Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen
21. April 2022
In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.
Wir haben eine Plattformtechnologie für SARS COVID 2 etabliert, die auf andere Viren mit Spike-vermittelter Zellerkennung und -eintritt als erster Schritt bei zellulären Virusinfektionen anwendbar ist. Quantenpunkte sind hell, stabil und ihre Oberfläche kann für eine Vielzahl von zellulären Anwendungen funktionalisiert werden. Mit dieser Methode können wir die Spike-Internalisierung in Zellen visualisieren und messen.
Zur Vorbereitung von 0,1% BSA. Fügen Sie 130 Mikroliter 7,5% BSA zu 10 Millilitern Bildgebungsmedien im Mix hinzu. Für eine 6,1 bis drei serielle Verdünnung und dreifache fügen Sie 14,26 Mikroliter QD Spike zu 285,74 Mikrolitern der 0,1% BSA hinzu, um die höchste Konzentration von 20 Nanomol zu erhalten.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter von 20 Nanomol oder QD Spike zu 200 Mikrolitern von 0,1% BSA hinzu, um die zweite Wahnvorstellung von 6,67 Nanomol QD Spike zu machen. Entfernen Sie alle verbrauchten Medien aus jedem Vertiefungsfeld mit einem Mehrkanal-Aspirator, waschen Sie einmal mit einer Mehrkanalpipette mit 100 Mikrolitern Bildgebungsmedien pro Vertiefung und saugen Sie dann 100 Mikroliter der Bildgebungsmedien ab. Fügen Sie 50 Mikroliter QD Spike-Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Bereiten Sie mit Schutzausrüstung 4% PFA- und 0,1% PSA-Bildgebungsmedien in einer sterilen Biosicherheitskabine vor, saugen Sie 50 Mikroliter QD Spike aus jedem Bohrloch und fügen Sie 100 Mikroliter 4% PFA pro Bohrung mit einer automatisierten Mehrkanalpipette hinzu, um eine Trocknung der Bohrlöcher zu vermeiden. Inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie dann dreimal mit PBS, bereiten Sie den tiefroten Kernfarbstoff vor, indem Sie die Fünf-Millimeter-Stammlösung bei einem bis 1000 in PBS verdünnen, saugen Sie das PBS ab und fügen Sie 50 Mikroliter verdünnten Kernfarbstoff pro Vertiefung wieder hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann dreimal mit PBS waschen, die Platte abbilden oder mit einem Plattenversiegeler für die spätere Bildgebung versiegeln.
Lagern Sie den Teller bei vier Grad Celsius. Starten Sie die Software für die Imaging-Plattform. Nachdem Sie sich bei der Bildgebungsplattform angemeldet haben, erstellen Sie ein neues Erfassungsprotokoll, indem Sie den Plattentyp als 96-wandige transparente Bodenabbildungsplatte auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in das Wasser auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in Wasser auswählen.
Wählen Sie den Modus für digitale Gesichtskontraste wie hohen Kontrast, um gut definierte Zellkörper zu erzeugen. Machen Sie einen Schnappschuss, um zu bestätigen, dass diese Überschrift im Bildfenster angezeigt wird, und wählen Sie den passenden C-Kanal für die Verwendung mit der ACE2-GFP-Zelllinie, um den ACE2-Verkehr innerhalb der Zelle zu visualisieren. Um einen benutzerdefinierten QD-Kanal zu erstellen, wählen Sie das Dreiecks-Dropdown-Menü und wählen Sie die Anregung im 405-Nanometer-Bereich in der Emission im 608-Nanometer-Bereich, wählen Sie einen Brunnen mit einem robusten zytoplasmatischen QD-Signal, um die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Z-Höhenposition einzustellen.
Überprüfen Sie, ob die Standardhöhe ein Bild der Zellen in der gewünschten Fokusebene erzeugt. Die Z-Position ist für die Endozytosepuncta niedriger als die Z-Position für die Plasmamembran. Wählen Sie eine Belichtungszeit, typischerweise zwischen 100 und 300 Millisekunden, die ein helles Bild mit Graustufen erzeugt, die mindestens dreimal so hoch sind wie das Hintergrundsignal.
Bei 20 Nanomol sollten die Graustufen etwa 6.000 Atomeinheiten mit 200 Millisekunden Belichtungszeit und 80% Laserleistung betragen. Überprüfen Sie die Graustufen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken, das mit der Schnappschussfunktion in jedem Kanal erzeugt wird, und die Show-Intensität auswählen, dann mit der linken Maustaste auf das Objekt von Interesse oder den Hintergrund klicken, um den Graustufen für dieses Pixel anzuzeigen, und passen Sie die Laserleistung an, um die Intensität der Objekte von Interesse zu optimieren. Speichern Sie das Erfassungsprotokoll, wechseln Sie zum Ausführen des Experiments, geben Sie den Plattennamen ein, führen Sie das Experiment aus.
