Name: Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Erfahren Sie die skalierbare Produktion von humanem Huntingtin-Protein in voller Länge in HEK293-Zellen. Diese Methode liefert hochreines Protein für die Huntington-Forschung.

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Wir danken dem Department of Pharmaceutical Sciences, The State University of New York in Buffalo, für die Durchführung der MS-Analyse von HTT. Diese Arbeit war eine Zusammenarbeit mit der CHDI Foundation. Wir danken besonders Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, CHDI Foundation; und Rory Curtis, Curia, für ihren unschätzbaren Beitrag während der Vorbereitung dieses Manuskripts. Wir danken auch Michele Luche, Mithra Mahmoudi und Stephanie Fox für ihre Unterstützung dieser Forschungsbemühungen.

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<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
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<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
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<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
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<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
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<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
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<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels haben.

Wir beschreiben hier eine transiente Transfektions-, Expressions- und Reinigungsmethode zur Erzeugung mehrerer FL-HTT-Proteinkonstrukte mit geeigneter Reinheit und Homogenität für die Verwendung als Standards für die Immunoassay- und MS-Assay-Entwicklung, Kontrollen für die Western-Blot-Analyse und für Struktur-Funktions-Studien. Diese transiente Expressionsmethode ist skalierbar und vielseitig und ermöglicht es dem Anwender, geringe Milligrammmengen von FL-HTT-Varianten effizienter zu erzeugen als mit stabilen Zelllinien oder virusbasierten Methoden, die zuvorbeschrieben wurden 21,22,23,24. Routinemäßig können 2-5 mg hochgereinigtes FL HTT aus einer Proteinproduktion im 2-L-Maßstab in weniger als einer Woche mit der transienten Expressionsmethode erzeugt werden, sobald das Plasmid konstruiert ist, mit einer typischen Ausbeute von 1-2,5 mg FL HTT pro Liter Zellkultur.
Die hier beschriebene transiente Expressionsmethode überwindet viele Hindernisse in der stabilen Zelllinienexpression, wie z.B. die lange Zeit, die benötigt wird, um Zelllinien zu etablieren und Schwierigkeiten bei der Lagerung und Aufrechterhaltung stabiler Zelllinien. PEI ist auch relativ kostengünstig im Vergleich zu anderen Transfektionsreagenzien auf dem Markt, was eine groß angelegte Transfektion wirtschaftlich rentabel macht. Es gibt auch Einschränkungen im Protokoll: Die Transfektionseffizienz hängt weitgehend von der Qualität der Plasmide, dem optimalen Zellwachstum und der Art und Weise ab, wie gut PEI gespeichert und hergestellt wird. Die Betreiber müssen bei diesen kritischen Schritten besondere Vorsicht walten lassen und Qualitätskontrollen durchführen, um einen drastischen Rückgang der Proteinausbeute zu vermeiden. Das im Protokoll verwendete Anti-FLAG-Harz ist ebenfalls relativ teuer und zeigt eine reduzierte Erfassung von FL HTT nach mehreren Reinigungs- und Regenerationsvorgängen. Einige Forscher finden es möglicherweise praktischer, zu einem anderen Tag zu wechseln, um eine robustere Regeneration des Affinitätsharzes zu ermöglichen.
