Name: Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Lernen Sie das Stichwundenverletzungsmodell im adulten optischen Tektum von Zebrafisch und Medaka kennen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Regeneration und molekularer Mechanismen im ZNS.

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Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 und 21K15195 sowie ein internes Stipendium des AIST, Japan, unterstützt.

Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology genehmigt. Zebrafische und Medaka wurden nach Standardverfahren gehalten28.
1. Stichwundenverletzung im erwachsenen optischen Tectum
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,4% (w/v) Tricain-Stammlösung für die Anästhesie vor. Für eine 100-ml-Stammlösung werden 400 mg Tricainmethansulfonat (siehe Materialtabelle) in 90 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) auf 7,0 eingestellt. Sobald der pH-Wert eingestellt ist, fügen Sie Wasser bis zu 100 ml hinzu, stellen Sie dann geeignete Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.</li>
	<li>Um den erwachsenen Zebrafisch oder Medaka zu betäuben, bereiten Sie eine 0,02 %ige (w/v) Tricain-Lösung vor, indem Sie die 0,4 %ige Tricain-Stammlösung mit Fischwasser verdünnen.</li>
	<li>Betäuben Sie den Fisch mit 0,02% iger Tricainlösung; Sie werden betäubt, wenn sie sich nicht bewegen oder auf Berührung reagieren (1-2 min).</li>
	<li>Legen Sie den betäubten Fisch auf eine Styroporschale (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-G-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden.</li>
	<li>Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie vertikal eine 30-G-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectum-Hemisphären ein (Abbildung 1A, B). Die Einstecktiefe beträgt ~0,75 mm und entspricht damit fast der halben Länge der 30-G-Fase. Diese Einstichtiefe führt aufgrund der ähnlichen Körpergröße dieser Fische zu Hirnverletzungen bei Zebrafischen und Medaka. HINWEIS: Medaka hat Schuppen auf dem Schädel. Kratzen und entfernen Sie die Schuppen mit der 30-G-Nadel, um die Stichwunde effizient und genau zu induzieren (Abbildung 1C).</li>
	<li>Bringen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischwasser und bringen Sie das Aquarium in das Fischzuchtsystem, sobald sie sich vollständig von der Narkose erholt haben. HINWEIS: Die Fische erholen sich und beginnen sich innerhalb weniger Minuten frei zu bewegen.</li>
	<li>Für die Abstammungsanalyse nach der Verletzung bereiten Sie frisches Fischwasser mit 5 mM Bromdesoxyuridin (BrdU) vor (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Fische dann mit dieser 5 mM BrdU-Lösung für eine vorbestimmte Zeitspanne13,19 (wie durch ein Versuchsdesign bestimmt). Dann sezieren Sie diese Fische gemäß Schritt 2 und bewerten Sie gegebenenfalls den BrdU-Einbau und die Identität der Zelllinie. HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für die Analyse der Zelllinie. Um BrdU-Signale zu erkennen, führen Sie den Antigenabruf wie in Schritt 4.3 gezeigt durch.</li>
</ol>2. Dissektion des Gehirns
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,02%ige Tricainlösung, eine Styroporschale zur Dissektion und eine 10-ml-Spritze mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) mit einem Verlängerungsschlauch und 30 G-Nadeln (siehe Materialtabelle) für die intrakardiale Perfusion vor.</li>
	<li>Betäuben Sie die verletzten Fische zu ausgewählten Zeitpunkten.</li>
	<li>Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale und legen Sie den betäubten Fisch auf die Papiertücher.</li>
	<li>Halten Sie den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-G-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Machen Sie einen ventralen Schnitt vom Anus zum Herzen (Abbildung 2B) und halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite dieses Organs zwei weitere 30-G-Nadeln einführen (Abbildung 2C). HINWEIS: Das Herz ist sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka mit der silbrigen Epithelschicht der Hypodermis bedeckt (Abbildung 2C).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Silberepithelschicht mit der Spitze der Pinzette (Abbildung 2D).</li>
