Name: Mikrochirurgische Fähigkeiten zur Etablierung einer permanenten Jugularvenenkanülierung bei Ratten zur seriellen Blutentnahme von oral verabreichtem Medikament (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Lernen Sie mikrochirurgische Techniken zur dauerhaften Jugularvenenkanülierung bei Ratten für serielle Blutentnahmen. Diese Methode minimiert Stress und ermöglicht präzise pharmakokinetische Studien.

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Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82003692) an R.X. Zhang unterstützt; Top-Stipendium an der Northwestern Polytechnical University für R. Miao.

Die unten beschriebenen Verfahren wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northwestern Polytechnical University (Nr. 202101117) genehmigt wurde.
1. Präoperative Vorbereitung (am Tag vor der Operation)
HINWEIS: Erforderliche Lösungen: normale Kochsalzlösung (0,9% w / v Natriumchlorid), heparinisierte Kochsalzlösung (1% w / v Heparin-Natrium), Katheterverschlusslösung, nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament (NSAID), wie Meloxicam-Lösung (2 mg / ml).
<ol><li>Lösungsvorbereitung<ol>
<li>Aliquot 200 μL vorverpackte Katheterverschlusslösung in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die Katheterverschlusslösung besteht aus heparinisierter Kochsalzlösung (0,4% v / v Heparin-Natrium), gemischt mit Glycerin (v / v, 1: 1).</li>
		<li>Mischen Sie 1 g Heparin-Natrium in 100 ml der normalen Kochsalzlösung, um 1% heparinisierte Kochsalzlösung zuzubereiten.</li>
		<li>Meloxicam in normaler Kochsalzlösung auflösen, um eine 2 mg / ml Konzentrationslösung zur postoperativen Schmerzlinderung vorzubereiten. HINWEIS: Vorbereitete heparinisierte Kochsalzlösung und Meloxicam-Lösung werden durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Alle Lösungen werden sterilisiert und für die zukünftige Verwendung bei 4 ° C gelagert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chirurgische Instrumente und Materialien<ol>
<li>Packen Sie alle sauberen chirurgischen Werkzeuge in einen Beutel und kleben Sie ihn mit einem Stück Autoklav-Sterilisationsband ab. In Abbildung 1A finden Sie die spezifischen verwendeten chirurgischen Instrumente.</li>
		<li>Autoklavieren Sie den OP-Beutel bei 121 °C für 30 min für den nächsten Tag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tierzubereitung<ol>
<li>Halten Sie vor der Operation alle männlichen Sprague-Dawley (SD) -Ratten im Standard-Tierraum mit kontrollierter Temperatur bei 22 ± 1 ° C unter. Füttern Sie sie mindestens 7 Tage lang mit dem Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum . HINWEIS: Sowohl männliche als auch weibliche Ratten können für das JVC-Modell verwendet werden, und ihr typisches Alter und Körpergewicht variieren von 9-14 Wochen bzw. 294 ± 57 g.</li>
		<li>Anästhesieren Sie die Ratte mit 3% -3,5% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff in einer Voranästhesiekammer. Stellen Sie fest, ob die Ratte durch die fehlende Reaktion auf Fußnot bewusstlos wird.</li>
		<li>Nehmen Sie die Ratte vorsichtig heraus und legen Sie die Nase der Ratte in einen Anästhesie-Nasenhalter, der 2% -2,5% Isofluran liefert.</li>
		<li>Entfernen Sie das Fell in Bauch- und Rückenlage gründlich um die rechte Schulter und den hinteren Nackenbereich mit Enthaarungscreme und einem Tierrasierer. Bringen Sie die Ratte in den Käfig zurück, damit sie am nächsten Tag operiert werden soll.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vor der Operation am Tag
<ol><li>Vorbereiten des aseptischen Arbeitsplatzes<ol>
<li>Sprühen Sie 75% medizinischen Alkohol ein, um den Operationsbereich zu desinfizieren, und legen Sie dann das Heizkissen mit einem sauberen Kissen bedeckt. Stellen Sie die LED-Lampe mit einer Kaltlichtquelle neben dem Arbeitsplatz ein.</li>
		<li>Die benötigten Lösungen (Schritt 1.1) auf Raumtemperatur vorwärmen.</li>
		<li>Füllen Sie 0,6 ml heparinisierte Kochsalzlösung und 0,15 ml Katheterverschlusslösung in zwei sterile 1,0 ml stumpf bestückte Spritzen. Entnehmen Sie 2,5 ml der normalen Kochsalzlösung mit einer sterilen 5,0 ml Spritze.</li>
		<li>Weichen Sie die Wattebällchen in 75% medizinischem Alkohol ein. Drücken Sie überschüssiges Ethanol vor dem Gebrauch aus.</li>
		<li>Wiegen und notieren Sie das Körpergewicht der Ratte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Während der Operation
<ol><li>Chirurgische Vorbereitung<ol>
<li>Tragen Sie den OP-Mantel, sterile Handschuhe und Gesichtsmaske. Öffnen Sie dann den sterilisierten chirurgischen Beutel, lassen Sie alle chirurgischen Werkzeuge in 75% medizinischem Alkohol und trocknen Sie sie vor dem Gebrauch.</li>
	</ol></li>
	<li>Jugularvenen-Isolierung HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 10 min.<ol>
<li>Anästhesieren Sie die operationsbereite und rasierte Ratte mit 3% -3,5% Isofluran, gemischt mit Sauerstoff in einer Induktionskammer, und stellen Sie fest, ob die Ratte durch die fehlende Reaktion auf Fußnot bewusstlos wird.</li>