Verschiedene Zelllinien und Expressionsbedingungen wurden getestet, um die FL-HTT-Expressionsniveaus zu optimieren. HEK293-Zellen wurden aufgrund der hohen Proteinexpression und der einfachen Handhabung in einem Suspensionskulturformat für die Expression von FL HTT ausgewählt, wodurch die Methode für die großflächige Expression in Schüttlern oder Bioreaktoren geeignet ist. Ein höherer FL-HTT-Proteinexpressionsgrad kann bei niedrigeren Kulturtemperaturen wie 32 °C erreicht werden, anstatt die übliche Temperatur von 37 °C zu verwenden. Es ist möglich, dass die niedrigere Temperatur die Proteinsynthese verlangsamt und die korrekte Faltung von FL HTT40 fördert. Dieses Phänomen ist jedoch nicht spezifisch für FL HTT oder die getesteten Zelllinien. Die reduzierte Posttransfektionstemperatur wurde häufig in der pharmazeutischen Proteinexpression in CHO-Zellen verwendet. Obwohl der Mechanismus nicht vollständig verstanden ist, wird angenommen, dass niedrige Temperaturen den Zellzyklus in der G1-Phase stoppen und zelluläre Energie zur Proteinproduktion umleiten41.
HTT in voller Länge, das aus Säugetierzellen gereinigt wird, eluiert mit dem Chaperon Hsp7024, und Mg-ATP-Waschschritte können das Hsp70-Protein entfernen. Interessanterweise wird co-eluiertes Hsp70 nicht in FL HTT beobachtet, das aus einem Insektenzellexpressionssystem21,22,23 gereinigt wurde. Dies kann einen Unterschied in den PTMs von FL HTT oder Hitzeschockproteinantworten auf die Überexpression von FL HTT in Säugetier- und Insektenzellen widerspiegeln. Sobald das rekombinante Protein von Hsp70 befreit wurde, werden nichtionische Detergenzien wie CHAPS oder DDM benötigt, um die monomere Form von FL HTT zu stabilisieren.
Die Oligomerisierungszustände von FL-HTT-Varianten wurden mit Blue Native PAGE und SEC-MALS analysiert. Ein kleiner Anteil an dimerem und oligomerem HTT höherer Ordnung war vorhanden, wenn es entweder von Blue Native PAGE oder SEC-MALS analysiert wurde. Bemerkenswert ist, dass höhergeordnete Oligomere, die von FL HTT gebildet werden, nicht mit der PolyQ-Länge zu korrelieren scheinen, und selbst die Exon1-Deletionsmutante zeigt ein ähnliches Oligomer-Dimer-Monomer-Verhältnis. Die tatsächlichen Schwankungen des Oligomergehalts zwischen diesen Konstrukten sind wahrscheinlich auf geringfügige Unterschiede in der Herstellung und Handhabung jeder Charge zurückzuführen. Im Gegensatz zu Aggregaten und Fibrillen, die von HTT Exon140,41 gebildet wurden, blieben die höhergeordneten Oligomere von FL HTT löslich und konnten von SEC und Native PAGE analysiert werden.
Gereinigtes monomeres FL HTT ist nur relativ stabil. Längere Lagerung bei 4 °C, kurze Inkubationen bei Raumtemperatur oder Konzentrationen > 1 mg/ml wandeln monomere FL HTT in dimere und oligomere Formen höherer Ordnung um, obwohl unter diesen Bedingungen kein sichtbarer Niederschlag beobachtet wird. Gereinigtes monomeres FL HTT, das bei ≤1 mg/ml gehalten wurde, blieb bei -80 °C im Speicherpuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v Glycerin, 0,5% w/v CHAPS und 5 mM DTT) relativ stabil24. Bis zu 6 Gefrier-Tau-Zyklen von FL HTT, die auf diese Weise hergestellt und gelagert wurden, verursachten keine sichtbare Ausfällung des Proteins, obwohl eine leichte Verschiebung in einen höheren oligomeren Zustand von SEC-MALS beobachtet wurde (ergänzende Abbildung S2). Die Proben wurden auch von SDS PAGE nach wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen analysiert. Es wurden keine sichtbaren Niederschläge beobachtet; von SDS-PAGE wurden keine Aggregate oder zusätzliche Abbauprodukte gesehen (ergänzende Abbildung S3). Die Langzeitstabilität von gereinigtem FL HTT wird noch untersucht. In Ermangelung aussagekräftiger Langzeitdaten empfehlen wir, gereinigtes FL HTT bei -80 °C nicht länger als 6 Monate zu lagern.
Hochwertige, rekombinante FL-HTT-Proteinvarianten und die Methoden, um sie herzustellen, sind in der Huntington-Forschungsgemeinschaft sehr gefragt. Diese Proteine werden als Immunoassay- und MS-Analysestandards, in Strukturstudien und für die Entwicklung neuartiger FL-HTT-spezifischer Assays verwendet. Die hier beschriebenen großflächigen transienten Expressionsmethoden haben durchweg Milligrammmengen von FL-HTT-Varianten mit >95% Reinheit erzeugt und liefern wesentliche Werkzeuge für HTT-Studien. Die Produktion von Dutzenden Milligramm hochgereinigter FL HTT polyQ-Varianten und anderer Mutanten zur Unterstützung der Huntington-Forschung ist zur Routine geworden.

