Mikrodissektion und Dissoziation des Murinen Eileiters: Identifizierung einzelner Segmente und Einzelzellisolierung

Verschiedene Eileitersegmente haben unterschiedliche physiologische Funktionen und sind unterschiedlich anfällig für pathologische Veränderungen. Die Identifizierung der verschiedenen Segmente in einem sehr kleinen Eileiter der Maus ist eine Herausforderung, ebenso wie die Produktion einer guten Ausbeute an gut differenzierten Zellen durch Gewebedissoziation. In diesem Video zeigen wir, wie man den Eileiter der Maus abwickelt, die verschiedenen Segmente erkennt, damit sie einzeln analysiert werden können, und schließlich, wie man eine relativ hohe Ausbeute an differenzierten dissoziierten Zellen erzeugt.

Ein besseres Verständnis der für die Ampulle spezifischen Umgebung kann die In-vitro-Fertilisationstechniken verbessern. Durch die Gegenüberstellung des Infundibulums mit anderen Segmenten können wir auch die Neigung des Infundibulums zur malignen Transformation besser verstehen. Das einzellige Dissoziationsverfahren befreit sowohl stromale als auch epitheliale Zellen aus dem Eileiter.

Unsere Methode bietet auch die Möglichkeit, die Beiträge von Immun-, Glatt- und Epithelzellen zur Physiologie und Pathologie des Eileiters separat zu analysieren. Die Arbeit unter einem Seziermikroskop kann zunächst schwierig sein. Ich würde empfehlen, mit einer größeren Röhre wie der Gebärmutter zu üben, um sicherzustellen, dass Ihre Werkzeuge für die Eileiter-Mikrodissektion ausreichend sind.

Beginnen Sie damit, ein Stück Zahnwachs mit Klebstoff auf eine Petrischale zu kleben und trocknen zu lassen. Dann desinfizieren Sie das Gericht mit 70% Ethanol. Die Oberfläche ist nun bereit für die Dissektion.

Immobilisieren Sie die Petrischale mit dem Zahnwachs auf der kalten Plattform unter einem Dissektionsmikroskop, wenn Sie zur Dissektion bereit sind. Desinfizieren Sie die ventrale Oberfläche des Tieres mit 70% Ethanol. Öffnen Sie dann die Bauch- und Beckenhöhle mit einer sterilen Dissektionsschere.

Bewegen Sie den Magen-Darm-Trakt auf eine Seite, um die dorsale bihornale Gebärmutter zu lokalisieren. Folgen Sie jedem Uterushorn rostrally, um jeden Eileiter und Eierstock zu lokalisieren, die in das Gebärmutterfettpolster direkt unter der Niere eingehüllt sind. Dann schneiden Sie beide lateralen Eileiter mit den Eierstöcken und einem Teil des distalen Uterushorns aus, der noch mit einer Dissektionsschere befestigt ist.

Schneiden Sie jedes laterale Uterushorn mit etwa ein bis zwei Zentimetern des Horns, das noch am gewundenen Eileiter und Eierstock befestigt ist. Tauchen Sie das Gewebe sofort in zwei Milliliter kaltes Dissektionsmedium und befestigen Sie dann das Uterusgewebe mit einer sterilen 25-Gauge-Nadel auf dem Zahnwachs, um das Gewebe für die Dissektion zu sichern. Reinigen und sezieren Sie das Eierstockfettpolster und das Bindegewebe, um den Eileiter deutlich sichtbar zu machen.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um ein bis zwei Tropfen sterile 1% ige Toluidin-Blaufarbstofflösung abzugeben und 30 Sekunden bis eine Minute lang zu inkubieren. Spülen Sie mit kaltem DPBS und entfernen Sie dann die gesamte Flüssigkeit. Ziehen Sie den Eierstock leicht aus dem gewundenen Eileiter.

Schneiden Sie an der Schleimbeutelmembran im breiten Band, um den Eierstock aus dem Eileiter zu entfernen, ohne das Eileitergewebe zu beeinträchtigen. Lokalisieren Sie das distale fimbriale Ende des Eileiters, das sich lateral zur Uterustubenverbindung befindet. Ziehen Sie den Schlauch vorsichtig und schneiden Sie ihn mit einer Springform-Mikroschere an der Mesosalpinx ab, um den Eileiter abzuwickeln.