		<li>Legen Sie die Nase der Ratte in den mit 2% -2,5% Isofluran gelieferten Rechenstück, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Subkutan injizieren (s.q.) Meloxicam Lösung in einer Dosis von 2 mg/kg. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Analgetika auswählen, die nicht mit der interessierenden Arzneimittelverbindung in der pharmakokinetischen Studie interagieren.</li>
		<li>Halten Sie mit Klebeband die Unterarme der Ratte in ihrer Bauchlage zu jeder Seite der chirurgischen Plattform fest.</li>
		<li>Schrubben Sie den Operationsbereich vorsichtig, indem Sie zwischen Wattebällchen, die mit 75% medizinischem Alkohol getränkt sind, und Jod-basiertem Peeling für insgesamt drei Mal wechseln.</li>
		<li>Heben Sie die Haut vorsichtig in der Nähe des Schlüsselbeins auf der rechten Seite der Mittellinie des Halses mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in Richtung Brust von etwa 1,5-2,0 cm Länge.</li>
		<li>Sezieren Sie die dünne Gewebehülle stumpf mit einer Irisschere, um die darunter liegende Halsvene freizulegen. Das proximale cephalische Ende der Vena jugularis external besteht aus zwei Ästen, die visuell identifiziert werden können. HINWEIS: Je nach Alter und Geschlecht der Ratte variiert das Weichgewebe (z. B. Speicheldrüsen, Lymphknoten und Fettgewebe), das die Halsvene bedeckt. Im Vergleich zu den jungen Ratten sind die alten Ratten dicker (z.B. BW > 300 g) und benötigen daher mehr Gewebetrennung, bevor die Halsvene sichtbar wird.</li>
		<li>Heben Sie die Vena jugularis zusammen mit ihrem Bindemembrangewebe an, um die Lymphdrüse zu visualisieren, die an der Vena jugularis befestigt ist. Trennen Sie die Vene vorsichtig entlang der Gefäßrichtung von den umliegenden Muskeln, Fett und anderen Geweben.</li>
		<li>Stoßen Sie die Pinzette unter die Vena jugularis, ohne die Kollateralblutgefäße zu beschädigen, und führen Sie zwei Stücke 6-0-Naht unter die Vene, um die beiden Enden des Blutgefäßes einzeln zu markieren.</li>
		<li>Ziehen Sie ein Stück der Naht so weit wie möglich in Richtung Rattenkopf und ligiieren Sie die Vene mit 2-3 Knoten mit einer Pinzette schädelnd.</li>
		<li>Legen Sie die zweite Ligatur auf das kaudale Ende der Vene mit 1 losen Knoten.</li>
	</ol></li>
	<li>Jugularvenen-Kanülierung HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 15 min.<ol>
<li>Öffnen Sie die Packung mit dem 11 cm Polyurethan (PU)-Katheter (I.D. 0,6 mm x O.D. 0,9 mm, Abbildung 1B) und befestigen Sie den Katheter an der vorbereiteten stumpf bestückten Spritze, die mit der heparinisierten Kochsalzlösung gefüllt ist.</li>
		<li>Drücken Sie die heparinisierte Kochsalzlösung langsam in den Katheter, um Luftblasen zu vermeiden.</li>
		<li>Stoßen Sie die flache Seite der Pinzette ohne Spitze unter die Vena jugularis an, um auf der anderen Seite auszutreten. Machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt auf der Vene in der Nähe der Schädelbindung mit einer Castroviejo-Mikroschere und öffnen Sie den Schnitt vorsichtig mit der Spitze der Ellenbogengefäß-Dilatatorzange. HINWEIS: Spülen Sie den Schnitt mit vorgewärmter normaler Kochsalzlösung (37 ° C) ab, wenn eine kleine Menge Blut austritt.</li>
		<li>Schneiden Sie die schräge Öffnung des vorderen Endes des Halsvenenkatheters aus. Klemmen Sie das schräge Ende des Rohres mit einer Pinzette ein und schieben Sie es in die Halsvene. HINWEIS: Dieser Schritt erfordert möglicherweise eine andere Person, um das Schieben des Katheters zu erleichtern.</li>
		<li>Während Sie den Katheter vorrücken, ziehen Sie langsam die mikrochirurgische Zange des Ellenbogens zurück und klemmen Sie die Außenfläche des Gefäßes mit einer Pinzette ein. HINWEIS: Wenn das richtige Blutgefäß ausgewählt und die Spitze des Katheters erfolgreich in das Blutgefäß geschoben wird, sollte der gesamte Kathetereinführungsprozess keinen Strömungswiderstand spüren.</li>
		<li>Beenden Sie das Einsetzen des Katheters, wenn Sie die erste blaue Markierung des PU-Röhrchens treffen (Abbildung 1B), das etwa 3,0 cm lang ist.</li>
		<li>Befestigen Sie den eingeführten Katheter mit einer Pinzette sowohl mit kaudalen als auch mit rostralen Ligaturen an der Vene.</li>
		<li>Eine 6-0-Naht mit einer Nahtnadel (1/2 gebogener Schnitt, 12 mm) durch das freiliegende Gewebe auf der rechten Seite des Schnitts fädeln und die Ligatur mit einem Hämostat binden.</li>
		<li>Biegen Sie den Katheter an der zweiten blauen Markierung (Abbildung 1B), um mit der gleichen Ligatur zu binden (in Schritt 3.3.8) und um zu vermeiden, dass der PU-Schlauch verdeckt wird.</li>
		<li>Schneiden Sie den gesamten zusätzlichen Nahtfaden ab und schließen Sie den Katheter, indem Sie die stumpfe Spritze mit Spitze durch einen 22-G-Edelstahlstopfen ersetzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Katheter-Exteriorisation HINWEIS: Die geschätzte Betriebszeit für dieses Teil beträgt 10 min.<ol>
<li>Legen Sie die Ratte in die Rückenposition und reinigen Sie den Bereich zwischen den Schulterblättern vorsichtig mit dem Wattebausch, der mit 75% medizinischem Alkohol getränkt ist.</li>
		<li>Machen Sie einen sehr kleinen Schnitt in der Mitte des Rückenhalses mit einer chirurgischen Schere. Durch den dorsalen Schnitt führen und drücken Sie den Trochar unter der Haut sanft in Richtung des ventralen Schnitts auf der rechten Seite des Halses.</li>