Die Huntington-Krankheit (HD) ist eine seltene neurodegenerative Erkrankung, die hauptsächlich durch instabile und unwillkürliche motorische Bewegungen sowie kognitive und psychiatrische Veränderungen wie Persönlichkeitsveränderungen und Apathie gekennzeichnetist 1,2. Die Huntington-Krankheit ist mit einer Erweiterung des CAG-Wiederholungstrakts im Exon 1 des Huntingtin-Gens (HTT) auf mehr als 35 Wiederholungen verbunden, wobei eine höhere Anzahl von CAG-Wiederholungen mit einem früheren Ausbruch der Krankheit korreliert 3,4. Das translationale Produkt von HTT, das Huntingtin-Protein (HTT), ist an der neuronalen Lebensfähigkeit und der Gehirnentwicklung beteiligt 5,6,7,8,9.
HTT ist ein Gerüstprotein, von dem berichtet wird, dass es an einer Vielzahl von zellulären Prozessen, Vesikeltransport, Zellteilung, Ziliogenese und Autophagie beteiligt ist10,11. Die molekulare Pathogenese der Huntington-Krankheit ist jedoch nicht ganz klar, und die Identifizierung von Schlüsselproteininteraktoren, die die pathologischen Auswirkungen von polyQ-expandiertem mHTT vermitteln, fehlt. Einige Forschungsergebnisse deuten auf einen Gewinn der toxischen Funktion durch mHTT hin, der durch die Oligomerisierungsneigung des expandierten HTT-Proteins angetrieben wird, da HTT-Aggregate in Neuronen und Gliazellen bei Huntington-Patienten und Tiermodellen der Krankheit identifiziert wurden 12,13,14,15,16,17 . Um die Untersuchung der Funktion und Struktur von FL-HTT- und mHTT-Varianten voranzutreiben und Forscher mit hochwertigen Proteinstandards für die Assay-Entwicklung zu versorgen, ist eine robuste und skalierbare Versorgung mit homogenen rekombinanten Proteinen erforderlich.
Aufgrund seiner Größe (aa 1-3.144, Nummerierung basierend auf der PolyQ-Länge Q23), proteolytischer Instabilität und Aggregationsneigung hat sich FL HTT als schwierig erwiesen, als lösliches Protein zu exprimieren und zu isolieren. Zuvor wurde die Exon-1-Region (aa 2-90) von HTT exprimiert und in großem Maßstab mit verschiedenen Tags gereinigt, die die Löslichkeit des Proteins in Escherichia coli18,19,20 erhöhen können. FL HTT wurde zuerst in einem Insektenzellexpressionssystem unter Verwendung von Baculovirus 21,22 exprimiert und gereinigt, und niedrig aufgelöste 30 Å Elektronenmikroskopie (EM) Strukturen chemisch vernetzter FL Q23-HTT und Q78-HTT wurden berichtet23. Die Untersuchung der HTT-Struktur wurde weiter vorangetrieben, als die Produktion von FL Q17, Q46 und Q128-HTT mit nativen posttranslationalen Modifikationen (PTMs) in menschlichen Zellen unter Verwendung stabiler Zelllinien oder Adenovirus-Expressionssysteme erreicht wurde24. Diese Studien deuten darauf hin, dass, obwohl gereinigtes HTT hauptsächlich im monomeren Zustand existiert, es auch dazu neigt, Oligomere und Aggregate hoher Ordnung zu bilden.
Die analytische Ultrazentrifugation von FL Q128-HTT mit einer stark expandierten PolyQ-Region lieferte mehr oligomere und aggregierte Fraktionen als das Protein mit der nicht expandierten polyQ-Region24. Unter Verwendung einer stabilen Zelllinie wurde erfolgreich eine Strategie zur Stabilisierung von FL HTT durch Co-Expression mit dem Interaktionspartner HAP40 angepasst. Eine Kryo-EM-Struktur des FL HTT- und HAP40-Komplexes wurde mit einer durchschnittlichen Auflösung von 4 Å unter Verwendung des gereinigten Proteinkomplexes (PDB:6EZ8)25 gelöst. Diese Co-Expressionsstrategie wurde erfolgreich an ein Baculovirus-System angepasst, und eine Reihe hochwertiger HTT-Varianten mit unterschiedlichen PolyQ-Längen wurden aus Insektenzellen exprimiert und gereinigt26. Seitdem wurden weitere Kryo-EM-Strukturen des HTT-Komplexes mit variablen PolyQ-Längen und HAP40- und höher aufgelösten Strukturen gelöst und in der Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O) hinterlegt.
Wir optimierten eine Transfektions- und Expressionsmethode in HEK293-Zellen unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI) für eine schnelle transiente Expression von FL HTT. Als Proof-of-principle wurden FL-HTT-Varianten mit 23 Glutaminen (FL Q23-HTT) zunächst gereinigt und unter Verwendung einer Modifikation einer zuvor beschriebenen Reinigungsmethodecharakterisiert 24. Diese transiente Transfektionsmethode ist bequem, hocheffizient und skalierbar. Es kann gereinigtes HTT mit Ausbeuten von 1-2 mg/L produzieren, vergleichbar mit der beschriebenen stabilen Zelllinienmethode24. Da das Protein in einer menschlichen Zelllinie produziert wird, ist es wahrscheinlicher, dass das produzierte HTT native menschliche PTMs aufweist, wenn es einer massenspektrometrischen Proteomikanalyse 11,29,30,31 unterzogen wird. Milligramm-Mengen der FL Q48-HTT, FL Q73-HTT und exon1-deleted (ΔExon1-HTT) Varianten von FL HTT wurden produziert, was zeigt, dass die transiente Expressionsmethode besonders nützlich ist, um schnell alternative Varianten von HTT herzustellen, ohne den zeitaufwändigen Aufwand zu benötigen, der erforderlich ist, um stabile Zelllinien für die Produktion zu etablieren.
Das folgende Protokoll veranschaulicht die Standardmethode, die im Labor dieser Autoren zur Zellkultur, Transfektion, Proteinreinigung und Proteincharakterisierung nach der Reinigung verwendet wird, um FL Q23-HTT aus einer 2-L-Zellkultur herzustellen. Das Protokoll kann auf größere Kulturen skaliert oder angepasst werden, um andere HTT-Varianten zu reinigen. Bis zu 10 L Zellkulturen von FL HTT und verschiedene Orts- oder Trunkierungsmutationen von HTT und HTT-Homologen wurden erfolgreich im Labor mit dem gleichen Protokoll durchgeführt. Gereinigtes FL HTT enthält einen hohen Anteil an Monomeren sowie Dimere und Oligomere höherer Ordnung. Das gleiche Aggregatprofil wird bei den produzierten Varianten beobachtet (Q23, Q48, Q73 und gelöschtes Exon1). Da eine Aggregation auftreten kann, wenn nicht die richtige Sorgfalt angewendet wird, wurde eine Formulierungs- und Gefrier-Tau-Stabilitätsstudie durchgeführt, um die besten Bedingungen für die Proteinhandhabung zu ermitteln. Methoden wie Blue Native PAGE und SEC/MALS-RI werden ebenfalls beschrieben, um den HTT-Oligomergehalt im Rahmen des Qualitätskontrollprozesses zu analysieren. Zum Nutzen der Huntington-Forschungsgemeinschaft werden die in dieser Studie beschriebenen Plasmide und HTT-Proteine auch im HD Community Repository am Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI) deponiert.