	<li>Führen Sie die 30-G-Nadel unter Beibehaltung der Abschrägung in den Ventrikel ein und machen Sie mit der Pinzette einen Schnitt in den Vorhof (Abbildung 2E). Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um das 1x PBS zu drücken, und bestätigen Sie, dass der Vorhof das Blut gespült hat. HINWEIS: Um zu verhindern, dass die Nadel in den Ventrikel eindringt, führen Sie die Nadel vorsichtig bis zur Tiefe der halben Fase ein und stellen Sie dann die Einstichtiefe ein. Wenn die Perfusion gut ist, färben sich die Kiemen weiß (Abbildung 2F,G).</li>
	<li>Stoppen Sie die Perfusion, nachdem das Blut abgelassen wurde und die Kiemen weiß werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadeln, mit denen der Fischkörper fixiert ist, und fixieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten (Abbildung 2H). Schneiden Sie das Rückenmark ab und entfernen Sie den Schädel aus dem optischen Tectum und dem Telencephalon (Abbildung 2I). Schneiden Sie dann die Sehnerven ab und sezieren Sie das Gehirn vorsichtig. HINWEIS: Achten Sie während der Dissektion auf die Sehnerven, da die Nerven mit dem Tectum verbunden sind. Wenn der Sehnerv gezogen wird, kann das optische Tectum vom Gehirn gelöst werden. Wenn die Blutentnahme nicht abgeschlossen ist, sieht das Gehirn hellrosa aus (die rechte Gehirnhälfte in Abbildung 2J).</li>
	<li>Das Gehirn wird in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd in 1x PBS überführt und über Nacht bei 4 °C fixiert.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Tiefkühlschnitten
<ol><li>Waschen Sie die fixierten Gehirne dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Um das Gehirn zu kryoprotektieren, überführen Sie es in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 30 % (w/v) Saccharose in 1x PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Die Einbettmasse (2:1-Mischung aus OCT-Verbindung und 30 % Saccharose, siehe Materialtabelle) wird durch Kombinieren von 30 ml OCT und 15 ml 30 %iger Saccharose hergestellt. Lagern Sie diese bei 4 °C. HINWEIS: Um die Blasen aus der gemischten Masse zu entfernen, zentrifugieren Sie die 50-ml-Röhrchen bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur oder stellen Sie die Röhrchen über Nacht aufrecht auf.</li>
	<li>Inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei -80 °C, um den Kryomold (siehe Materialtabelle) unmittelbar nach dem Einbetten des präparierten Gehirns in den Kryomold mit der Einbettungsmasse zu kühlen. HINWEIS: Flüssiger Stickstoff kann auch zur Kühlung des Aluminiumblocks verwendet werden. In diesem Fall sollte der Aluminiumblock in eine Styroporbox gelegt werden, die mit genügend flüssigem Stickstoff gefüllt ist, um den Aluminiumblock kurz vor dem Einbetten abzudecken. Nachdem Sie die Flüssigstickstoffsublimation bestätigt haben, legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock. Es ist besser zu bestätigen, wie viele Kryoformen gleichzeitig auf dem Aluminiumblock platziert werden können. Es ist ratsam, flüssigen Stickstoff oder einen zusätzlichen vorgekühlten Block zu verwenden, um genügend Platz für eine schnelle Kühlung aller Proben zu gewährleisten.</li>
	<li>Legen Sie den vorgekühlten Aluminiumblock in eine Styroporbox. Verwenden Sie eine Styroporbox mit Deckel, um ein Erwärmen des Aluminiumblocks zu verhindern.</li>
	<li>Für koronale Schnitte betten Sie das Gehirn in einen Kryomold ein und passen Sie die Ausrichtung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop an (Abbildung 3A).</li>
	<li>Legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung einfrieren (Abbildung 3B). Wenn die OCT-Verbindung zu gefrieren beginnt, wird sie weiß.</li>
	<li>Tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf und montieren Sie den Kryoblock, um den Kryoblock an der Probenscheibe zu befestigen.</li>
	<li>Legen Sie die Probenscheibe in den Kryostaten und frieren Sie die OCT-Verbindung vollständig ein.</li>
	<li>Legen Sie die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.</li>
