Name: In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening für Trypanosoma cruzi in allen drei Lebenszyklusstadien. Diese kolorimetrische Methode mit β-Galactosidase ermöglicht die schnelle Identifizierung neuer trypanozider Wirkstoffe gegen Chagas-Krankheit.

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Wir danken Dr. Buckner für die freundliche Bereitstellung des pLacZ-Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, dem Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva aus Argentinien (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) und dem Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] unterstützt. Servier Medical Art wurde verwendet, um Abbildung 1 (https://smart.servier.com) zu erstellen.

HINWEIS: Ein Überblick über das gesamte Versuchsdesign ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den in vitro Screening-Assay der Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ-Linie unter Verwendung von CPRG als Substrat für die kolorimetrische Reaktion. Der Assay besteht aus der Aussaat der Parasiten (1), der Inkubation mit BZN (2 und 3) und der anschließenden Zugabe des kolorimetrischen Substrats (4). Wenn Parasiten lysiert werden, wird β-Galactosidase freigesetzt und spaltet CPRG zu Chlorphenolrot; Diese Farbänderung kann spektralphotometrisch gemessen werden (5). Die Daten können in einer statistischen Analysesoftware analysiert werden, um die halbe inhibitorische Konzentration (IC50) des BZN zu erhalten. Abkürzungen: CPRG = Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid; BZN = Benzidazol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63210/63210fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
1. Vorbereitung von Lagerlösungen
<ol><li>Aufbereitung von Medien und Lösungen<ol>
<li>Häminlösung (Beistelltisch S1)<ol>
<li>Fügen Sie alle Komponenten zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in der im Rezept angegebenen Reihenfolge hinzu und homogenisieren Sie sie mehrmals durch Inversion.</li>
			<li>Sterilisieren durch Filtration durch einen 0,22 μm Filter.</li>
			<li>Bereiten Sie 1 mL Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor und halten Sie sie bis zur Verwendung bei -80 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Leberinfusion Tryptose (LIT) Medium (Ergänzungstabelle S1)<ol>
<li>Wiegen Sie alle Komponenten und rühren Sie, um bei Raumtemperatur in einem 1-Liter-Becherglas mit mindestens 700 ml destilliertem Wasser zu homogenisieren.</li>
			<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein und füllen Sie das Volumen in einem 1-Liter-Messzylinder mit destilliertem Wasser auf 900 ml auf. Sterilisieren durch Filtration oder Autoklavieren (121 °C für 20 min).</li>
			<li>Ergänzen Sie das Medium durch Zugabe von 100 ml fetalem Kälberserum (FCS) (10% FCS, steril und hitzeinaktiviert bei 56 °C für 45 min), 20 ml 40% steriler Glukoselösung (sterilisiert durch Autoklavieren, 121 °C für 20 min) und 5 ml Heminlösung (Endkonzentration 5 μM) bis 900 ml LIT-Medium.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) aus dem Pulver gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
		<li>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Zusatztabelle S1)<ol>
<li>Lösen Sie alle festen Komponenten auf, indem Sie die Lösung bei Raumtemperatur in einem 1-Liter-Becherglas umrühren.</li>
			<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2 ein, legen Sie bis zu 1 l in einem 1 l Messzylinder mit destilliertem Wasser und sterilisieren Sie ihn durch Filtration oder Autoklavieren (121 ° C, 20 min).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Benznidazol (BZN)-Stammlösungen und -verdünnungen HINWEIS: Der Bereich der BZN-Konzentration, der in dieser Arbeit verwendet wurde, betrug 2,5 bis 80 μM.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 M BZN vor, indem Sie 13 mg des Arzneimittels in 50 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen. Unter aseptischen Bedingungen sind serielle Verdünnungen aus dieser 1 M BZN-Stammlösung in der doppelten gewünschten Endkonzentration (2x Lösungen) in einem Endvolumen herzustellen, das für die Anzahl der zu untersuchenden Vertiefungen ausreicht. HINWEIS: Berechnen Sie für 100 μL pro Bohrloch mit einem Überschuss von 10-20%. Die BZN-Stammlösung und alle BZN-Verdünnungen müssen aufgrund der geringen Löslichkeit des Arzneimittels im Medium unmittelbar vor der Verwendung im Assay hergestellt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie 2x BZN-Verdünnungen von 160, 80, 40, 20, 10 und 5 μM vor.<ol>