<table><tbody><tr><td>100 kDa Konzentrator-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-6.2.4</td></tr><tr><td>20x blauer nativer PAGE-Laufpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.1</td></tr><tr><td>4x blauer nativer PAGE-Probenpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS-Ladepuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.3</td></tr><tr><td>5 L Erlenmeyerkolben</td><td>Corning</td><td>431685</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4.2</td></tr><tr><td>Agarose-Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-2.2</td></tr><tr><td>Anti-Klumpungsmittel</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4.8</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2-Affinität Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-6.1.1</td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.7</td></tr><tr><td>Anti-Schaum-Excell Anti Schaum</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Gewässer</td><td>186006851</td><td>2,5 & Mikro; m x 4,6 mm x 150 mm Protokoll Abschnittsnummer-7.3</td></tr><tr><td>blau nativ PAGE 5% G-250 Probenadditiv</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-8.3</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-2.5</td></tr><tr><td>Zentrifuge - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td> Protokoll <td>Abschnittsnummer-6.1.3</td></tr><tr><td>Zellzähler - ViCELL</td><td>BECKMAN COSCHAR</td><td></td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Kompetente E. coli Zellen-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-2.4</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.1</td></tr><tr><td>Differenzieller Brechungsindexdetektor</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDK Peptid</td><td>Genscript</td><td></td><td>Peptidsynthese Service Protokoll Abschnitt Nummer-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.1</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Giga Kit</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-3.3</td></tr><tr><td>Endotoxinfreies Wasser</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-4.1</td></tr><tr><td>Endotoxin-Quantifizierungskit-CRL Endosafe Nexgen-PTS-Nachweissystem</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-3.4</td></tr><tr><td>Festwinkelrotor A23-6x100 Rotor</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-6.1.3 FPLC-Software</td></tr><tr><td>- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva-Protokoll</td><td></td><td>Abschnittsnummer-6.1.4</td></tr><tr><td>Gensynthese</td><td>Genscript</td><td></td><td>Gensynthese-Service Protokoll Abschnittsnummer-1.2</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific Glycerin (ACS-zertifiziert)</td><td>G33-4</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.6</td></tr><tr><td>Wachstumsmedium-Expi293 Expressionsmedium</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4.2</td></tr><tr><td>HEK293-Zellen</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4</td></tr><tr><td>hohe Scherung Homogenisator-Mikrofluidisierer</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protokoll Abschnittsnummer-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Bildanalysesoftware Protokoll Abschnittsnummer-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>MAB2168</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.7</td></tr><tr><td>Mehrwinkel-Lichtstreudetektor</td><td>Wyatt</td><td></td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark Ungefärbter Proteinstandard</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Verfügbare HiFi-Version Protocol Section Number-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% Trisacetat-Gele</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetat SDS Laufpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4.1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td> Protokoll <td>Abschnittsnummer-4.2</td></tr><tr><td>Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-4.5</td></tr><tr><td>Plasmid-Miniprep-Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-2.2</td></tr><tr><td>vorgefertigtes Bis-Tris-Gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-8.4</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor-Cocktail</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS Analysesoftware - Astra 7</td><td>Wyatt Technologie</td><td></td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-7.6</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper -IRdye 800 CW Ziege Anti-Maus</td><td>IgG LiCor</td><td>926-32210</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Protokoll Abschnitt Nummer-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-6.1.1 UV-Spektrometer</td></tr><tr><td>- Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>Protokoll Abschnittsnummer-6.1.1</td></tr></tbody></table>

