 250 μL frisch zubereitetes EUCM in jede Vertiefung geben. Legen Sie die Platten zur Vorgleichgewichtung in einen CO2-Inkubator bei 37 °C. HINWEIS: Obwohl 8-Well-Platten gut für das Embryonenwachstum geeignet sind, kann die Kultur in jeder anderen Platte durchgeführt werden, indem das Volumen des Mediums entsprechend der Größe der Platte eingestellt wird.</li>
	<li>Sezieren Sie Eizylinderembryonen aus der Gebärmutter nach der für E7.5 beschriebenen Technik. Entfernen Sie den parietalen Dottersack des Embryos und lassen Sie den intakten Ektoplazentakegel am Eierzylinder befestigt.</li>
	<li>Einzelne Embryonen mit einer Mikropipette in jeden Brunnen der 8-Well-Platte übertragen und die Platte mit 5% CO2 bei 37 °C in den Inkubator geben.</li>
	<li>Stellen Sie sich die Embryonen unter einem Stereomikroskop vor und wählen Sie für die Kultur nur diejenigen mit einer wohlgeformten Fruchthöhle aus, ohne offensichtliche Schäden und ohne die Reichert-Membran. HINWEIS: Verwenden Sie 20 μL Pipettenspitzen, um E5,5-Embryonen zu übertragen, und 200 μL-Spitzen, um E6,5-Embryonen zu übertragen. Bei Kulturen ab E6.5 kann HCS durch frisch gesammelte HBS ersetzt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hälfte des Mediums und fügen Sie nach 24 h Kultur 250 μL frisch zubereitetes vorgewärmtes EUCM hinzu, um sicherzustellen, dass die Embryonen immer in das Kulturmedium eingetaucht sind. Im Falle von Kulturen, die bei E5.5 beginnen, werden nach zwei Tagen Kultur (entspricht E7.5) 200 μL entfernt und 250 μL neues EUCM hinzugefügt. HINWEIS: Während der statischen Kultur können sich Embryonen an der Platte festsetzen (hauptsächlich bei Verwendung von Kunststoffplatten), was die Embryonalentwicklung stark beeinträchtigt. Die Befestigung des Embryos an der Platte ist am ersten Tag der Kultivierung von E5,5-Embryonen häufiger. Um eine Anhaftung zu verhindern, drücken Sie die Embryonen vorsichtig mit einer feinen, sterilen Pinzette von der Plattenoberfläche weg. Stellen Sie sicher, dass nur der Ektoplazentakegel an der Oberfläche der Platte befestigt bleibt.</li>
	<li>Transfer der Embryonen in die Walzenkultur im frühen Somite-Stadium (4-7 Somiten; nach drei Tagen Kultur für Embryonen, die bei E5,5 explantiert wurden, und zwei Tagen für Kulturen, die bei E6.5 begonnen wurden), nach den gleichen Indikationen, die zuvor für Embryonen im E8.5-Stadium beschrieben wurden. HINWEIS: Der Transfer der Embryonen in die Walzenkultur in anderen als den oben angegebenen Stadien führt zu einem Versagen der weiteren Entwicklung. Im Gegensatz zu E7.5 ex utero Kulturen ist es möglich, die Embryonen in einer konstanten Atmosphäre von 21% Sauerstoff und 5% CO2 zu halten, was eine etwas höhere Effizienz der Embryonalentwicklung bietet als Atmosphären mit dynamischer Sauerstoffkonzentration.</li>
</ol>

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</ol>

J.H.H ist Berater von Biological Industries Ltd und hat eine Patentanmeldung eingereicht, die die hierin beschriebenen Walzen- und statischen Kulturbedingungen abdeckt (eingereicht von J.H.H. und dem Weizmann Institute of Science). Andere Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Das hier vorgestellte Kulturprotokoll kann die ordnungsgemäße und kontinuierliche Entwicklung des Mausembryonen ex utero für bis zu sechs Tage von E5.5 bis E11 aufrechterhalten. Zuvor konnten sich Embryonen in diesen Entwicklungsstadien nur für kurze Zeiträume (bis zu 48 h)15 normal in Kultur entwickeln. Die Kopplung des Gasregulationsmoduls an den Rollenkultur-Inkubator zur präzisen Kontrolle der Sauerstoffkonzentration und des hyperbaren Gasdrucks ist entscheidend für die hierin beschri...