		<li>Setzen Sie den Venenkatheter in den Trochar und ziehen Sie ihn dann heraus und führen Sie den Venenkatheter zum dorsalen Schnitt.</li>
		<li>Befestigen Sie den äußeren Katheter auf die gleiche Weise wie die Naht in die Muskelschicht (siehe Verfahren in den Schritten 3.3.8 und 3.3.9).</li>
		<li>Schließen Sie die Hautschicht von ventralen und dorsalen Schnitten mit der 6-0 Nylonnaht und Nahtnadel (3/8 gebogener Schnitt, 17 mm). Alle chirurgischen Schnitte mit Iodophor abtupfen. HINWEIS: Die Wundclips sind eine alternative Methode, um den Hautschnitt zu schließen.</li>
		<li>Entfernen Sie den Katheterstopfen, indem Sie den Katheter mit den Fingerspitzen umklammern. Legen Sie eine neue stumpfe Spritze und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um den Blutfluss zu testen. HINWEIS: Da sich die Ratte in Rückenlage befindet, kann es sein, dass man keine Blutproben erhalten kann. Blutproben konnten durch Wechsel in eine seitliche Körperposition gewonnen werden.</li>
		<li>Halten Sie den Katheter erneut mit den Fingerspitzen und injizieren Sie 0,2 ml heparinisierte Kochsalzlösung und 0,1 ml Sperrlösung mit der stumpfen Spritze in den Katheter.</li>
		<li>Halten Sie den Katheter mit den Fingerspitzen fest und ersetzen Sie die Spritze durch einen Edelstahlstecker. Lösen Sie den Katheter und drücken Sie den Stecker leicht hinein, um die Dichtigkeit des Katheters zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Sofortige postoperative Versorgung
<ol><li>Holen Sie die Ratte in der Position des dorsalen Dekubitus zurück, indem Sie sie einzeln mit frischer Maiskolbeneinstreu einsperren. Stellen Sie häufig ein temperaturgeregeltes Heizkissen zur Verfügung, um die Körperkerntemperatur aufrechtzuerhalten. HINWEIS: Für das Tierwohl ist das Belassen von Nahrung und Wasser auf der Bettwäsche ein wirksamer Weg, um die Schmerzen zu lindern, die durch Nackenbewegungen beim Essen und Trinken verursacht werden.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Endzeit der Operation auf und überwachen Sie die Ratte in 2-Stunden-Intervallen für mindestens 4 Stunden. Sorgen Sie für zusätzliche Analgesie für die Genesung, wenn die Ratte Anzeichen von Schmerzen oder Leiden zeigt.</li>
</ol>5. Physiologische und hämatologische Überwachung während der Erholungsphase
<ol><li>Überwachen Sie täglich das Körpergewicht und die Nahrungs- und Wasseraufnahme und zeichnen Sie die Daten auf.</li>
	<li>Um eine kleine Menge frisches Blut für den hämatologischen Test zu sammeln, legen Sie die Ratte in einen Rückhaltegurt. Öffnen Sie den Stecker und führen Sie die Spritze in den venösen PU-Katheter ein, um sicherzustellen, dass der Katheter nicht verstopft wird. HINWEIS: Die Blutentnahme wurde täglich zur gleichen Zeit an 6 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.</li>
	<li>Entsorgen Sie das anfänglich entnommene Blut, das eine Mischung aus Blut, heparinisierter Kochsalzlösung und Katheterverschlusslösung enthält.</li>
	<li>Verwenden Sie eine neue Spritze, um 150 μL frische Blutprobe zu sammeln und die Blutprobe in das 0,5 ml Röhrchen zu übertragen, das K2EDTA (1,8 mg / ml Blut) enthält, das an der Röhrenwand getrocknet ist. HINWEIS: Wenn der Katheter blockiert ist, können 0,2 ml heparinisierte Kochsalzlösung in den Katheter injiziert werden, um den Katheter einige Minuten vor der nächsten Blutentnahmezeit zu spülen.</li>
	<li>Injizieren Sie sterile Kochsalzlösung im gleichen Volumen, um das entnommene Blut auszugleichen. Injizieren Sie 150 μL vorgewärmte normale Kochsalzlösung (37 °C) und infundieren Sie 0,2 ml sterile heparinisierte normale Kochsalzlösung durch den Katheter.</li>
	<li>Injizieren Sie 100 μL der Verschlusslösung in den Katheter, um die Versiegelung und Sterilität des Katheters vor der nächsten Probenentnahme sicherzustellen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Blutproben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme mit einem automatisierten Blutzellzähler.</li>
</ol>6. Wiederholte Blutentnahme für pharmakokinetische Studien des oral verabreichten Arzneimittels
HINWEIS: Es wird empfohlen, Ratten mit einer Gewichtszunahme >10 g und einem stabilen hämatologischen Niveau für zukünftige Studien aufzunehmen. Nach dem aktuellen Protokoll benötigten die JVC-Ratten 4 bis 6 Tage, um sich zu erholen.
<ol><li>Nach 4-6 Tagen der Operation fasten Sie die Ratte für 12 h mit freiem Zugang zu Wasser. HINWEIS: Je nach Versuchsziel ist das Fasten des Tieres optional.</li>
	<li>Oral wird die gefastete Ratte mit natürlichem Phenol bioaktiver Ellagsäure in einer Dosis von 6 mg/kg mit einer geraden Gavage-Nadel16 untersucht.</li>
	<li>Sammeln Sie 200 μL Blutproben in den heparinisierten Röhrchen über die Venenkanüle jugularis zu vorbestimmten Zeitpunkten über 24 h postorale Verabreichung. Der Blutentnahmeprozess folgt dem Verfahren in Schritt 5.5. HINWEIS: Der Katheter muss nicht mit der Verriegelungslösung verschlossen werden, bis die Blutentnahme abgeschlossen ist.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Blutprobe sofort bei 3000 x g bei 4 °C für 10 min.</li>
	<li>Analysieren Sie die extrahierte Plasmaprobe mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie17,18.</li>
</ol>