<li>Verdünnen Sie 1 M BZN-Stammlösung bei einer 100-fachen Verdünnung (10 μL 1 M BZN + 990 μL Medium), um eine 10 mM Lösung in dem geeigneten Medium zu erhalten, das für jede Lebenszyklusstufe von T. cruzi verwendet wird. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren.</li>
			<li>Verdünnen Sie 10 mM BZN-Lösung, um 320 μM BZN im entsprechenden Medium herzustellen: 32 μL 10 mM BZN + 968 μL Medium. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren.</li>
			<li>320 μM BZN 2-fach verdünnen, um eine Konzentration von 160 μM (500 μL von 320 μM BZN + 500 μL Medium) zu erhalten. Kontinuierlich mischen, um die Suspension zu homogenisieren. Wiederholen Sie diese 2-fache Verdünnung mit jeder resultierenden Lösung, um 80-, 40-, 20-, 10- und 5-μM-Lösungen zu erhalten.</li>
			<li>DMSO 1.000-fach im geeigneten Medium zur Verwendung als unbehandelte Kontrolle verdünnen (100%ige Überlebenskontrolle). HINWEIS: Epimastigoten tolerieren eine bis zu 100-fache Verdünnung von DMSO, während Vero-Zellen nur eine 1.000-fache Verdünnung von DMSO tolerieren. Bei Bedarf kann eine Sterbekontrolle mit 50% DMSO als 0% Überlebensbedingung aufgenommen werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Substratlösung<ol>
<li>CPRG bei einer Konzentration von 1 mM in destilliertem Wasser auflösen. Für eine 96-Well-Platte fügen Sie 2,4 mg CPRG zu 4 ml Wasser hinzu. HINWEIS: CPRG-Lösung muss unmittelbar vor dem Assay vorbereitet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Lyse-Lösung<ol>
<li>Es wird eine 2,5%ige v/v-Lösung aus nichtionischem, nicht denaturierendem Reinigungsmittel 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol (siehe Materialtabelle) in 1x PBS hergestellt. Bereiten Sie 1 ml der Lösung pro 96-Well-Platte unmittelbar vor dem Assay vor.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung der Parasitenkultur
<ol><li>Epimastigote Zubereitung HINWEIS: T. cruzi Dm28c/pLacZ Linie 13 wird in diesem Bericht verwendet.<ol>
<li>Züchten Sie die β-Galactosidase-exprimierenden T . cruzi epimastigotes axenisch bei 28 °C in Zellkulturflaschen mit einer Wachstumsfläche von 25 cm 2 (T-25-Kolben). Halten Sie die Kulturen in der Log-Phase, indem Sie alle 48-72 h (in 5 ml) in LIT-Medium subkulturieren, ergänzt mit 10% FCS (Supplemental Table S1) und Genetinasulfat (G418) bei einer Endkonzentration von 200 μg/ml. Quantifizieren Sie das Parasitenwachstum durch Zellzählung in einer Neubauer-Kammer, bevor Sie subkultivieren. Schließen Sie die Kappe sicher und halten Sie den Kulturkolben (nicht belüftet) bei 28 °C in vertikaler Position. HINWEIS: G418 gewährleistet die Auswahl und Wartung von pLacZ-Plasmiden. Log-Phase-Kulturen haben eine Epimastigot-Konzentration von 1-5 × 107 Parasiten/ml für die Dm28c/pLacZ-Linie.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Suspension von 2 × 105 Epimastigoten/ml aus einer Log-Phase-Kultur in LIT vor, die mit einem G418-Antibiotikum ergänzt wird. Dosieren Sie 100 μL der Epimastigot-Suspension pro Vertiefung (20.000 Epimastigoten in 100 μL LIT) einer 96-Well-Mikrotiterplatte und machen Sie das Endvolumen auf 200 μL pro Well mit dem Medium aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Amastigote Zubereitung<ol>
<li>Verwenden Sie spontane metazyklische Trypomastigoten, die aus einer gealterten Epimastigotenkultur (für 7 Tage in diesem Protokoll) gewonnen werden, um eine Erstinfektion in einem T-25-Kolben mit 2 × 105 Vero-Zellen durchzuführen, die zuvor in DMEM gesät wurden, ergänzt mit 2% FCS.<ol>
<li>Zählen Sie die Anzahl der metazyklischen Trypomastigoten in einer Neubauer-Kammer, infizieren Sie die Vero-Zell-Monoschicht mit einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 10 in 5 ml DMEM mit 2% FCS und inkubieren Sie bei 37 ° C und 5% CO2 für 16 h. Waschen Sie die verbleibenden Trypomastigotes, indem Sie das Medium mit einer sterilen 5-ml-Pipette aus dem Kolben entfernen, fügen Sie dann 5 ml 1x PBS hinzu und aspirieren. Zum Schluss 5 ml DMEM mit 2% FCS hinzufügen und unter den gleichen Bedingungen inkubieren.</li>