Die intrauterine Entwicklung des Säugetierembryos hat die Untersuchung der frühen Stadien der Postimplantationsentwicklung eingeschränkt1,2. Die Unzugänglichkeit des sich entwickelnden Embryos behindert das Verständnis der wichtigsten Entwicklungsprozesse, die nach der Implantation des Embryos in die Gebärmutter ablaufen, wie z.B. die Erstellung des tierischen Körperplans, die Spezifikation der Keimschichten oder die Bildung von Geweben und Organen. Darüber hinaus erschwert die sehr geringe Größe des frühen postimplantierten Embryos die Beobachtung durch intravitale Bildgebung in utero vor E103. Die Unfähigkeit, lebende Embryonen in diesen Stadien zu beobachten und zu manipulieren, hat die Untersuchung der frühen Embryogenese nach der Implantation auf Momentaufnahmen während der Entwicklung beschränkt.
Die Protokolle für die In-vitro-Kultur von Präimplantations-Säugetierembryonen sind gut etabliert, zuverlässig und werden regelmäßig verwendet4. Dennoch hatten Versuche, Ex-utero-Kultursysteme zu etablieren, die in der Lage sind, das richtige Wachstum von Säugetieren nach der Implantation von Embryonen zu unterstützen, nur begrenzten Erfolg5. Seit über einem Jahrhundert wird eine Vielzahl von Kulturtechniken vorgeschlagen, hauptsächlich durch Kultivierung der Embryonen in herkömmlichen statischen Platten6,7,8 oder rotierenden Flaschen (Walzenkulturen)5,9,10. Diese Plattformen erwiesen sich als hilfreich bei der Erweiterung des Wissens über die Entwicklung von Säugetieren nach der Implantation11,12, obwohl sie für das normale Überleben von Embryonen sehr ineffizient und auf kurze Zeiträume beschränkt waren. Die Embryonen zeigten bereits 24-48 h nach Beginn der Kultur Entwicklungsverzögerung und morphologische Anomalien.
Diese Studie liefert eine detaillierte Beschreibung für den Aufbau des Ex-utero-Embryokultursystems , das eine kontinuierliche Entwicklung von der Prägastrulation zu fortgeschrittenen Organogenese-Stadien über bis zu sechs Tage nach der Implantation ermöglicht13. Dieser Artikel beschreibt das verbesserte Walzenkulturprotokoll, das das Wachstum von E7.5-Embryonen (Neuralplatte und Headfold-Stadium) bis zur Hintergliedmaßenbildung (~ E11) und die erweiterte Kultur von E5.5 / E6.5 durch die Kombination von Kultur auf statischen Platten und Rollenkulturplattformen unterstützt.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Porenfilter (250 mL)</td><td>JetBiofil</td><td>FCA-206-250</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &Mikro; m Porengröße Spritze PVDF Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>8-Well- &Mikroplatten Glasboden/ibiTreat</td><td>iBidi</td><td>80827/80826</td><td></td></tr><tr><td>Flasche mit Adapterkappe für Gaseinlass</td><td>Arad Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stopfen (Loch)</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 06</td><td>Wird verwendet, um die Flaschen mit der Trommel abzudichten</td></tr><tr><td>Stopfen (fest)</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 07</td><td>Wird zum Versiegeln der rotierenden Trommel</td></tr><tr><td>verwendet Kulturflaschen</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC 03/BTC 04</td><td>Entweder Glasflaschen (klein) BTC 03 oder Glasflaschen (groß) BTC 04</td></tr><tr><td>D(+)-Glukose-Monohydrat</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamantmesser</td><td>Fine Science Tools</td><td>10100-30/45</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Manometer</td><td>Shanghai Benxu Electronics Technology Co. Ltd</td><td>BX-DPG80</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Biologische Industrie</td><td>04-013-1A</td><td></td></tr><tr><td>Gasregelungsmodul</td><td>Arad Technologies</td><td>HannaLab1</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050061</td><td>Glutamin</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgische Pinzette (Dumont #5, #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (Glas)</td><td>Hilgenberg</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (Kunststoff)</td><td>Alexred</td><td>SO P12201</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (60 mm und 100 mm)</td><td>Falcon</td><td>351007/351029</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Inkubatorsystem</td><td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td><td>BTC01</td><td>BTC01 Modell mit Gas-Bubbler-Kit</td></tr><tr><td>Pro-Gerinnungsmittel sterile Reagenzgläser (5 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#456005</td><td></td></tr><tr><td>Serum für ganze Embryokulturen für Ratten</td><td>ENVIGO Bioproducts</td><td>B-4520</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopisches Mikroskop mit Heizplatte</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritzen (5, 10 ml) für die Serenfiltration</td><td>Pic Solution</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere Fine</td><td>Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero kultur von mausembryonen von der prägastrulation bis zur fortgeschrittenen organogenese

