Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Masarimycin ist einer der wenigen Inhibitoren bakterieller Autolysine, der das Wachstum bakterieller Zellen stoppt. Es kann verwendet werden, um die Unterschiede zwischen chemischer und genetischer Inaktivierung von Autolysinen zu untersuchen, und bietet einen orthogonalen Ansatz für die Genetik, um die bakterielle Physiologie zu untersuchen. Die Synthese von Masarimycin mag entmutigend erscheinen.

Befolgen Sie genau die gezeigten Schritte. Im Zweifelsfall, ob ein Reaktionsschritt funktioniert hat, bestätigen Sie dies durch Dünnschichtchromatographie und die Änderungen der HF-Werte. Bereiten Sie zunächst eine 0,1-molare Lösung von Cyclohexylamin, Cyclohexylcarbadehyd, Ortho-Jodbenzoesäure und Cyclohexylisocyanid in Methanol vor.

Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, mischen Sie dann fünf Milliliter Cyclohexylamin und fünf Milliliter Cyclohexylcarboxaldehyd in einem verschlossenen Rundkolben und legen Sie den Kolben für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in ein Sandbad auf einen Rührer. Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer, das etwa einen Zentimeter unter der Sandoberfläche platziert ist. Nach 30 Minuten fünf Milliliter Cyclohexylisocyanid in die Lösung geben und weitere 20 Minuten bei 50 Grad Celsius umrühren.

Dann fügen Sie fünf Milliliter Ortho-Jodbenzoesäure zu der Reaktionsmischung hinzu und rühren Sie drei bis fünf Stunden lang bei 55 Grad Celsius weiter. Überwachen Sie nach drei Stunden Rühren den Fortschritt der Reaktion regelmäßig durch Dünnschichtchromatographie oder TLC in Abständen von etwa einer Stunde. Betrachten Sie die Reaktion als abgeschlossen, wenn nur eine Stelle mit einem Retentionsfaktor von 0,3 auf der TLC-Platte sichtbar ist.

Entfernen Sie das Lösungsmittel im rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck. Sobald das gesamte Methanol verdampft ist, lösen Sie das getrocknete Rohprodukt in 30 Milliliter Ethylacetat auf und geben Sie es in einen separaten Trichter. Ethylacetat sequentiell mit einmoliger Salzsäure, Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung, wieder Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung extrahieren, wobei die wässrigen Schichten bei jeder Extraktion verworfen werden.

Entfernen Sie dann die Ethylacetatschicht aus dem Separatorientrichter und sammeln Sie sie in einem Erlenmeyerkolben. Fügen Sie einen Spatel voller wasserfreiem Natriumsulfat hinzu, um Restwasser aus Ethylacetat zu entfernen. Filtern Sie die getrocknete Ethylacetatlösung durch ein Filterpapier Nummer eins, um das Natriumsulfat zu entfernen.

Dann waschen Sie das Filterpapier mit einer kleinen Menge Ethylacetat. Die filtrierte Ethylacetatlösung wurde auf einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck auf Trockenheit verdampft, um Masarimycin als Öl zu erhalten, sobald das gesamte Ethylacetat entfernt wurde. Das Masarimycinöl wird in ein bis zwei Millilitern einer 9:1-Hexan-Isopropanol-Lösung aufgelöst und auf einer magnetischen Rührplatte umgerührt, bis sich die gesamte Verbindung gelöst hat.

Um das gelöste Masarimycin zu reinigen, führen Sie eine Flash-Chromatographie mit einer 12-Gramm-Normalphasen-Kieselsäure-Flash-Kolonne durch. Gleichen Sie die Blitzsäule mit 10 Säulenvolumina der mobilen Phase aus, wobei die Instrumente auf eine Durchflussrate von 15 Millilitern pro Minute eingestellt sind. Nachdem das Gleichgewicht abgeschlossen ist, zeichnen Sie das gelöste Masarimycin mit einer Fünf-Milliliter-Spritze.