effiziente und skalierbare produktion von humanen huntingtin-varianten in voller länge in säugetierzellen unter verwendung eines transienten expressionssystems

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length Huntingtin (FL HTT) ist ein großes (aa 1-3,144), ubiquitär exprimiertes, Polyglutamin (polyQ)-haltiges Protein mit einer Masse von etwa 350 kDa. Während die zelluläre Funktion von FL HTT nicht vollständig verstanden wird, ist eine mutierte Expansion des PolyQ-Trakts über ~ 36 Wiederholungen mit der Huntington-Krankheit (HD) verbunden, wobei die PolyQ-Länge ungefähr mit dem Erkrankungsalter korreliert. Um den Einfluss der Struktur auf die Funktion des mutierten HTT (mHTT) besser zu verstehen, werden große Mengen des Proteins benötigt. Die Submilligrammproduktion von FL HTT in Säugetierzellen wurde unter Verwendung der Doxycyclin-induzierbaren stabilen Zelllinienexpression erreicht. Die Proteinproduktion aus stabilen Zelllinien hat jedoch Einschränkungen, die mit transienten Transfektionsmethoden überwunden werden können. 
Dieser Artikel stellt eine robuste Methode zur Herstellung von FL HTT und seinen Varianten aus Codon-optimierten Plasmiden durch transiente Transfektion mit Polyethylenimin (PEI) vor. Die Methode ist skalierbar (>10 mg) und liefert konstant 1-2 mg/L Zellkultur von hochgereinigtem FL HTT. In Übereinstimmung mit früheren Berichten wurde festgestellt, dass der Zustand der gereinigten Lösung von FL HTT sehr dynamisch ist. Das Protein neigt zur Bildung von Dimeren und Oligomeren hoher Ordnung. Ein Schlüssel zur Verlangsamung der Oligomerbildung ist die schnelle Isolierung der monomeren Fraktionen aus den dimeren und oligomeren Fraktionen hoher Ordnung während der Größenausschlusschromatographie. 
Die Größenausschlusschromatographie mit Mehrwinkellichtstreuung (SEC-MALS) wurde verwendet, um den Dimer- und oligomeren Gehalt höherer Ordnung von gereinigtem HTT zu analysieren. Es wurde keine Korrelation zwischen der FL HTT polyQ-Länge (Q23, Q48 und Q73) und dem Oligomergehalt beobachtet. Das exon1-gelöschte Konstrukt (aa 91-3,144) zeigte eine vergleichbare Oligomerisierungsneigung zu FL HTT (aa 1-3,144). Herstellungs-, Reinigungs- und Charakterisierungsmethoden mittels SEC/MALS-Brechungsindex (RI), Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Western Blot, Native PAGE und Blue Native PAGE werden hierin beschrieben.