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantations-Säugetier-Embryo-Kulturmethoden waren im Allgemeinen ineffizient und auf kurze Zeiträume nach der Dissektion aus der Gebärmutter beschränkt. Vor kurzem wurden Plattformen für eine sehr robuste und verlängerte Ex-utero-Kultur von Mausembryonen von Ei-Zylinder-Stadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese entwickelt. Diese Plattformen ermöglichen eine angemessene und getreue Entwicklung von prägastrulierenden Embryonen (E5.5) bis zur Bildung der hinteren Gliedmaßen (E11). Spätgastrulierende Embryonen (E7.5) werden in diesen Umgebungen in rotierenden Flaschen gezüchtet, während eine erweiterte Kultur aus Vorgastrulationsstadien (E5.5 oder E6.5) eine Kombination aus statischen und rotierenden Flaschenkulturen erfordert. Darüber hinaus sind eine empfindliche Regulierung der O2 - und CO2-Konzentration , des Gasdrucks, des Glukosespiegels und der Verwendung eines spezifischen Ex-utero-Kulturmediums entscheidend für die ordnungsgemäße Embryonalentwicklung. Hier wird ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für die erweiterte Ex-utero-Mausembryokultur bereitgestellt. Die Fähigkeit, normale Mausembryonen ex utero von der Gastrulation bis zur Organogenese zu züchten, stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die Wirkung verschiedener experimenteller Störungen während der Embryonalentwicklung zu charakterisieren.

Die für E7.5-Embryonen beschriebenen Walzenkulturbedingungen (Spätgastrulationsstadium) unterstützen ein konstantes und normales Embryowachstum mit einer durchschnittlichen Effizienz von fast 75% nach 4 Kulturtagen (Abbildung 2 und Tabelle 1). Die Effizienz der Embryonalentwicklung kann je nach genetischem Hintergrund der Maus variieren, ist aber durchweg robust (Abbildung 2C). Die Supplementierung mit HBS anstelle von HCS ergibt eine Effizienz ...

Eine verbesserte Plattform für die Kultur ganzer Embryonen ermöglicht eine kontinuierliche und robuste Ex-utero-Entwicklung von Postimplantations-Mausembryonen für bis zu sechs Tage, von den Vorgastrulationsstadien bis zur fortgeschrittenen Organogenese. In diesem Protokoll beschreiben wir das Standardverfahren für eine erfolgreiche Embryokultur mit statischen Platten und rotierenden Flaschensystemen.

Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Diese Methode wird grundlegend für das Verständnis der Gastrulation entlang einer Formation bei Säugetieren sein. Indem das Experimentieren mit lebenden Embryonen in Embryonalstadien ermöglicht wird, die lange Zeit in der Gebärmutter der Mutter verborgen waren. Es ermöglicht, setzt effizientes und angemessenes Wachstum von Mausembryonen außerhalb der Gebärmutter für einen längeren Zeitraum von bis zu 6 Tagen fort.Eine schnelle und adäquate Embryonendissektion und Vorgastrulation der Gaskonzentration und des Gasdrucks sind die kritischsten Schritte für ein erfolgreiches Embryonenwachstum. Um mit der Kultivierung von 7,5 Tage alten oder fortgeschritteneren Mausembryonen zu beginnen, schalten Sie den Rotator und die Heizeinheit des Rollkultur-Inkubatorsystems für mindestens 1 Stunde ein, bevor der Embryo seziert wird. Fügen Sie auch Autoklavwasser in die Gaseinlassflasche und das Auslassreagenzglas hinzu.Als nächstes schalten Sie das Gasreglermodul ein, indem Sie den Hauptschalter drücken, und verwenden Sie dann die entsprechenden Regler, um die Sauerstoff- und Kohlendioxidwerte auf 5% einzustellen Öffnen Sie den Gasregler und bewegen Sie den Spannungsschalter im Druckmessumformer, um den Gasdruck auf etwa 6,5 bis 7 Pfund pro Quadratzoll einzustellen. Bestätigen Sie den Gasdruckwert mit einem digitalen Manometer. Überwachen Sie den Gasfluss, indem Sie die Geschwindigkeit der Blasen überprüfen, die im ausgelassenen, mit Wasser gefüllten Reagenzglas entstehen, das im Präzisionsinkubator zugewiesen ist.Stellen Sie die richtige Blasenrate ein, indem Sie das Gasdurchflussventil am Deckel der Wasserflasche schließen oder öffnen. Stellen Sie sicher, dass der Gasstrom die Bildung von Blasen mit einer Geschwindigkeit von 2 bis 4 Blasen pro Sekunde ermöglicht, oder stellen Sie den Blasenfluss an der ersten Stelle ein, an der das Blubbern in das mit Wasser gefüllte Auslassrohr austritt. Als nächstes füllen Sie die Kulturflaschen mit 2 Millilitern Kulturmedium.Verwenden Sie die ausgehöhlten Silikonspäne, um die Flaschen zu versiegeln und stecken Sie sie für 1 Stunde in die ausgehöhlte rotierende Trommel für die Vorwuchtigkeit. Halten Sie die leeren Räume in der rotierenden Trommel mit den massiven Spunden abgedichtet. Als nächstes sezieren Sie die Embryonen einer eingeschläferten schwangeren weiblichen Maus.Reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol und schneiden Sie die Haut und die Bauchdecke mit einer Schere ab. Lokalisieren Sie ein Ende der Gebärmutter und schneiden Sie an der Kreuzung zwischen dem Eierstock und der Gebärmutter. Schneiden Sie weiter entlang der Gebärmutter bis zum anderen Ende und übertragen Sie sie in eine 100 Millimeter Petrischale, die mit DPBS gefüllt ist.Waschen Sie die Conceptuse schnell in DPBS und schneiden Sie sie paarweise, um die Handhabung des Embryos zu erleichtern. Bewegen Sie alle Paare von Konzepten auf ein vorgleiches Dissektionsmedium in einer 60-Millimeter-Petrischale und schneiden Sie sie dann in die einzelnen Begriffe. Als nächstes entfernen Sie mit einer groben Pinzette die Gebärmutterwand der Conceptusse, indem Sie das Gebärmuttergewebe zerreißen, und schneiden Sie dann mit einer feinen, mikrochirurgischen Pinzette die Spitze der birnenförmigen Dezidua ab.Führen Sie die Pinzette parallel zu seiner langen Achse neben den Embryo ein und öffnen Sie die Pinzette, um die Dezidua in zwei Hälften zu teilen. Greifen Sie schließlich mit einer feinen Pinzette den Embryo aus der Decidua und schälen Sie den Parietal-Eigelbsack vom Embryo, wobei der intakte Ektoplazentakegel am Eizylinder befestigt bleibt. Wählen Sie die Embryonen in der Neuralplatte oder im frühen Kopffaltenstadium, die im Epiblasten keine Schäden zeigen.5 bis 6 ausgewählte Embryonen pro Flasche in die vorgedrungenen Glaskulturflaschen überführen und die Flaschen bei 37 Grad Celsius in eine Atmosphäre von 5% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid in das rotierende Kultursystem stellen. Um Vorgastrulations- und Frühgastrulationsembryonen und statische Platten zu kultivieren, fügen Sie 250 Mikroliter frisch zubereitetes ex-utero Embryo-Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer 8-Well-Platte hinzu. Stellen Sie die Platten bei 37 Grad Celsius in einen Kohlendioxid-Inkubator für die Vorgleichgewichtung.Nachdem Sie die Embryonen wie zuvor gezeigt aus der Gebärmutter seziert haben, übertragen Sie die einzelnen Embryonen mit einer Mikropipette in jede Vertiefung der 8-Well-Platte und legen Sie die Platte mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Stellen Sie sich die Embryonen unter einem Stereomikroskop vor und wählen Sie für die Kultur nur diejenigen mit einer wohlgeformten Fruchthöhle ohne offensichtliche Schäden und ohne reichertsche Membran aus. Die in diesem Protokoll beschriebenen Rollkulturbedingungen für 7,5 Tage alte Embryonen unterstützen ein konstantes und normales Embryowachstum mit einer durchschnittlichen Effizienz von fast 75% nach 4 Kulturtagen.Die Effizienz der Embryonalentwicklung variiert je nach genetischem Hintergrund der Maus, ist aber durchweg robust. Die Supplementierung mit HBS anstelle von HCS ergibt nach 4 Tagen Kultur einen Wirkungsgrad von ca. 68%. Die Entwicklung von 6,5 Embryonen und statischen Platten wird korrekt mit einer Effizienz von mehr als 90% unter Verwendung von ex-utero Embryo-Kulturmedium mit HCS und HBS rekapituliert.Kulturen, die von vorgastrulierenden Embryonen ausgehen, zeigen eine Effizienz von 46% der richtigen Entwicklung bis zum frühen Somite-Stadium und fast 17% der Embryonen vervollständigen die richtige Entwicklung nach 6 Tagen Kultur. Die Morphogenese und Gewebeentwicklung verläuft ordnungsgemäß bis zu 42 Somiten. Repräsentative Entwicklungsdefekte, die bei Embryonen für Kulturen beobachtet wurden, die ab dem embryonalen Tag 7.5, 6.5 und 5.5 begonnen wurden, sind hier dargestellt.Embryonen mit geringer Schädigung des Epiblasten oder Embryonen, die die Reichert-Membran behalten, sollten verworfen werden. Frühe Embryonen wachsen nicht richtig oder zeigen schwere Entwicklungsverzögerungen, während die Anheftung des embryonalen Epiblasten an der Oberfläche der Platte das Versagen der weiteren Embryonalentwicklung verursacht. Die wichtigsten Anomalien, die bei defekten Embryonen beobachtet werden, sind die Entwicklung der hinteren Region außerhalb des Dottersacks oder Defekte im Wachstum der Nervenfalten.In Kulturen, die aus 5,5 Tagen alten Embryonen entwickelt wurden, werden häufig Entwicklungsdefekte beobachtet, die das Vorhandensein eines kleinen, unterentwickelten Epiblasten sind. Mit dieser Methode sind Forscher in der Lage, eine Vielzahl von physikalischen oder chemischen Manipulationen bei der Entwicklung postimplantierter Embryonen durchzuführen. Zum Beispiel Manipulation, Zelltransplantation oder Abstammungsverfolgung.Diese Methode ebnet nicht nur den Weg für die detaillierte Untersuchung der Sich entwickelnden Postimplantation von Mäusen, sondern auch für die Implementierung ähnlicher Kulturmethoden in Embryonen anderer Spezies, wie z.B. des Menschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir präsentieren eine Methode zur organotypischen Schnitten der Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für die Kultivierung und Zeitraffer-Bildgebung von peripheren Nerven Auswuchs vorzubereiten.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