	<li>Legen Sie die Ausrichtung des Kryoblocks fest und schneiden Sie das OAT zu, um zusätzliche Bereiche zu entfernen. HINWEIS: Passen Sie die Ausrichtung der Schnittebene an, während Sie das Telencephalon schneiden. Die Klinge ist mit einem Kryostaten ausgestattet. Es ist möglich, die Ausrichtung der Schnittebene durch Ändern des Winkels des Probenkopfes anzupassen.</li>
	<li>Schneiden Sie 14 μm dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum. Lagern Sie die Objektträger bei -25 °C. HINWEIS: Die Langzeitlagerung sollte bei -80 °C erfolgen.</li>
</ol>4. Fluoreszierende Immunfärbung
<ol><li>Trockene Glasobjektträger in einem Objektträgergestell für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Objektträger in 1x PBS für 30 min bei RT waschen. Wenn eine Immunfärbung mit Anti-PCNA- oder BrdU-Antikörpern durchgeführt werden soll, fahren Sie mit Schritt 4.2 oder Schritt 4.3 fort.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml 10 mM Natriumcitrat in einem 500-ml-Becherglas vor und erwärmen Sie den Citratpuffer auf einem Heizplatten-Magnetrührer auf 85 °C, legen Sie dann die Objektträger in ein Objektträger-Färbegestell und inkubieren Sie das Gestell im Citratpuffer bei 85 °C für 30 Minuten. Um ein Kochen zu vermeiden, halten Sie die Temperatur bei etwa 85 °C. Nach der Antigenentnahme werden die Objektträger dreimal in 0,1 % Triton in 1x PBS (PBSTr) gewaschen, wobei jeder Waschgang 5 min bei RT dauert. HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA).</li>
	<li>Bereiten Sie eine 2 N HCl-Lösung vor, indem Sie 12 N HCl in destilliertem Wasser verdünnen. Zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker (siehe Materialtabelle) eine Linie als hydrophobe Barriere, um die 2 N HCl-Lösung um die Abschnitte herum zu halten.<ol><li>Legen Sie die Objektträger auf Immunfärbungsschalen und tragen Sie 200-300 μl der 2N HCl-Lösung auf. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 °C für 30 Minuten. Nach der Antigengewinnung dreimal in 0,1 % PBSTr waschen, wobei jede Wäsche 5 Minuten bei RT dauert. HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des BrdU-Antigens.</li>
	</ol></li>
	<li>Nehmen Sie die restliche Lösung auf und entfernen Sie sie mit Papiertüchern. Verwenden Sie dann einen Flüssigkeitsblocker, um eine hydrophobe Barriere zu ziehen, um die Antikörperlösung bei Bedarf um die Abschnitte herum zu halten.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger auf Tabletts und tragen Sie 200-300 μl Blockierlösung, 3% (v/v) Pferdeserum in PBSTr) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei RT.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.</li>
	<li>Bereiten Sie die Primärantikörper (siehe Materialtabelle) mit der Blockierlösung (200-300 μl Antikörperlösung für jeden Objektträger) vor. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die primäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Schalen über Nacht bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.</li>
	<li>Fluoreszierende sekundäre Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) wird mit dem Blockierungspuffer (1:500) hergestellt. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und beschatten Sie sie mit Aluminiumfolie. 1-2 h bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Schnitte dreimal 5 Minuten lang mit PBSTr bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.</li>
	<li>Hoechst-Lösung (1:500 Verdünnung in 1x PBS, siehe Materialtabelle) für die Kernfärbung vorbereiten. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die Hoechst-Lösung auf jeden Objektträger auf und decken Sie die Schalen mit Alufolie ab. 30 Minuten bei RT inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 10 min bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.</li>
	<li>Absorbieren und entfernen Sie die restlichen 1x PBS mit Papiertüchern und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern mit einem wasserlöslichen Einbettmedium (siehe Materialtabelle) für die fluoreszierende Immunfärbung. Setzen Sie langsam ein 24 x 45 mm großes Deckglas auf die Abschnitte. Bei 4 °C lagern, ohne die Objektträger dem Licht auszusetzen.</li>
	<li>Beobachten und befotografieren Sie die Schnitte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie.</li>
</ol>