Die Translokation von QDs und ACE2 wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und einer ACE2-GFP-exprimierenden Zelllinie visualisiert. Die Bildsegmentierung und die anschließende Analyse wurden durchgeführt, um relevante Parameter wie die Spotanzahl zu extrahieren. Zuerst wurden Kerne aus dem Kernmarkerkanal segmentiert, um eine ROI-Population zu erzeugen.
Dann ein ROI-Bereich, der die Zelle mit Segmentierung unter Verwendung des ACE2-GFP-Kanals umreißt. Schließlich wurden QD 608 Spike-Spots aus der Zell-ROI-Region segmentiert, internalisierte QD- und ACE2-Signale zeigten eine starke Co-Lokalisierung. Ein Konzentrationsantwortexperiment mit sechs verschiedenen Konzentrationen von QD Spike wurde in HEK 293T-Zellen durchgeführt.
Bei der Bestimmung der optischen Konzentrationen von QD kann QDS so niedrig wie 2,22 Nanomol verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, Konzentrationen von 10 Nanomol oder höher zu verwenden, um eine robuste Reaktion zu gewährleisten. Während der Konjugation zur QD-Proteinaggregation kann es zu einer Aggregation kommen. Aggregate wurden in der QD-Lösung als hell verklumpte Ausfällungen und HEK 293T-Zellen entdeckt, QDs wurden mit neutralisierten Antikörpern ab 30 Mikrogramm pro Mikroliter vor der Zugabe zu Zellen inkubiert, diese Antikörper blockierten die Bindungsinternalisierung und verursachten eine Verringerung der Spotanzahl im Vergleich zu Zellen, die nur mit QD behandelt wurden.
Dieser Aufsatz kann auch für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, um die Bewertung neutralisierender Antikörper zu leiten, um antivirale Mittel zum Viruseintritt zu identifizieren und an die Untersuchung neu auftretender Varianten angepasst zu werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Plattformtechnologie vor, die Quantenpunkte nutzt, die an SARS-CoV-2-Spikeproteine konjugiert sind, um die Bindung der Spikeproteine an den hACE2-Rezeptor auf Zellmembranen sowie die anschließende Endozytose dieser Proteine in das Zytoplasma sichtbar zu machen und zu messen. Diese Methode liefert Einblicke in die ersten Schritte der zellulären Virusinfektion und bietet eine breite Anwendbarkeit auch für andere Viren mit spikevermittelter Eintrittsmechanismen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
- Virale Pathogenese
Hintergrund
- SARS-CoV-2 interagiert mit hACE2 für den zellulären Eintritt, ein entscheidender Schritt bei der viralen Infektion.
- Quantenpunkte bieten ein stabiles und effektives Mittel zur Verfolgung biologischer Prozesse.
- Das Verständnis der Spike-Internalisierung kann die Entwicklung von Antivirotika voranbringen.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzmikroskopie zur Abbildung zellulärer Prozesse.
- HEK 293T-Zellen als biologisches Modell für Experimente.
- Konzentrations-Wirkungs-Experimente zur Optimierung des Quantenpunkt-Einsatzes.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Spike-Internalisierung und Co-Lokalisation mit ACE2.
- Herstellung optimaler Quantenpunkt-Konzentrationen für zuverlässige Ergebnisse.
- Nachgewiesene Fähigkeit, den Einfluss neutralisierender Antikörper auf den Virus-Eintritt zu bewerten.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet eine neuartige Methodik zur Verfolgung von viralen Eintrittsmechanismen.
- Dieser Ansatz könnte möglicherweise zu Fortschritten bei der antiviralen Wirkstoffscreening und der therapeutischen Entwicklung führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die Hochdurchsatz-Visualisierung der Bindung des viralen Spike-Proteins und der Endozytose und unterstützt so die Validierung antiviraler Zielstrukturen in einem frühen Stadium. Durch die Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen und des Traffickings in einem physiologisch relevanten zellulären Kontext liefert sie eine mechanistische Entschärfung von Eintrittshemmstoffen. Die Plattform ermöglicht das skalierbare Screening neutralisierender Antikörper und Leitverbindungen gegen SARS-CoV-2 und andere, durch Spike-Proteine vermittelte Viren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung der Bindung des Spike-Proteins an hACE2 und der anschließenden Internalisierung und bestätigt damit den viralen Eintrittsmechanismus als therapeutisches Ziel.
- Operativer Wert: Verwendet Quantenpunkt-Konjugate als stabile fluoreszierende Sonden, um die Dynamik des Spike-Proteins mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu verfolgen und verringert dadurch falsch-negative Ergebnisse in Bindungsassays.