Schneiden Sie die Röhre ab, um die infundibuläre Region zu erzeugen. Dann schneiden Sie den Ampullbereich aus, indem Sie zwischen den Kurven zwei und drei schneiden. Schneiden Sie schließlich den verbleibenden Teil in die Uterustubenverbindung, die die isthmische Region ist.

Frieren Sie die sezierten Gewebesegmente sofort in flüssigem Stickstoff ein und geben Sie dann 200 Mikroliter kaltes RNA-Extraktionsreagenz und eine Eins-zu-Eins-Homogenisierungsperlenmischung zur RNA-Isolierung in das Gewebe. Ausgehend von der Fimbrialregion schneiden Sie die Röhre längs mit einer Springformschere auf und verwenden Sie eine Pinzette als Hebel, um das luminale Epithel freizulegen. Zerkleinern Sie die aufgeschlitzten Teile und den restlichen Eileiter in etwa ein bis zwei Millimeter große Segmente.

Dann fügen Sie fünf Milliliter warmen nicht-enzymatischen Dissoziationspuffer zum Gewebe hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Fluoreszenz- und Phasenkontrastbilder eines Zellclusters, die für Okkludin, Kerne und acetyliertes Tubulin positiv sind, sind hier dargestellt. Rot steht für Occludin, Blau für Kerne und Grün für acetyliertes Tubulin.

Die bewimmerte apikale Grenze bleibt während des gesamten Protokolls intakt und widersteht der weiteren Verdauung einzelner Zellen. In diesen repräsentativen Bildern werden zusammengeführte, rote, blaue, Phasenkontrast- und grüne Kanäle angezeigt. Nach einer kurzen Pronase-Inkubation ist die Mehrheit der Zellen einzeln.

Die Färbung von Propidiumiodid zeigt eine Lebensfähigkeit von etwa 93% in Hellfeld, Rotkanal-PI-positiv und Merge. Inset on merge zeigt einen intakten Flimmerrand auf einer einzelnen dissoziierten Zelle. Solche Zellen haben aktiv Zilien geschlagen.

Die gesamte RNA wurde mittels Mikrovolumenspektrophotometer und Bioanalytiker auf Ausbeute und Qualität untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode 800 bis 1.200 Nanogramm RNA pro Segment liefert, mit Ausnahme von infundibulären Proben, bei denen eine Poolierung von zwei Tieren für eine angemessene Ausbeute für nachgelagerte Assays erforderlich sein kann. Die vorgestellten Ergebnisse für Infundibulum sind aus zwei Tieren gepoolt, insgesamt vier infundibuläre Regionen.

Dieses Protokoll erreicht erfolgreich reine RNA, die mit einem Mikrovolumenspektrophotometer und einem Bioanalytiker analysiert wird. Proben haben ein Absorptionsverhältnis von 260 x 280 Nanometern zwischen 1,8 und 2, typisch für reine RNA-Nukleotidspezies. Die Bioanalyse der Proben zeigte eine hohe RNA-Integrität mit einer bewerteten RNA-Integritätszahl über sieben, die für die nachgeschaltete Expression und Sequenzierungsanalyse geeignet ist.

Denken Sie daran, ein bis zwei Zentimeter des Uterushorns zu behalten, um das Tubensystem an der Sezierplattform zu befestigen. Darüber hinaus hilft die Verwendung des toluidinblauen Farbstoffs beim schnellen Abwickeln des Eileiters. Je schneller das Abwickeln, desto besser die Konservierung und die geringste Menge an RNA-Abbau.

Diese Methode ist ausreichend, um RNA von geeigneter Qualität für die RNA-Sequenzierung zu erhalten, die eine individuelle Segmentsequenzierung ermöglicht. Die Zelldissoziation eignet sich für die Einzelzellsequenzierung oder Durchflusszytometrie, die eine genauere Segment- und Zellanalyse ermöglicht. Die Methode wird dazu beitragen, das Feld über die Gesamtröhrenanalyse hinaus zu bewegen, die Unterschiede auf Segment- oder Einzelzellebene maskiert.