Wir bieten skalierbare Protokolle, die das Konstruktdesign, die transiente Transfektion sowie die Expression und Reinigung von humanen Huntingtin-Proteinvarianten in voller Länge in HEK293-Zellen abdecken.

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Das Protokoll wurde für die Herstellung von Jagdvarianten in voller Länge im niedrigen Milligrammbereich entwickelt. Es ermöglicht konsistent hochwertiges Protein, das für Huntington-Forscher unerlässlich ist. Demonstrieren wird das Verfahren von Michael Harris, einem Forscher des Curia-Labors.Beginnen Sie mit der Zugabe von einem Gramm Polyethylenimin 25 K zu einem Liter endotoxinfreiem Wasser und rühren Sie gut um. Stellen Sie den pH-Wert mit 100-Millimolar-Salzsäure auf 2,0 ein und rühren Sie, bis sich das gesamte Polyethylenimin aufgelöst hat. Stellen Sie dann den pH-Wert mit einer 100-Millimolar-Natronlauge auf 7,0 ein und leiten Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.Machen Sie Aliquots der gefilterten Lösung und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Vermehrung von HEK293-Zellen im Wachstumsmedium, ergänzt mit Penicillin-Streptomycin, in einem befeuchteten Shaker-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 90 U/min, 5% Kohlendioxid für 18 bis 24 Stunden. Einen Tag vor der Transfektion die Zellen bei einer Dichte von etwa 1,2 x 10 zu den sechsten Powerzellen pro Milliliter in zwei Litern Wachstumsmedium in einem Fünf-Liter-Erlenmeyerkolben verdünnen und 18 bis 24 Stunden inkubieren.Messen Sie am Ende der Inkubation die Zelldichte und Lebensfähigkeit mit einem automatischen Zellzähler gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach der Berechnung der Menge an Polyethylenimin und Plasmid, die für die Transfektion erforderlich ist, Polyethylenimin und Plasmid einzeln in 100 Milliliter PBS verdünnen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann mischen Sie das verdünnte Plasmid und Polyethylenimin durch vorsichtiges Schwenken und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten.Die Mischung in die Zellkultur geben und durch Schwenken vorsichtig mischen. Lassen Sie nun die Zellen 24 Stunden lang wachsen. Am nächsten Tag Natriumbutyratlösung zu einer Endkonzentration von zwei Millimolar Antiklumpen und Antischaummittel im Verhältnis 1: 1, 000 in die Kultur geben und die Zellen im befeuchteten Shaker-Inkubator für 48 Stunden inkubieren.Nach der Messung der Zelllebensfähigkeit und -dichte ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2.000 G für 30 Minuten und lagern Sie das Zellpellet vor der Reinigung bei minus 80 Grad Celsius. Für die Anti-FLAG-Reinigung mit FPLC packen Sie 12 bis 25 Milliliter Anti-FLAG-Harz mit einer Durchflussrate von vier Milliliter pro Minute unter Verwendung von Puffer A auf eine leere Säule und passen Sie die Höhe des Kolbens an, um den Spalt zwischen dem Ende des Kolbens und dem Harzbett zu entfernen. Als nächstes suspendieren Sie das aufgetaute Zellpellet in kaltem Lysepuffer und leiten die Zellsuspension einmal durch einen High-Shear-Homogenisator bei 1.000 Pfund pro Quadratzoll Druck.Mit einer Zentrifuge, die mit einem kompatiblen Festwinkelrotor ausgestattet ist, klären Sie das Lysat bei 20.000 G für eine Stunde. Programmieren Sie FPLC unter dem Methodenfenster, laden Sie das geklärte Lysat über die Probenpumpe und waschen Sie die Säule mit den gewünschten Säulenvolumina von Puffer A, B, C, D und Elutionspuffer, wie im Textmanuskript beschrieben. Sobald der Lauf beendet ist, analysieren Sie 10 Mikroliter der Spitzenfraktionen mit SDS-PAGE.Kombinieren Sie die Peakfraktionen mit der gewünschten Reinheit und sparen Sie ca. 50 Mikroliter der kombinierten Eluate für die weitere SDS-PAGE-Analyse ein. Beginnen Sie mit der Äquilibrierung der SEC-Säule mit dem FPLC und laden Sie das Anti-FLAG-Eluat über einen 50-Milliliter-Superloop. Lassen Sie nach dem Ausführen des SEC-Puffers die SEC-Trennung über Nacht bei vier Grad Celsius erfolgen.Vergleichen Sie das Elutionsprofil mit dem Standard-HTT-Elutionsprofil, um die Monomer-, Dimer- und höhergeordneten oligomeren Peaks zu unterscheiden. Poolen Sie die monomeren HTT-Fraktionen