Name: Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter 1-13 C Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung von Pyruvatmetabolismus und kardialer Energetik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Projekt wurde von der Israel Science Foundation im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 1379/18 finanziert; das Jabotinsky-Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für angewandte und ingenieurwissenschaftliche Wissenschaften für direkte Doktoranden Nr. 3-15892 für D.S.; und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 858149 (AlternativesToGd).

Es gibt keine Offenlegungen.

Wir demonstrieren einen experimentellen Aufbau, der darauf ausgelegt ist, den hyperpolarisierten [1-13C]Pyruvatstoffwechsel, die Gewebeenergetik und den pH-Wert in einem isolierten Mausherzmodell zu untersuchen.
Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind wie folgt: 1) Sicherstellen, dass der pH-Wert des Puffers 7,4 beträgt; 2) Sicherstellung, dass alle Komponenten des Puffers enthalten sind; 3) Vermeidung der Blutgerinnung in den Herzgefäßen durch Heparin-Injektionen; 4) ...

Veränderungen des Herzstoffwechsels sind mit einer Vielzahl von Kardiomyopathien assoziiert und bilden häufig die Grundlage für die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen1. Es gibt jedoch zahlreiche Hindernisse bei der Untersuchung des Stoffwechsels in lebenden Geweben, da die meisten biochemischen Assays die Homogenisierung des Gewebes und die Zelllyse und/oder die radioaktive Rückverfolgung erfordern. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Werkzeugen zur Untersuchung des Myokardstoffwechsels in lebenden Geweben. Die Magnetresonanz (MR) von hyperpolarisierten 13C-markierten Substraten ermöglicht Echtzeitmessungen des Stoffwechsels in lebenden Geweben2 ohne den Einsatz ionisierender Strahlung, indem das MR-Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der markierten Stelle(n) um mehrere Größenordnungenerhöht wird 3. Hier beschreiben wir einen Versuchsaufbau, einen Erfassungsansatz und einen analytischen Ansatz zur Untersuchung des schnellen Stoffwechsels im isolierten Mausherz und präsentieren parallel dazu Indikatoren für die allgemeine Gewebeenergetik und den Säuregehalt. Der pH-Wert des Herzens ist ein wertvoller Indikator, da das Säure-Basen-Gleichgewicht in den frühen Stadien von Herzerkrankungen und Zuständen wie Myokardischämie, maladaptiver Hypertrophie und Herzinsuffizienz gestört ist6.
Die hyperpolarisierte Produktion von [1-13 C]lactat und [13 C]Bicarbonat aus hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat hilft bei der Bestimmung der Produktionsraten von Laktatdehydrogenase (LDH) und Pyruvatdehydrogenase (PDH). Die meisten der früheren Studien, die unter Verwendung hyperpolarisierter Substrate im isolierten Nagetierherz durchgeführt wurden, verwendeten entweder komplexe kinetische Modelle, um die enzymatische Aktivität von LDH und PDH abzuleiten, oder berichteten über die Signalintensitätsverhältnisse des hyperpolarisierten Produkts zu einem Substrat, ohne die tatsächlichen Enzymaktivitätsraten zu berechnen 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Hier haben wir den produktselektiven Sättigungsanregungsansatz 15 verwendet, der es ermöglicht, die Enzymaktivität modellfrei zu überwachen15,16. Auf diese Weise wurden die absoluten enzymatischen Raten (d.h. die Anzahl der Mol des pro Zeiteinheit produzierten Produkts) bestimmt. 31 Die P-Spektroskopie wurde verwendet, um die Signale von anorganischem Phosphat (Pi), Phosphokreatin (PCr) und Adenosintriphosphat (ATP) zu beobachten. Eine multiparametrische Analyse wurde verwendet, um die pH-Verteilung des Herzens zu charakterisieren, wie die heterogene chemische Verschiebung des Pi-Signals des Gewebes zeigt.
Das retrograd durchblutete Mausherz (Langendorff-Herz)17,18,19 ist ein Ex-vivo-Modell für das intakt schlagende Herz. In diesem Modell bleiben die Lebensfähigkeit des Herzens und der pH-Wert für mindestens 80 Minutenerhalten 20 und es hat sich ein Erholungspotenzial nach einer längeren ischämischen Verletzung gezeigt21,22. Nichtsdestotrotz kann eine unbeabsichtigte Variabilität während der Mikrochirurgie zu einer Variabilität der Gewebelebensfähigkeit zwischen den Herzen führen. Frühere Studien haben über die Verschlechterung dieses Herzens im Laufe der Zeit berichtet19; Zum Beispiel wurde eine Verringerung der kontraktilen Funktion von 5%-10% pro Stunde beobachtet18. Es wurde bereits gezeigt, dass das Adenosintriphosphat (ATP)-Signal über den energetischen Status und die Lebensfähigkeit des Myokards berichtet23. Hier stellten wir fest, dass das perfundierte Herz gelegentlich eine unbeabsichtigte Variabilität der Lebensfähigkeit aufweisen kann, wie der ATP-Gehalt zeigt, obwohl wir eine ununterbrochene Perfusion und Sauerstoffversorgung hatten. Wir zeigen hier, dass die Normalisierung der LDH- und PDH-Raten auf den ATP-Gehalt des Herzens die Inter-Herz-Variabilität in diesen Raten reduziert.
Im folgenden Protokoll beschreiben wir den chirurgischen Eingriff zur Herzkanülierung, Isolierung und anschließenden Perfusion im NMR-Spektrometer. Bemerkenswert ist, dass andere chirurgische Ansätze, die darauf abzielen, das Mausherz zu isolieren und zu perfundieren, vor24,25 beschrieben wurden.
Die Methoden zur Erfassung von Daten in Bezug auf die enzymatischen Raten im schlagenden Herzen (unter Verwendung von 13 C-Spektroskopie und hyperpolarisiertem [1-13C] Pyruvat) sowie die Lebensfähigkeit und den Säuregehalt des Herzens (unter Verwendung der 31P-NMR-Spektroskopie) werden ebenfalls beschrieben. Abschließend werden die analytischen Methoden zur Bestimmung der metabolischen Enzymaktivitäten sowie der Lebensfähigkeit und des Säuregehalts des Gewebes erläutert.