Eine Methode zur direkten pharmakologischen Manipulation von Maus-Embryonen während der Neurulation, dass mütterliche Stoffwechsel umgeht beschrieben. Die Technik lässt sich an verschiedenen Aspekten der Neurulation durch Variation der Zeitpunkt und pharmakologischen Wirkstoffs zu untersuchen.

Neuralrohrschlusses in Maus Whole Embryo Culture

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Serum in Embryokulturen genutzt enthält unbekannte Komponenten, die das Ergebnis von Experimenten, vor allem in Studien mit Signal Wechselwirkungen beeinflussen können. Hier verwendeten wir eine Serum-freien Kultursystem mit Sauerstoff angereichert und zeigen, dass Mitte der Schwangerschaft Maus-Embryonen für 16-40 h kultiviert morphologische Entwicklung vergleichbar zu entwickelnden Embryonen in utero.

Maus embryonalen Entwicklung in einem Serum-freien Whole Embryo Culture-System

Wir beschreiben die Dissektion und Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut. Das Kultursystem unterhält eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche über die Gewebeoberfläche und ermöglicht die Abbildung auf einem inversen Mikroskop. Melanoblasten eine Komponente der Entwicklungs Haut, fluoreszierend markiert damit ihr Verhalten unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie beobachtet werden.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Die ex vivo aufrechte Tröpfchenkultur ist eine Alternative zu den derzeitigen in vitro und in vivo experimentellen Techniken. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen und erfordert kleinere Mengen an Reagenzien, ermöglicht aber die Manipulation und Untersuchung der fetalen Vaskularisation, Morphogenese und Organogenese.

Verwendung<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren

Wir stellen eine Methode zur Isolierung und Kultur der Maus Urnierengang (WD). Wir haben auch ein detailliertes Verfahren für ganze Berg Immunfärbung von kultivierten / frisch isolierten RDG mit fluoreszenz getaggten Antikörper nachweisen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken die Untersuchung von WD Entwicklung, Wickeln und Differenzierung.

Orgel, Kultur und Ganze Berge Immunfluoreszenzanfärbung von Maus Wolffschen Gänge

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.

Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Erfahren Sie die ex utero Kultivierung von Mausembryonen für Entwicklungsbiologie von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung früher Entwicklungsprozesse außerhalb des Uterus.

Ex Utero Kultur von Mausembryonen von der Prägastrulation bis zur fortgeschrittenen Organogenese

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