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<li>He, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+reference+intervals+of+hematologic+and+biochemical+analytes+in+Sprague-Dawley+rats+using+the+nonparametric+rank+percentile+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sex-specific reference intervals of hematologic and biochemical analytes in Sprague-Dawley rats using the nonparametric rank percentile method.</a> PLoS One. 12 (12), 18(2017).</li>
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<li>Ludwig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+cytochrome+P-450+3A4-catalyzed+meloxicam+5+%27-methylhydroxylation+by+quinidine+and+hydroquinidine+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Activation of human cytochrome P-450 3A4-catalyzed meloxicam 5 '-methylhydroxylation by quinidine and hydroquinidine in vitro.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 290 (1), 1-8 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Beherrschung der Technik der Schiffskanülierung erfordert erhebliche Übung und das Lernen der Lektion aus jeder Operation. Christakis et al. fanden unter Verwendung der kumulativen Summenanalyse (CUSUM) heraus, dass ein Forscher 200 Ratten über einen Zeitraum von einem Jahr üben muss, bevor er für die PK-Bewertung von Arzneimittelkandidatenbereit ist 20. Die für die Venenkanülierung erforderliche Betriebszeit kann jedoch durch die Anzahl der durchgeführten Rattenum 13,20</sup...

Die wiederholte Erfassung von Blutproben von kleinen Labortieren wie Nagetieren, Meerschweinchen und Kaninchen ist ein wichtiger Aspekt für die pharmazeutische Bleioptimierung und auch für die Reduzierung der Anzahl der in der Forschung verwendeten Tiere 1,2. Die Pipeline für die Entwicklung neuer diagnostischer Instrumente und Arzneimittelformulierungen (z. B. Impfstoff) erfordert Zugang zu verschiedenen Blutmengen, um ihre Robustheit und Leistung in vivo zu bewerten, wie Pharmakokinetik (PK), Toxizität und Empfindlichkeit 3,4,5.
Der Laboransatz zur Blutprobenentnahme wird grob in zwei Arten eingeteilt, chirurgische und nicht-chirurgische6. Der nicht-chirurgische Ansatz ist für den Forscher relativ leicht zu verstehen, der gängige Techniken wie Herzpunktion, Orbitalinuspunktion und Blutung der Samphenus- und Schwanzvene umfasst. Eine mehrfache Blutentnahme ist durch einige nicht-chirurgische Methoden möglich, aber das Probenvolumen ist klein und kann zu körperlichen Wunden und psychischen Belastungen für die Tiere führen1. Auf der anderen Seite ist der chirurgische Ansatz eine beliebte Alternative zur wiederholten Venenpunktion und beinhaltet das Einsetzen einer temporären oder permanenten Kanüle in die Blutgefäße von Tieren 7,8,9. Das große Blutvolumen konnte bei bewussten Ratten wiederholt durch die Kanüle entnommen werden, wobei Stress und Schmerzen aufgrund der Handhabungstechnik, der Zurückhaltung und der Anästhesie vermiedenwurden 7,8,10,11. Die Kanülenimplantation erfordert jedoch einen erfahrenen Forscher mit ausreichender Ausbildung, um das Blut erfolgreich zu sammeln.
Die Blutentnahme durch Jugularvenenkanülierung (JVC) bei Ratten ist die am weitesten verbreitete Methode zur Untersuchung des Arzneimittels PK 6,10,12,13. Die Etablierung des JVC-Rattenmodells erfordert jedoch eine sorgfältige Praxis mikrochirurgischer Fähigkeiten und Kenntnisse der postoperativen Versorgung und Wartung. Insbesondere nach der Operation benötigt die Ratte die Verabreichung von Analgetika und eine ausreichende Erholungszeit, um einen stabilen physiologischen Zustand für weitere Experimente zu erreichen13,14,15. Obwohl die Körpergewichtszunahme (d.h. >10 g) ein gültiger und häufig angewendeter Indikator für die Genesung der Ratte ist, ist es nicht ungewöhnlich, dass die Ratten postoperativ aufgrund von Dehydrierung, Infektion und Entzündung einen unerwarteten Tod haben, was zu Beginn subtil sein könnte14,15. Darüber hinaus bleibt die Katheterobstruktion im JVC-Modell ein Problem während der Blutentnahme.
Das vorliegende Protokoll hat detailliert die mikrochirurgischen Verfahren für JVC bei einer anästhesierten Ratte mit besonderem Schwerpunkt auf der Identifizierung, Isolierung und Kanülierung der Vena jugularis demonstriert. Die Bedeutung der physiologischen und hämatologischen Überwachung der Ratten während der Erholungsphase wird hervorgehoben. Schließlich wurden serielle Blutproben durch den Venenkatheter entnommen, um die PK der oral verabreichten natürlichen Phenolelagsäure mit schlechter Bioverfügbarkeit (d. h. niedriger systemischer Konzentration) zu untersuchen, um das JVC-Rattenmodell zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td>0,5 ml Reagenzglas mit EDTA-Antikoagulans</td><td>Xinkang</td><td>N/A</td><td>Entnahme von Blutproben für den hämatologischen Test</td></tr><tr><td>0,5*20 mm 1,0 ml Spritze</td><td>KLMEDICAL</td><td>N/A</td><td>Waschen oder Ersetzen der Flüssigkeit durch Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>0,6*28,5 mm 5,0 ml Spritze</td><td>HD</td><td>N/A</td><td>Subkutane