			<li>Verwenden Sie die Trypomastigoten, die aus der infizierten Vero-Zell-Monoschicht austreten, um die Infektion in T-25-Kolben mit 2 × 105 Vero-Zellen in DMEM mit 2% FCS aufrechtzuerhalten und jede Woche eine neue infizierte Flasche zu erzeugen. HINWEIS: Nach 5-7 Tagen beginnen Trypomastigotes zu entstehen und sind im Überstand sichtbar. Fügen Sie G418 nicht zu den Trypomastigotes hinzu, die zur Infektion der Zellen oder der infizierten Zellen verwendet werden, da die Vero-Zelllinie nicht gegen G418 resistent ist.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie eine Suspension von 1 × 105 Vero-Zellen/ml in DMEM vor, ergänzt mit 2% FCS und Saat 100 μL der Suspension pro Vertiefung in 96-Well-Gewebekulturplatten (10.000 Zellen pro Well). Über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO 2 inkubieren, um die Zellhaftung am Boden der Vertiefungen sicherzustellen.</li>
		<li>Nach der Inkubation über Nacht die Vero-Zell-Monoschicht dreimal mit 100 μL sterilem 1x PBS abspülen. T. cruzi Dm28c/pLacZ Trypomastigotes (erhalten aus einer früheren Infektion in einem T-25-Kolben, Schritt 2.2.1) bei einem MOI von 10 in 100 μL DMEM, ergänzt mit 2% FCS pro Vertiefung (100.000 Trypomastigotes pro Bohrloch), zugeben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platten für 6 h bei 37 °C und 5% CO2. Nach dieser Inkubationszeit waschen Sie die Platten zweimal mit 1x PBS und fügen Sie 100 μL DMEM ohne Phenolrot hinzu, ergänzt mit 2% FCS. HINWEIS: Nach 48 h (2 Tage nach der Infektion) sind intrazytoplasmatische Amastigoten mit einem Optikusmikroskop sichtbar. Phenolrot, ein pH-Indikator in DMEM und anderen Zellkulturmedien, könnte die Absorptionsmessung von CPRG stören. Wenn DMEM ohne Phenolrot nicht verfügbar ist, siehe die unten in Abschnitt 3.2.1 genannten Alternativen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trypomastigote Präparat<ol>
<li>Bereiten Sie eine Suspension von 1 × 106 Vero-Zellen/ml in DMEM vor, ergänzt mit 2% FCS und Saatgut 800.000 Zellen in 5 ml des Mediums in T-25-Kolben. Inkubieren Sie über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO2, um die Zelladhärenz sicherzustellen. HINWEIS: Für einen T-75-Kolben Samen 2 × 106 Zellen in einem Endvolumen von 15 ml.</li>
		<li>Nach der Inkubation zweimal mit 3 ml sterilem 1x PBS abspülen. T. cruzi Dm28c/pLacZ Trypomastigotes bei einem MOI von 10 in 5 ml DMEM mit 2% FCS (8 ×10 6 Trypomastigotes für einen T-25-Kolben) hinzufügen. HINWEIS: Für einen T-75-Kolben fügen Sie 20 ×10 6 Trypomastigotes in einem Endvolumen von 15 ml DMEM mit 2% FCS hinzu.</li>
		<li>Inkubieren über Nacht (12-16 h) bei 37 °C und 5% CO2. Waschen Sie den Kolben zweimal mit 3 ml 1x PBS und fügen Sie 5 ml frisches DMEM hinzu, ergänzt durch 2% FCS. Bei 37 °C und 5% CO2 vier Tage lang inkubieren.</li>
		<li>Überprüfen Sie den Überstand auf Trypomastigoten unter einem optischen Mikroskop. Quantifizieren Sie die Trypomastigotes, indem Sie sie in einer Neubauer-Kammer zählen. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 7.000 × g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet, um eine Konzentration von 1 × 106 Trypomastigotes/ml in DMEM ohne Phenolrot, ergänzt mit 2% FCS, zu erhalten. Samen Sie 100 μL der Trypomastigot-Suspension (100.000 Trypomastigoten pro Well) in einer 96-Well-Platte. HINWEIS: Wenn DMEM ohne Phenolrot nicht verfügbar ist, siehe Alternativen weiter unten in Abschnitt 3.2.1.</li>
	</ol></li>
</ol>3. β-Galactosidase-Assay
HINWEIS: Die Quantifizierung der β-Galactosidase-Aktivität wird als indirekte Methode zur Bestimmung der Anzahl der Parasiten verwendet. Es wird erwartet, dass das Wachstum in Gegenwart einer trypanozidalen Verbindung gehemmt wird, was zu einer geringeren Anzahl von Parasiten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle führt, was sich in einer geringeren β-Galactosidase-Aktivität und damit einer geringeren Absorption widerspiegelt.