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polarisator</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3,35 T, präklinische Auflösung-DNP Hyperpolarisator</td></tr><tr><td>NMR-Spektrometer&nbsp;</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR-Würfel, 5,8 T, ausgestattet mit einer 10 mm Breitbandsonde</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturfühler</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>NMR kompatible Temperatursonde</td></tr><tr><td>Somnosuite Low-Flow-Anästhesiesystem</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitungen, Schläuche, Naht</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platingehärtete Silikonschläuche</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 I.D. 3,1 mm& nbsp;</td></tr><tr><td>Dünne Polyetheretherketon (PEEK)-Leitungen</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0,040"</td></tr><tr><td>Intravenöser Katheter&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Seidennaht</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Drahtdurchmesser von 3-0</td></tr><tr><td><stark>Chemikalien und Pharmazeutika</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]Brenztraubensäure</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Heparin-Natrium</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulin aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Gadot Group</td><td></td><td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Natrium Hydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (biotechnologische Qualität)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Titylradikal OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>NMR-Standards<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sup>13C Standardprobe</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% p-Dioxan in Benzol-D6</td></tr><tr><td>31P Standardprobe</td><td>Im eigenen Haus</td><td></td> hergestellt <td>105 mM ATP und 120 mM Phenylphosphonsäure in D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Forschung</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung des kardialen stoffwechsels im isolierten perfundierten mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 c]pyruvat- und 13c/31p-nmr-spektroskopie

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Der Stoffwechsel ist die Grundlage wichtiger Prozesse im zellulären Leben. Die Charakterisierung der Funktionsweise von Stoffwechselnetzwerken in lebenden Geweben liefert entscheidende Informationen für das Verständnis der Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren und Methoden zur Untersuchung der zellinternen Stoffwechselaktivität in einem retrograden perfundierten Mausherz in Echtzeit. Das Herz wurde in situ isoliert, in Verbindung mit einem Herzstillstand, um die Myokardischämie zu minimieren, und wurde in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR) perfundiert. Während des Spektrometers und unter kontinuierlicher Perfusion wurde dem Herzen hyperpolarisiertes [1-13 C]pyruvat verabreicht, und die anschließenden hyperpolarisierten [1-13 C]Laktat- und [13C]Bicarbonat-Produktionsraten dienten dazu, in Echtzeit die Raten der Laktatdehydrogenase- und Pyruvatdehydrogenase-Produktion zu bestimmen. Diese metabolische Aktivität von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat wurde mit NMR-Spektroskopie modellfrei unter Verwendung des produktselektiven Ansatzes zur Erfassung von Sättigungsanregungen quantifiziert. 31 Die P-Spektroskopie wurde zwischen den hyperpolarisierten Aufnahmen angewendet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu überwachen. Dieses System ist einzigartig nützlich für die Untersuchung der Stoffwechselaktivität im gesunden und kranken Mausherzen.