Injektion</td></tr><tr><td>1,0 ml Spritze mit stumpfer Spitze (22G)</td><td>skillsmodel</td><td>S4-PKT22G</td><td>Injizieren Sie die Kochsalzlösung und entnehmen Sie Blutproben durch den Katheter</td></tr><tr><td>1,5 ml steriles Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td>Lagern Sie sterile Katheterverschlusslösung, heparinisierte Kochsalzlösung und Meloxicam-Lösung</td></tr><tr><td>1,5&nbsp; mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Blutentnahme</td></tr><tr><td>1/2&nbsp; Kreisschnitt 5*12 mm Nahtnadel</td><td>FähigkeitenModell</td><td>S4-FHZ</td><td>Faden Sie die Muskelschicht ein, um den Katheter zu fixieren</td></tr><tr><td>3/8 Kreisschnitt 7*17 mm Nahtnadel</td><td>FähigkeitenModell</td><td>S5-FHZ</td><td>Naht den Schnitt der Rattenrinde</td></tr><tr><td>6-0 steriler nicht resorbierbarer Seidennahtfaden</td><td>JUNSHENG</td><td>N/A</td><td>Ligatur</td></tr><tr><td>75% medizinischer Alkohol</td><td>HONGSONG</td><td>N/A</td><td>Desinfektion</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>LIUTAI</td><td>N/A</td><td>Positionierung der Ratte</td></tr><tr><td>Autoklav Sterilisationsband</td><td>Biosharp</td><td>BS-QT-028</td><td>Sterilisierte Gegenstände markieren</td></tr><tr><td>Automatisierter Blutkörperchenzähler</td><td>Sysmex</td><td>XN-550</td><td>Hämatologie-Test</td></tr><tr><td>Castroviejo Mikroschere</td><td>FähigkeitenModell</td><td>WA1010</td><td>Schneiden Sie die Öffnung im Blutgefäß</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002402</td><td>Plasmavorbereitung</td></tr><tr><td>Sauberes Kissen</td><td>Qingjie</td><td>N/A</td><td>Bereiten Sie den Operationsbereich vor</td></tr><tr><td>Wattebäusche</td><td>HC</td><td>N/A</td><td>Wunddesinfektion und</td></tr><tr><td>Sterilisation Wattestäbchen</td><td>BEITAGOGO</td><td>N/A</td><td>Desinfektion</td></tr><tr><td>Gebogenes Hämostat</td><td>FertigkeitenModell</td><td>N/A</td><td>Ligatur</td></tr><tr><td>DN50 Ratten-Fixierapparat aus Edelstahl</td><td>FertigkeitenModell</td><td>S4-RGDQ1</td><td>Beschränken Sie die Bewegung von Ratten für eine einfache Bedienung</td></tr><tr><td>Ellagsäure</td><td>Aladdin</td><td>E102710-25 g</td><td>natürliches Phenol zur oralen Verabreichung</td></tr><tr>Halb<td>gekrümmte Zange</td><td>FertigkeitenModell</td><td>53072</td><td>Heben Sie die Muskelschicht und das Gewebe an, isolieren Sie die Halsvene und binden Sie die Naht</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Warm Mate</td><td>N/A</td><td>verhindert Wärmeverlust von Tieren</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Solarbio</td><td>H8060</td><td>Antikoagulans</td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Xidebao</td><td>N/A</td><td>Reinigen Sie die Wunde</td></tr><tr><td>Iris Schere</td><td>FähigkeitenModell</td><td>54002</td><td>Bluent Trennung der Muskelschicht</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD</td><td>R510-22-16</td><td>Anästhesie-LED-Lampe</td></tr><tr><td></td><td>EMPERORFEEL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VQF01-20001/ TSQ02-10002</td><td>Nachweis der Wirkstoffkonzentration im Plasma</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Hongqiang</td><td>N/A</td><td>Analgetisch</td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung</td><td>KL</td><td>N/A</td><td>Bereiten Sie die Lösung vor und schützen Sie die Blutgefäße vor dem Austrocknen</td></tr><tr><td>Haustierrasierer</td><td>Codos</td><td>3180</td><td>Rasieren des Fells</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ZHHC</td><td>PW012</td><td>Zubereitung von Ellagsäurelösung</td></tr><tr><td>PU-Katheter FähigkeitenModell</td><td>RJVC-PU</td><td>Kanülierung von Jugularvenen</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesiekonsole für Kleintieroperationen</td><td>RWD</td><td>68620</td><td>Operationsarbeitsplatz</td></tr><tr><td>Sprühflasche</td><td>Sonstige</td><td>N/A</td><td>aseptische Arbeitsstation</td></tr><tr><td>Edelstahlstopfen (22G)</td><td>skillsmodel</td><td>S4-PKD22G</td><td>Verstopfen Sie den Katheter, um seine Abdichtung zu gewährleisten</td></tr><tr><td>Trochar aus</td><td>rostfreiem StahlModell</td><td>S$-PKDGZ</td><td>Führen Sie den Katheter an die Außenseite</td></tr><tr><td>Sterile Verriegelung</td><td>LösungsfähigkeitenModell</td><td>SK-FB</td><td>Verriegeln Sie den Katheter, um seine Sterilität zu gewährleisten</td></tr><tr><td>Fertigkeiten mit gerader Zuführnadel</td><td>Modell</td><td>N/A</td><td>Mundsonde</td></tr><tr><td>Chirurgischer Beutel</td><td>BKMAM</td><td>N/A</td><td>Behälter für die Sterilisation von chirurgischen Instrumenten</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>FertigkeitenModell</td><td>J21070</td><td>Schnitt Schnitt auf Rattenhaut</td></tr><tr><td>Gefäßdilatator ausbalancierte</td><td>Zange FertigkeitenModell</td><td>WA3020</td><td>Erweitern Sie das Blutgefäß und führen Sie die Kanüle zum Gleiten</td></tr><tr><td>ZS-MV Anästhesiegerät für Kleintiere</td><td>ZSLab</td><td>1057003 Einleitung</td><td>und Aufrechterhaltung der Anästhesie</td></tr></tbody></table>