<ol><li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li>
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<li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525(2020).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li>
<li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605(2017).</li>
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<li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li>
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<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li>
<li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825(2020).</li>
<li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um Stichwundverletzungen im optischen Tectum unter Verwendung einer Nadel zu induzieren, um die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach einer Hirnverletzung zu erleichtern. Nadelvermittelte Stichwunden sind eine einfache, effizient implementierte Methode, die mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden kann. Es wurden Stichwundenmodelle für verschiedene Regionen des Zebrafischgehirns...

Zebrafische (Danio rerio) haben im Vergleich zu anderen Säugetieren eine erhöhte Fähigkeit, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren 1,2,3. Um die molekularen Mechanismen, die dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, besser zu verstehen, wurden kürzlich vergleichende Analysen der Geweberegeneration mit Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt 4,5,6. Die Gehirnstrukturen bei Zebrafischen und Tetrapoden sind sehr unterschiedlich 7,8,9. Dies bedeutet, dass mehrere Hirnverletzungsmodelle mit kleinen Fischen mit ähnlichen Gehirnstrukturen und biologischen Merkmalen entwickelt wurden, um die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erleichtern, die zu dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit beitragen.
Darüber hinaus ist Medaka (Oryzias latipes) ein beliebtes Labortier mit einer geringen Kapazität für die Herz- und neuronale Regeneration10,11,12,13 im Vergleich zu Zebrafischen. Zebrafische und Medaka haben ähnliche Gehirnstrukturen und Nischen für adulte neurale Stammzellen (NSCs)14,15,16,17. Im Zebrafisch und in der Medaka umfasst das optische Tectum zwei Arten von NSCs, neuroepithelähnliche Stammzellen und radiale Gliazellen (RGCs)15,18. Eine Stichwundenverletzung für das optische Tectum von erwachsenen Zebrafischen wurde zuvor entwickelt, und dieses Modell wurde verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Gehirnregeneration bei diesen Tieren regulieren 19,20,21,22,23. Dieses junge, erwachsene Zebrafisch-Stichverletzungsmodell induzierte eine regenerative Neurogenese aus RGCs 19,24,25. Diese Stichwundenverletzung im optischen Tectum ist eine robuste und reproduzierbare Methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Wenn das gleiche Verletzungsmodell auf adulte Medaka angewendet wurde, wurde die geringe neurogene Kapazität von RGCs im Medaka Optic Tectum durch die vergleichende Analyse der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach der Verletzung13 aufgedeckt.
Stichwundenverletzungsmodelle im optischen Tectum wurden auch in Mummichog-Modellen26 entwickelt, aber Details der Tectumverletzung wurden im Vergleich zur telenzephalen Verletzung27 nicht gut dokumentiert. Die Stichwundenverletzung im optischen Tectum mit Zebrafisch und Medaka ermöglicht die Untersuchung der differentiellen zellulären Reaktionen und der Genexpression zwischen Arten mit unterschiedlicher Regenerationsfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Stichwunde im optischen Tectum mit einer Injektionsnadel durchgeführt wird. Diese Methode kann auf kleine Fische wie Zebrafische und Medaka angewendet werden. Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die histologische Analyse und die zelluläre Proliferations- und Differenzierungsanalyse mittels fluoreszierender Immunhistochemie und Kryosektionen werden hier erläutert.

<table><tbody><tr><td>10 mL Spritze</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl (pH 9,0)</td><td>NIPPON GENE</td><td>314-90381</td><td></td></tr><tr><td>30 G Nadel</td><td>Dentronics</td><td>HS-2739A</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd Phosphate Buffer Solution</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumblock</td><td></td><td></td><td>115 x 80 x 37 mm (B x T x H) hat genug Größe zum Einfrieren von 6 Kryoformen</td></tr><tr><td>Anti-BLBP</td><td>Millipore</td><td>ABN14</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-HuC</td><td>Invitrogen</td><td>A21271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-56</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Brmodeoxyuridin</td><td>Wako</td><td>023-15563</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop C1 plus</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4565</td><td>10 x 10 x 5 mm (B x T x H)</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1960<</td><td></td></tr><tr><td>em>Danio rerio WT Stämme RW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verlängerungsrohr</td><td>TERUMO</td><td>SF-ET3520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (TM) Wässriges Eindeckmedium, zur Verwendung mit fluoreszierenden Farbstoffen gefärbten Geweben</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>DUMONT</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung</td><td>Dojindo</td><td>23491-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Inkubationskammer für 10 Objektträger Dunkelorange</td><td>COSMO BIO CO., LTD.</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>MAS coat Schiebeglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>MAS-01</td><td></td></tr><tr><td>Micro Deckglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>C024451</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopie</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Normale Pferdeserum Blockierungslösung</td><td>VECTOR LABRATORIES</td><td>S-2000-20</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>83-1824</td><td></td></tr><tr><td>Oryzias latipes WT Stämme Cab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td><td>DAIDO SANGYO</td><td>PAP-S</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten, pH 7,4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Styroportablette</td><td></td><td></td><td>100 x 100 x 10 mm (B x T x H) Styroporplatte ist als Tablett erhältlich</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>30 % (w/v) Saccharose in PBS</td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>nacarai tesque</td><td>14805-24</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>04605-250</td><td></td></tr></tbody></table>

stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen tektums unter verwendung von zebrafisch und medaka zur vergleichenden analyse der regenerationsfähigkeit