Die 31P-Spektren, die von einem mit KHB perfundierten Mausherz und nur vom Puffer aufgenommen wurden, sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Signale von α-, β- und γ-ATP, PCr und Pi wurden im Herzen beobachtet. Das Pi-Signal setzte sich aus zwei Hauptkomponenten zusammen: Im höheren Feld (linke Seite des Signals) war das Pi-Signal hauptsächlich auf die KHB bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen; Im unteren Feld (rechte Seite des Signals) war das Pi-Signal aufgrund der saureren Um...

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In diesem Video erfahren Sie, wie Sie hyperpolarisierte MR-Untersuchungen des perfundierten Mausherzens durchführen. David Shaul, ein MD/PhD-Student im Labor, führt Sie durch die verschiedenen Techniken und Verfahren. Heute lernen wir ein Protokoll zur Untersuchung des hyperpolarisierten Kohlenstoff-13-Pyruvat-Metabolismus in Kombination mit 31P-NMR-Spektroskopie.Der Pyruvatstoffwechsel steht an der Kreuzung von aerobem und anaerobem Stoffwechsel. Und als solches ist es von großem Wert für die Untersuchung verschiedener Zustände des Herzens. Also lasst uns loslegen.Das Mausherz wird isoliert und mit Krebs-Hensleit-Puffer in einem 10-Millimeter-NMR-Röhrchen perfundiert. Das Herz wird dann in das NMR-Spektrometer eingeführt. Dort wird ein 31P-Spektrum aufgezeichnet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu beobachten, indem die Resonanzen von Adenosintriphosphat, Phosphokreatin und anorganischem Phosphat beobachtet werden.Währenddessen wird eine Pyruvatprobe, die an erster Stelle mit Kohlenstoff-13 markiert ist, hyperpolarisiert. Und nachdem die Auflösung aufgetreten ist, wird es in das Herz injiziert, um die Messung von Laktat, anorganischen Stoffen und Pyruvat der organisierten A

investigating-cardiac-metabolism-isolated-perfused-mouse-heart-with

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Langendorff-Modus isolierten Herzen Perfusion, in Verbindung...

Beurteilung der Herzfunktion und Energetik in isolierten Maus-Herzen mit 31 P-NMR-Spektroskopie

Ziel ist es, die mitochondriale Redoxzustand isolierten Herzen im Rahmen der physiologischen und Nachlast Drücke überwachen. Ein biventrikulären arbeiten Kaninchen Herzen Modell vorgestellt. Örtlichen und zeitlichen Auflösung Fluoreszenz-Bildgebung von NADH wird verwendet, um die mitochondriale Redoxzustand Epikardgewebe überwachen.

NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Ein dynamisches Phantom mit mehreren Kompartimenten wird verwendet, um einige biologische Aspekte zu simulieren, die für Stoffwechselstudien mit hyperpolarisierten Magnetresonanzmitteln von Interesse sind.

Die Verwendung eines Mehrfach Dynamische einzelner Enzym-Phantom für Studien von hyperpolarisiertem Magnetic Resonance Agents

Das folgende Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von Puffern für die quantitative Messung der Glukose- und Fettsäureoxidationsraten im isolierten Arbeitsherz der Ratte. Die Methoden, die für die Probenanalyse und die Dateninterpretation verwendet werden, werden ebenfalls diskutiert.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Hier führen wir eine Methode zur Verwendung eines optischen Intraventrikelkatheters in durchlässigen Herzen ein, um eine Absorptionsspektroskopie über die Herzwand durchzuführen. Die gewonnenen Daten liefern robuste Informationen über die Gewebesauerstoffspannung sowie substratiennutzung und Membranpotenzial gleichzeitig mit kardialen Leistungsmessungen in dieser allgegenwärtigen Zubereitung.

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Magnetfeldabhängigkeit der Spin-Gitter-Entspannungszeit von 13C-angereicherten Verbindungen, die mittels dynamischer kernatischer Polarisation mit schneller feldzyklusweiseer Entspannungsometrie hyperpolarisiert werden. Insbesondere haben wir dies mit [1-13C]pyruvat nachgewiesen, aber das Protokoll könnte auf andere hyperpolarisierte Substrate ausgedehnt werden.

Messung der Spin-Lattice Relaxation Magnetfeldabhängigkeit von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Das folgende Protokoll beschreibt den Prozess der Isolierung, Lüftungs-und Instrumentierung Mauslungen zu stabilisieren oder pulsatile pulmonary vascular Druck-Flow-Beziehungen zu messen, um die Auswirkungen des Blutflusses, Luftstrom-, Atemwegs-Änderungen und Gefäßveränderungen am rechten Ventrikels Nachlast zu quantifizieren.

Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

Erfahren Sie die Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung von Pyruvatmetabolismus und kardialer Energetik.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter 1-13 C Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie (Video) | JoVE Journal

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und ¹³C/³¹P-NMR-Spektroskopie

Weitere Videos entdecken