- Prädiktiver Wert: Konzentrations-Wirkungs-Daten (z. B. wirksame Signalgebung bei ≥10 Nanomol QD Spike) unterstützen die Modellierung einer dosisabhängigen Zielstruktureinbindung zur Optimierung von Wirkstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Die Segmentierung von Kernen, ACE2-GFP-exprimierenden Zellen und QD-Spike-Spots ermöglicht eine quantitative Spot-Zählung zur hochinformativen Bildschirmanalyse von Bindungs- und Internalisierungshemmern.
- Operationaler Wert: Das Protokoll umfasst automatisierte Fixierungs-, Kernfärbungs- und Abbildungsschritte, die mit 96-Well-Plattenformaten kompatibel sind und die Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays unterstützen.
- Skalierbarkeit: Die nachgewiesene Anwendung in Konzentrations-Wirkungs-Experimenten mit sechs Konzentrationen und triplicaten Verdünnungen zeigt die Eignung für Screening-Kampagnen mit mittlerer bis hoher Durchsatzleistung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationeller Nutzen: Die Kolokalisation von internalisiertem QD-Spike mit ACE2-GFP liefert einen mechanistischen Endpunkt zur Bewertung neutralisierender Antikörper, die den viralen Eintritt blockieren, und unterstützt damit direkt die Beurteilung aussichtsreicher Kandidaten.
- Vorklinische Kontinuität: Die Möglichkeit, die Wirksamkeit von Antikörpern zu testen (z. B. 30 μg/μL neutralisierende Antikörper reduzieren die Spotanzahl), ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in der antiviralen Wirkstoffforschung.
- Anpassungsfähigkeit: Die Plattform kann auf neu auftretende Varianten und andere, durch Spike vermittelte Viren angewendet werden und erhöht so ihre langfristige Nützlichkeit in Programmen zur Pandemievorbeugung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum der antiviralen Wirkstoffentdeckung von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung ein und ermöglicht eine iterative Beurteilung von an der Spike-Protein bindenden Substanzen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Spike-hACE2-Wechselwirkung und von Endozytosewegen und klärt so den Wirkmechanismus von Eintrittshemmstoffen.
- Screening: Erzeugt quantitative bildgebende Messgrößen (Spot-Anzahl, Kolokalisation), die einen zuverlässigen Vergleich der Wirkstoffeffekte auf virale Bindung und Internalisierung ermöglichen.
- Analytik: Leitet Metriken wie Spot-Anzahl und Intensität aus segmentierten Kanälen ab und liefert statistische Eingabewerte für Dosis-Wirkungs- und Hemmprofilerstellung.
- Translationale Forschung: Verknüpft Bindungs- und Internalisierungsdaten mit funktionellen Ergebnissen (z. B. antikörpervermittelte Reduktion des Spike-Eintrags) und unterstützt damit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist für die Wiederverwendung über verschiedene Zielstrukturen und Zelllinien hinweg konzipiert, wobei die Konjugation mit Quantenpunkten auf andere Liganden oder Rezeptoren übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Visualisierung von Virus-Eintrittsmechanismen und verringert so mechanistische Unschärfen bei der Zielstruktur-Validierung.
- Operationaler Wert: Die Stabilität und Helligkeit von Quantenpunkten ermöglicht eine konsistente Signalerfassung über mehrere Durchgänge hinweg und verbessert die Reproduzierbarkeit des Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht die frühzeitige Identifizierung wirksamer Eintrittshemmer und reduziert das Risiko spätzeitiger Fehlschläge aufgrund fehlender Zielstrukturenbindung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die datengestützte Priorisierung von Leitstrukturen basierend auf quantitativer Hemmung der Internalisierung und verbessert so die Kapitalnutzungseffizienz in antiviralen Programmen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzmikroskopie, im Umgang mit Quantenpunkten und in der Bildsegmentierungsanalyse.
- Benötigt ein konfokales oder Weitfeld-Fluoreszenz-Imaging-System mit konfigurierbaren Anregungs- und Emissionsfiltern (z. B. 405 nm Anregung, 608 nm Emission für QD608).
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich der Antikörperserienverdünnung, Inkubationszeiten und Waschschritten, um die Variabilität der Spot-Zählungen zu minimieren.
- Muss die Aggregation von Quantenpunkten während der Konjugation berücksichtigen, wofür eine Klärung der Lösung (z. B. durch Zentrifugation oder Filtration) vor der Verwendung notwendig ist.
- Die Anpassung an Nicht-HEK293T-Systeme kann eine Optimierung der ACE2-Expression oder die Verwendung alternativer Rezeptor-Markierungen für Kolokalisationsstudien erfordern.