mikrochirurgische fähigkeiten zur etablierung einer permanenten jugularvenenkanülierung bei ratten zur seriellen blutentnahme von oral verabreichtem medikament

Microsurgical Skills of Establishing Permanent Jugular Vein Cannulation in Rats for Serial Blood Sampling of Orally Administered Drug

Die Blutentnahme bei kleinen Labortieren ist für die pharmazeutische Leitlinienoptimierung notwendig, kann aber Versuchstieren großen Schaden und Stress zufügen, was sich möglicherweise auf die Ergebnisse auswirken könnte. Die Jugularvenenkanülierung (JVC) bei Ratten ist ein weit verbreitetes Modell für die wiederholte Blutentnahme, erfordert jedoch eine angemessene Ausbildung der chirurgischen Fähigkeiten und der Tierpflege. Dieser Artikel beschreibt die mikrochirurgischen Verfahren zur Etablierung und Aufrechterhaltung eines permanenten JVC-Rattenmodells mit besonderem Schwerpunkt auf der Platzierung und Versiegelung der Jugularkanüle. Die Bedeutung der Überwachung physiologischer (z. B. Körpergewicht, Nahrung und Wasseraufnahme) und hämatologische Parameter wurde mit Ergebnissen hervorgehoben, die 6 Tage nach der Operation während der Genesung der Ratte präsentiert wurden. Das Wirkstoff-Plasma-Konzentrations-Zeit-Profil der oral verabreichten natürlichen Phenol-Ellagsäure wurde im JVC-Rattenmodell bestimmt.