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Während Zebrafische eine überlegene Fähigkeit haben, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren, hat Medaka eine geringere ZNS-Regenerationsfähigkeit. Es wurde ein Hirnverletzungsmodell im adulten optischen Tectum von Zebrafischen und Medaka entwickelt und vergleichende histologische und molekulare Analysen wurden durchgeführt, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die hohe Regenerationsfähigkeit dieses Gewebes bei diesen Fischarten regulieren. Hier wird ein Stichwundenmodell für das adulte optische Tectum unter Verwendung einer Nadel und histologischer Analysen zur Proliferation und Differenzierung der neuralen Stammzellen (NSCs) vorgestellt. Eine Nadel wurde manuell in den zentralen Bereich des optischen Tectums eingeführt, und dann wurden die Fische intrakardial perfundiert und ihre Gehirne wurden seziert. Diese Gewebe wurden dann kryosektioniert und mittels Immunfärbung gegen die entsprechenden NSC-Proliferations- und Differenzierungsmarker bewertet. Dieses Tectum-Verletzungsmodell liefert robuste und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka, so dass die NSC-Reaktionen nach einer Verletzung verglichen werden können. Diese Methode ist für kleine Teleosten wie Zebrafische, Medaka und afrikanische Killifische verfügbar und ermöglicht es uns, ihre Regenerationsfähigkeit zu vergleichen und einzigartige molekulare Mechanismen zu untersuchen.

Eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum durch Einführen der Nadel in die rechte Hemisphäre (Abbildung 1, Abbildung 4A und Abbildung 5A) induziert verschiedene zelluläre Reaktionen, einschließlich der Proliferation radialer Gliazellen (RGC) und der Bildung neugeborener Neuronen. In ähnlicher Weise wurden gealterte Populationen von Zebrafischen und Medaka verwendet, um Alterungseffekten in der regenerativen Reaktion entgegenzuw...

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Die Stichwundenverletzung ist eine mechanische Verletzungsmethode, die eine unspezifische Zellablation induziert. Diese Methode erleichtert die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach Hirnverletzungen. Nadelvermittelte Stichwundenverletzungen sind eine einfache, effizient implementierte Methode, um eine Hirnverletzung zu induzieren.Diese Methode kann mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden. Die Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen wurde anhand des Stichwundenmodells veranschaulicht. Neue Erkenntnisse über molekulare Mechanismen, die die neuronale Regeneration regulieren, tragen zur regenerativen Therapie im zentralen Nervensystem bei.Beginnen Sie damit, einen betäubten erwachsenen Zebrafisch oder Medaka auf eine Styroporschale zu legen. Befestigen Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-Gauge-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden. Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie dann vertikal eine 30-Gauge-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectumkugeln ein.Als nächstes überführen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischanlagenwasser. Sobald sich die Fische vollständig von der Anästhesie erholt haben, stellen Sie den Tank in das Zuchtsystem. Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale, um den betäubten Fisch zu platzieren.Halten Sie dann den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-Gauge-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen. Sobald der Fisch platziert ist, machen Sie einen ventralen Einschnitt vom Anus zum Herzen. Halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite zwei 30-Gauge-Nadeln einführen.Verwenden Sie dann die Spitze der Pinzette, um die Silberepithelschicht zu entfernen. Führen Sie die 30-Gauge-Nadel in den Ventrikel ein, halten Sie die Fase oben und machen Sie mit der Pinzette einen Einschnitt in den Vorhof. Als nächstes drücken Sie PBS in den Vorhof, indem Sie auf die Spritze drücken, um das Blut aus dem Vorhof zu spülen.Wenn das Blut abgelassen wird und die Kiemen weiß werden, stoppen Sie die PBS-Perfusion. Entfernen Sie später die Nadeln, mit denen der Fischkörper befestigt ist, und befestigen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten. Nachdem Sie das Rückenmark durchtrennt und den Schädel aus dem optischen Tectum und Telencephalon entfernt haben, schneiden Sie die Sehnerven durch und sezieren Sie das Gehirn.Als nächstes wird das Gehirn in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu fixieren. Nachdem Sie die fixierten Gehirne dreimal fünf Minuten lang in PBS gewaschen haben, werden die Gehirne in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Saccharose von 30 Volumenprozent in PBS als Kryoprotektivum überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Bereiten Sie die Einbettmasse vor, indem Sie 30% Saccharose mit 30 Millilitern optimaler Schnitttemperatur (OCT) kombinieren, und lagern Sie die Verbindung bei vier Grad Celsius.Um den Kryomold einmal abzukühlen, inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie den vorgekühlten Block in eine Styroporbox mit Deckel, um eine Erwärmung zu verhindern. Für koronale Schnitte betten Sie das präparierte Gehirn in einen Kryomold ein, indem Sie die Orientierung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop anpassen. Als nächstes legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung gefrieren und weiß werden.Wenn die Verbindung gefriert, tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf, bevor Sie den Kryoblock auf die Probenscheibe montieren. Durch Einsetzen der Probenscheibe in den Kryostaten frieren Sie die OCT-Verbindung ein. Legen Sie dann die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.Nachdem Sie die Ausrichtung des Kryoblocks festgelegt haben, schneiden Sie das OAT ab, um zusätzliche Bereiche zu entfernen. Schneiden Sie 14 Mikrometer dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum und lagern Sie die Objektträger bei minus 25 Grad Celsius. Die radiale Gliazellproliferation (RGC) im Hirngewebe von Zebrafischen wurde untersucht.Die meisten RGCs waren in der kontralateralen unverletzten Hemisphäre proliferierend Zellantigen-negativ. Zwei Tage nach der Verletzung wurde eine RGC-Proliferation auf der verletzten Seite des Medaka-Tectums induziert. Nach der Hirnverletzung wurden die Zelllinie und die RGC-Differenzierung mit Bromdesoxyuridin- oder BrdU-Markierung bewertet.Die repräsentative Analyse zeigt neugeborene Neuronen sieben Tage nach der Verletzung bei den verletzten Zebrafischen und Medaka. Einer der entscheidenden Schritte bei Stichwunden ist das manuelle Einführen der Nadel. Eine konsistente Verletzung ist notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.Fluoreszenzfarbstoffe sind als Wundmarker wirksam. Das Ausmaß der Fluoreszenzfarbstoffdiffusion gibt den Ort und die Tiefe der Stichwunde an. Diese Technik ist potenziell an andere kleine Fischarten angepasst, und die Anpassung an Medaka ermöglicht Vergleiche der Regenerationsfähigkeit.