Verbinden Sie die Spritze direkt mit der Oberseite der Gleichgewichtsblitzsäule und injizieren Sie die Lösung in die Säule. Schließen Sie die belastete Säule wieder an das Blitzchromatographiesystem an und initiieren Sie die Gradientenelution. Eluierte Masarimycin aus der Säule mittels Gradientenelution zu einer Endkonzentration der mobilen Phase von 10:90 Hexan zu Isopropanol über 12 Säulenvolumen.

Überwachen Sie die Elution von Masarimycin über die Absorption bei 230 und 254 Nanometern. Für die Morphologiestudie züchten Bacillus subtilis 11774 auf LB-Agarplatten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie in allen nachfolgenden Experimenten Second-Passage-Zellen, die in fünf Millilitern LB-Brühe gezüchtet wurden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1 erreicht.

Als nächstes fügen Sie Masarimycin mit einer Pipette zu den Kulturröhrchen hinzu, die mit einer Endkonzentration von 3,8 Mikromol behandelt wurden. Für Kulturröhrchen, die als Steuerung gekennzeichnet sind, fügen Sie ein äquivalentes Volumen von DMSO hinzu. Legen Sie die Proben 90 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U / min.

Nach 90 Minuten die Kulturen chemisch in einer 1:10-Mischung aus Nährmedien fixieren und den Puffer über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Pipette, um 10 bis 20 Mikroliter der chemisch fixierten Proben auf Glasmikroskopobjektträger aufzutragen und sie an der Luft trocknen zu lassen. Fixieren Sie dann die luftgetrockneten Proben, indem Sie die Glasobjektträger mit einem Bunsenbrenner erhitzen.

Nach der Hitzefixierung färben Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1% Methylenblau. Nach einer 10-minütigen Inkubation mit dem Fleck den überschüssigen Farbstoff mit destilliertem Wasser wegwaschen. Dann erhitzen Sie die gefärbten Objektträger vorsichtig auf 60 Grad Celsius in einem Ofen für 15 bis 20 Minuten, um die Zellen auf eine gemeinsame Fokusebene zu bringen.

Verschließen Sie die gefärbten Proben, indem Sie einen Mikroskop-Deckglas über die gefärbten Zellen legen. Versiegeln Sie dann die Kanten mit Objektträgerzement. Legen Sie den versiegelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und bringen Sie das Bild mit einer Hellfeldmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung in den Fokus.

Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Objektträger und bringen Sie das Sichtfeld mit 1000-facher Vergrößerung in den Fokus. Erfassen Sie Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an das Mikroskop und die zugehörige Software angeschlossen ist. Erfassen Sie Bilder mit den automatischen Weißabgleichs- und Blendeneinstellungen der Software.

Die Flash-Chromatographie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Masarimycin mit hoher Reinheit. Die Bewertung von Synergien oder Antagonismus mit dem ATPase-Inhibitor Optochin in S.pneumoniae wird hier vorgestellt. Die niedrigste Konzentration der Verbindung zur Hemmung des Bakterienwachstums, die durch die blaue Farbe angezeigt wird, gilt als der minimale hemmende Konzentrationswert in Gegenwart eines Co-Arzneimittels.

Im Gegensatz dazu weisen Brunnen mit rosa Farbe auf Bakterienwachstum hin. Phänotypische Assays mit Masarimycin im 0,75-fachen der minimalen inhibitorischen Konzentrationen zeigten einen wurstähnlichen Phänotyp für B.subtilis und einen verklumpenden Phänotyp für S.pneumoniae. Achten Sie auf die Temperatur der Reaktion.

Stellen Sie sicher, dass die Reaktion vollständig ist, indem Sie sie mit TLC überwachen. Diese Methode kann in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Antibiotika verwendet werden, um Veränderungen der Zellwand mikroskopisch zu untersuchen.