Dieses Protokoll hat gründlich gezeigt, wie man ein langfristiges JVC-Modell unter Verwendung mikrochirurgischer Fähigkeiten für die serielle Blutentnahme etabliert. Abbildung 1A zeigt die wesentlichen chirurgischen Instrumente und Materialien, die für die Durchführung der Operation verwendet werden. Die Spezifikation des PU-Katheters mit drei blauen Markierungen wird ebenfalls veranschaulicht, was hilfreich ist, um den Forscher in Schritt 3.3 zu führen, wie die Markierungen auf dem...

Detaillierte mikrochirurgische Techniken werden demonstriert, um ein längerfristiges Jugularvenen-Kanülvenen-Rattenmodell für die sequentielle Blutentnahme im selben Tier zu etablieren. Physiologische und hämatologische Parameter wurden während der Erholungsphase der Ratte überwacht. Dieses Modell wurde angewendet, um die Pharmakokinetik von oral verabreichtem Polyphenol zu untersuchen, ohne Tierstress zu induzieren.

Mikrochirurgische Fähigkeiten zur Etablierung einer permanenten Jugularvenenkanülierung bei Ratten zur seriellen Blutentnahme von oral verabreichtem Medikament

Blood sampling in small laboratory animals is necessary for pharmaceutical lead optimization but can cause great harm and stress to experimental animals, ...