basierend auf dem Elutionprofil der SEC-Säule und, falls gewünscht, bündeln Sie die höhergeordneten oligomeren und dimeren HTT-Fraktionen getrennt. Das gepoolte HTT-Protein wird mit einem 100-Kilodaltonnen-Zentrifugalkonzentrator bei vier Grad Celsius konzentriert.Nach Berechnung der Proteinkonzentration aliquot weniger als 100 Mikroliter des gereinigten HTT-Proteins in einem kryosicheren Mikrozentrifugenröhrchen. Die Aliquots mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Führen Sie alle analytischen SEC-MALS bei vier Grad Celsius auf dem HPLC-System durch, gekoppelt mit einem UV-Detektor, einem Mehrwinkel-Lichtstreudetektor, einem differentiellen Brechungsindexdetektor und verwenden Sie 0,185 als Brechungsindex-Inkrement für HTT.Reinigen Sie die Pumpe und die Detektoren mit gefiltertem HPLC-Wasser und verbinden Sie die UHPLC-Säule mit dem System. Äquilibrieren Sie die Säule mit gefiltertem Wasser und dann SEC-MALS Puffer, bis alle Detektorsignale die Basislinie erreichen. Injizieren Sie zwei Mikroliter BSA-Lösung mit einer Flussrate von 0,3 Milliliter pro Minute für 15 Minuten pro Injektion.Überprüfen Sie die Datenqualität, führen Sie Normalisierung, Spitzenausrichtung und Banderweiterungskorrektur basierend auf dem BSA-Profil durch und erstellen Sie eine Vorlage für die folgenden HTT-Beispielläufe. Eine Durchstechflasche der FL Q23-HTT-Probe in einem Wasserbad bei Raumtemperatur mit einem Schwimmer schnell auftauen. Filtern Sie die HTT durch einen 0,1-Mikrometer-Spinfilter.Injizieren Sie zwei bis vier Mikroliter der HTT-Probe und laufen Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius bei einer Flussrate von 0,3 Milliliter pro Minute. Analysieren Sie die chromatographischen und Lichtstreudaten mit der mitgelieferten Software und erstellen Sie ein Zimm-Diagramm, um die gewichtsgemittelte Molekülmasse für jeden Peak zu bestimmen. In der vorliegenden Studie wurde unter Verwendung eines zweistufigen Säulenverfahrens eine Reinheit von mehr als 95% für HTT erhalten, und die Hauptverunreinigung war Chaperon Hsp70, das durch ausgiebiges Waschen mit Magnesiumchlorid und ATP während des Anti-FLAG-Affinitätsreinigungsschritts eliminiert wurde. Eine Überexpression von FL HTT kann zu einer Fragmentierung des Proteins führen, aber FL Q23-HTT, das nach dem als einzelne Bande aufgelösten Verfahren mit dem korrekten Molekulargewicht von 350 Kilodalton hergestellt wird, zeigt keine Fragmentierung.Die Western-Blot-Analyse nach der Reaktion von Antikörpern mit FL Q23-HTT zeigte, dass das Protein ohne signifikante nachweisbare Trunkierungen isoliert wurde, da keine zusätzlichen fragmentbezogenen Banden beobachtet wurden. FL HTT Poly-Q Längenvarianz, Q23, Q48 und Q73 reagierten wie erwartet im Western Blot und zeigten ein progressiv stärkeres Signal für den poly-Q-gerichteten monoklonalen Antikörper MW1, der mit zunehmender Q-Länge korreliert. Unter den getesteten HPLC-Säulen zeigte die SEC-Säule eine ausreichende Auflösung zwischen dem HTT-Monomer und dem Dimer, so dass molare Massen unterschieden werden konnten.Gereinigtes FL HTT von SEC zeigte mehrere Banden, die den Oligomerisierungszuständen entsprechen, was auf das Vorhandensein mehrerer hydrophober Flecken zurückzuführen sein könnte, die zur Bildung von höhergeordneten Oligomeren während der Migration innerhalb des Gels beitragen. Gereinigtes HTT zeigte drei Hauptbanden auf blauem nativem PAGE mit einem geschätzten Molekulargewicht von 643, 927 und 1.070 Kilodalton, die wahrscheinlich die monomeren, dimeren und trimeren Arten von HTT repräsentieren. Der richtige Umgang mit gereinigtem Huntingtin ist unerlässlich, um die Bildung von hochgeordneten Oligomeren in löslichen Aggregaten zu vermeiden.Es ist unerlässlich, dass der Endbenutzer schnell arbeitet, um die Probe vor dem Schockgefrieren in vorgekühlte Röhrchen zu dosieren. Langzeitstabilitätstests können an Proben durchgeführt werden, die über einen längeren Zeitraum bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Wiederholte HPLC SEC-MALS-Analysen bestätigen, ob sich der monomere Gehalt der Probe verändert hat.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.

Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Studieren Ionenkanäle durch ein heterolog exprimierenden System hat eine Kerntechnik in der biomedizinischen Forschung. In diesem Manuskript stellen wir eine zeiteffiziente Methode streng kontrollierten Ionenkanal-Expression durch Durchführung transienter Transfektion unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors zu erzielen.

Steuerbare Ionenkanal-Expression durch induzierbare Transiente Transfektion

Hier präsentieren wir Ihnen eine robuste und optimierte Protokoll zur Herstellung von Milligramm-Mengen von native, Tag-freie Monomere und Fibrillen von der exon1 des Huntingtin-Proteins (Httex1), basierend auf die vorübergehende Verschmelzung von kleinen Ubiquitin Verwandte Modifikator (SUMO).

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Rekombinantes BDNF, das eine Avi-Sequenz (BDNFAvi) enthält, wird in HEK293-Zellen kostengünstig hergestellt und durch Affinitätschromatographie gereinigt. BDNFavi wird dann direkt mit dem Enzym BirA in einer Röhre mono-biotinyliert. BDNFavi und monobiotinyd BDNFavi behalten ihre biologische Aktivität im Vergleich zu kommerziell erhältlichen BDNF.

Ein verbessertes Protokoll zur Reinigung und direkt Mono-Biotinylat Rekombinanten BDNF in einer Tube für Zelllandhandel Studien in Neuronen

Hier wird ein zellbasiertes AAV-Produktionsprotokoll für HEK293-Suspensionen vorgestellt, das zu einem reduzierten Zeit- und Arbeitsaufwand für die Vektorproduktion mit Komponenten führt, die für Forschungszwecke von kommerziellen Anbietern erhältlich sind.

Herstellung von Adeno-assoziierten Vektorchargen mit hoher Ausbeute unter Verwendung von HEK293-Suspensionszellen

Erfahren Sie die skalierbare Produktion von humanem Huntingtin-Protein in voller Länge in HEK293-Zellen. Diese Methode liefert hochreines Protein für die Huntington-Forschung.

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems (Video) | JoVE Journal

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems

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