stab-wound-injury-model-adult-optic-tectum-using-zebrafish-medaka-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Induktion von Netzhautdegeneration bei erwachsenen Zebrafischen mittels Laserverletzung. Der Laser zielt auf Photorezeptorzellen in der Netzhaut ab und löst den Zelltod und einen degenerativen Prozess aus. Diese Schädigung aktiviert Müller-Gliazellen (MG), was zu ihrer Dedifferenzierung in Stammzellvorläuferzellen führt, die die Regeneration der Netzhaut unterstützen.

Modellierung der Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch mit Hilfe einer fokalen Laserverletzung

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Hier stellen wir eine zuverlässige Methode vor, um die Nierenregeneration bei Erwachsenen zu untersuchen, indem eine akute Nierenschädigung durch Gentamicin-Injektion induziert wird. Wir zeigen, dass die Schädigung von der Gentamicin-Dosierung und der Umgebungstemperatur abhängt, indem wir in situ Hybridisierung verwenden, um lhx1a+ zu markieren und neue Nephrone zu entwickeln.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Hier beschreiben wir 3 Erwachsene Zebrafisch-Verletzung-Modelle und ihre kombinierte Nutzung mit immunsuppressiven medikamentösen Behandlung. Wir betreuen über Bildgebung Gewebe zu regenerieren und Mineralisierung der Knochen darin erkennen.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Schädigung der Augenoberfläche von Zebrafischen durch Abrieb, um den anschließenden Wundverschluss auf zellulärer Ebene zu beurteilen. Dieser Ansatz nutzt einen Augengrat, um das Hornhautepithel teilweise zu entfernen, und verwendet Rasterelektronenmikroskopie, um Veränderungen in der Zellmorphologie während des Wundverschlusses zu verfolgen.

Zebrafisch-Hornhautwundheilung: Von der Abrieb- bis zur Wundverschluss-Bildgebungsanalyse

Lernen Sie das Stichwundenverletzungsmodell im adulten optischen Tektum von Zebrafisch und Medaka kennen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Regeneration und molekularer Mechanismen im ZNS.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit (Video) | JoVE Journal

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

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