Die wiederholte Blutentnahme des kleinen Labortieres ist ein wichtiger Aspekt der pharmazeutischen Bleioptimierung. Dieses Protokoll beschreibt die mikrochirurgischen Fähigkeiten, um ein permanentes Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell zu etablieren. Diese Technik kann effizient ein Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell etablieren und bei bewussten Ratten wiederholt Blutproben durch die Kanüle sammeln, während Stress und Schmerzen vermieden werden.Es ist wichtig, die Vena jugularis und ihre Kanülierung zu lokalisieren, da die visuelle Demonstration der anatomischen Komplexität für dieses Modell nicht verfügbar ist. Bereiten Sie zunächst die aseptische Workstation mit 75% medizinischem Alkohol vor und betäuben Sie dann die rasierte Ratte mit Isofluran, gemischt mit Sauerstoff. Subkutan injizieren Sie Meloxicam-Lösung in einer Dosis von zwei Milligramm pro Kilogramm, heben Sie dann vorsichtig die Haut in der Nähe des Schlüsselbeins auf der rechten Seite der Mittellinie des Halses mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 bis 2 Zentimeter langen Schnitt in Richtung Brust.Um die untere Halsvene freizulegen, verwenden Sie eine Irisschere, um die dünne Gewebeabdeckung stumpf zu sezieren. Das proximale cephalische Ende der Vena jugularis external besteht aus zwei Ästen, die visuell identifiziert werden können. Heben Sie die Vena jugularis zusammen mit ihrem Bindemembrangewebe an, um die Lymphdrüse zu visualisieren, die an der Vena jugularis befestigt ist.Trennen Sie die Vene vorsichtig entlang der Gefäßrichtung vom umgebenden Muskel, Fett und anderen Geweben. Stoßen Sie die Pinzette unter die Vena jugularis, ohne die Kollateralblutgefäße zu beschädigen, und führen Sie zwei Stücke 6-0-Naht unter die Vene, um die beiden Enden des Blutgefäßes einzeln zu markieren. Ziehen Sie ein Stück der Naht so weit wie möglich in Richtung Rattenkopf und ligiieren Sie die Vene mit zwei bis drei Knoten mit einer Pinzette kranial.Legen Sie die zweite Ligatur mit einem losen Knoten auf das kaudale Ende der Vene. Befestigen Sie einen 11 Zentimeter langen Polyurethan- oder PU-Katheter an der vorbereiteten stumpfen Spitzenspritze, die mit der heparinisierten Kochsalzlösung gefüllt ist, und drücken Sie die heparinisierte Kochsalzlösung langsam in den Katheter, um Luftblasen zu vermeiden. Stoßen Sie die flache Seite der Pinzette ohne Spitze unter die Vena jugularis an, um auf der anderen Seite auszutreten.Machen Sie einen kleinen V-förmigen Schnitt auf der Vene in der Nähe der Schädelbindung mit einer Castroviejo-Mikroschere und öffnen Sie den Schnitt vorsichtig mit der Spitze der Ellenbogengefäß-Dilatatorzange. Schneiden Sie die schräge Öffnung des vorderen Endes des Halsvenenkatheters aus. Bepflanzen Sie das schräge Ende des Rohres mit einer Pinzette und schieben Sie es in die Halsvene.Während Sie den Katheter vorschieben, ziehen Sie langsam die mikrochirurgische Zange des Ellbogens zurück und klemmen Sie die äußere Oberfläche des Gefäßes mit einer Pinzette ein. Beenden Sie das Einsetzen des Katheters, wenn Sie die erste blaue Markierung des PU-Röhrchens treffen, das etwa drei Zentimeter lang ist. Befestigen Sie den eingeführten Katheter mit einer Pinzette sowohl mit kaudalen als auch mit rostralen Ligaturen an der Vene.Fädeln Sie eine 6-0-Naht mit einer Nahtnadel durch das freiliegende Gewebe auf der rechten Seite des Einschnitts und binden Sie die Ligatur mit einem Hämostaten. Biegen Sie dann den Katheter an der zweiten blauen Markierung, um sich mit der gleichen Ligatur zu verbinden und den PU-Schlauch nicht zu verschließen. Nachdem Sie den gesamten zusätzlichen Nahtfaden abgeschnitten haben, schließen Sie den Katheter, indem Sie die stumpfe Spritze mit Spitze durch einen 22-Gauge-Edelstahlstopfen ersetzen.Legen Sie die Ratte in die Rückenposition und reinigen Sie den Bereich zwischen dem Schulterblatt vorsichtig mit dem Wattebausch, der mit 75% medizinischem Alkohol getränkt ist. Machen Sie mit der chirurgischen Schere einen sehr kleinen Schnitt in der Mitte des Rückenhalses. Durch den dorsalen Schnitt führen und drücken Sie den Trochar unter der Haut sanft in Richtung des ventralen Schnitts auf der rechten Seite des Halses.Setzen Sie den Venenkatheter in den Trochar und ziehen Sie ihn dann heraus und führen Sie den Venenkatheter zum dorsalen Schnitt. Nachdem Sie den äußeren Katheter in der Muskelschicht gesichert haben, schließen Sie die Hautschicht der ventralen und dorsalen Schnitte mit der 6-0 Nylonnaht- und Nahtnadel und tupfen Sie alle chirurgischen Schnitte mit Iodophor ab. Entfernen Sie als Nächstes den Katheterstopfen, indem Sie den Katheter mit den Fingerspitzen umklammern.Platzieren Sie eine neue stumpfe Spitzenspritze und ziehen Sie die Spritze langsam zurück, um den Blutfluss zu testen. Halten Sie den Katheter erneut mit den Fingerspitzen fest. Injizieren Sie 0,2 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung und 0,1 Milliliter Verschlusslösung mit der stumpfen Spitzenspritze in den Katheter und ersetzen Sie dann die Spritze durch einen Edelstahlstecker.Lösen Sie den Katheter und drücken Sie den Stecker leicht ein, um die Dichtigkeit des Katheters zu gewährleisten. Um Blutproben für hämatologische Tests zu sammeln, legen Sie die Ratte in ein Rückhaltesystem, öffnen Sie den Plug und führen Sie die Spritze in den venösen PU-Katheter ein, um sicherzustellen, dass der Katheter nicht verstopft wird. Entsorgen Sie das ursprünglich entnommene Blut, das eine Mischung aus Blut, geretteter Kochsalzlösung und Katheterverschlusslösung enthält.Sammeln Sie mit einer neuen Spritze 150 Mikroliter frische Blutprobe und übertragen Sie die Blutprobe in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen, das zuvor mit K2EDTA besprüht wurde. Injizieren Sie 150 Mikroliter vorgewärmte normale Kochsalzlösung und infundieren Sie 0,2 Milliliter sterile heparinisierte normale Kochsalzlösung durch den Katheter. Injizieren Sie 100 Mikroliter der Verschlusslösung in den Katheter, um die Versiegelung und Sterilität des Katheters vor der nächsten Probenentnahme sicherzustellen.In der aktuellen Studie wurden die physiologischen und hämatologischen Zustände über sechs Tage postoperativ untersucht. Die Mehrheit der Ratten erholte sich innerhalb von vier bis sechs Tagen nach der Operation, was durch eine Körpergewichtszunahme von mehr als 10 Gramm, regelmäßige Nahrungsaufnahme, ausgewählte Blutbestandteile im Zusammenhang mit Infektionen, Dehydrierung und Entzündungen, einschließlich weißer Blutkörperchen, roter Blutkörperchen, Hämoglobin und Thrombozytenzahl, belegt wurde. So benötigten die Ratten nach dem Eingriff mindestens vier bis sechs Tage für die Genesung.Die große Wasseraufnahme deutete auf eine Austrocknung am ersten Tag nach der Operation hin. Darüber hinaus wurde die Pharmakokinetik des natürlichen Polyphenols Ellagsäure im etablierten Jugularvenen-Kanülierungsrattenmodell untersucht und die schlechte Bioverfügbarkeit der Ellagsäure durch ihre niedrige Plasmakonzentration über 24 Stunden angezeigt. Die korrekte Isolierung der Vena jugularis ist der wichtigste erste Schritt, da die in andere Weichteile eingebettete Jugularvene für den Forscher möglicherweise nicht sofort sichtbar ist.Sequenzielle Blutentnahmen innerhalb desselben Tieres können im etablierten JVC-Rattenmodell durchgeführt werden. Es ist ein nützliches und robustes Werkzeug, um die Leistung von Arzneimittelformulierungen in vivo zu bewerten.

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Mikrochirurgische Fähigkeiten zur Etablierung einer permanenten Jugularvenenkanülierung bei Ratten zur seriellen Blutentnahme von oral verabreichtem Medikament (Video) | JoVE Journal

Mikrochirurgische Fähigkeiten zur Etablierung einer permanenten Jugularvenenkanülierung bei Ratten zur seriellen Blutentnahme von oral verabreichtem Medikament

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