<ol><li>Inkubieren Sie die Parasiten mit BZN.<ol>
<li>100 μL entsprechender 2x BZN-Lösung pro Well, um eine Endkonzentration von BZN von 80, 40, 20, 10, 5 und 2,5 μM bis 100 μL Epimastigot-Suspension (aus Schritt 2.1), Vero-Zellen mit Amastigotes (2 Tage nach der Infektion) (Schritt 2.2) oder Trypomastigotes (Schritt 2.3) in einer 96-Well-Platte zu erreichen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Epimastigoten bei 28 °C für 72 h und die Trypomastigotes oder infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten für 24 h bei 37 °C und 5% CO2. HINWEIS: Jede Arzneimittelkonzentration sollte mindestens dreifach bewertet werden und Kontrollkulturen von Epimastigoten, Trypomastigoten und infizierten Vero-Zellen mit DMSO umfassen (siehe Schritt 1.2.2.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Kolorimetrische Reaktion<ol>
<li>Wenn sich infizierte Vero-Zellen oder Trypomastigoten nach der Inkubationszeit der Behandlung in DMEM mit Phenolrot befinden, ersetzen Sie das Medium durch 100 μL 1x PBS, um Interferenzen zu vermeiden. Führen Sie dreifach leere Vertiefungen durch, die nur 100 μL des entsprechenden Mediums (oder 1x PBS) enthalten. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, das Kulturmedium für Epimastigoten bei LIT-Medium oder DMEM ohne Phenolrot zu entfernen. DMEM mit Phenolrot kann weiterhin verwendet werden; Bereiten Sie eine Leerbohrung mit DMEM allein vor, um die Basisabsorption zu messen, und subtrahieren Sie diesen Wert dann während der Datenanalyse (Schritt 3.3.). Schneiders Insektenmedium, das farblos ist, ist eine Alternative für Epimastigoten.</li>
		<li>Geben Sie 40 μL CPRG-Substratlösung und 10 μL der Reinigungsmittellösung zu jeder Vertiefung, um eine Endkonzentration von 200 μM CPRG und 0,1% Reinigungsmittel in einem Endvolumen von 250 μL in jeder Vertiefung zu erhalten. HINWEIS: Die CPRG-Lösung und das Reinigungsmittel können in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung hinzugefügt werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie bei 37 °C für 2 h und messen Sie die Absorption bei 595 nm in einem Mikroplatten-Spektralphotometer. HINWEIS: Die erwartete Farbänderung ist gelb zu rötlich-braun bei enzymatischer Spaltung der β-Galactosidase (Abbildung 2A). Die Inkubationszeit kann auf bis zu 4 h verlängert werden, und die Absorptionsspektren von Chlorphenolrot können mit ähnlichen Kurvenanpassungen zwischen 570 und 595 nm abgelesen werden (Ergänzende Abbildung S1A,B). Die Inkubation für bis zu 24 h in Gegenwart von CPRG-Substrat hat ähnliche Kurvenverschraubungen gezeigt (Ergänzende Abbildung S1C).<ol>
<li>Erstellen Sie in einem Mikroplatten-Spektralphotometer mit einem Monochromator-Selektor ein neues Protokoll in der Gerätesoftware (Ergänzende Abbildung S2).</li>
			<li>Klicken Sie auf Absorption als Erkennungsmethode | Endpunkt als Lesetyp | ok (ergänzende Abbildung S2A). Fügen Sie einen Leseschritt hinzu, geben Sie die ausgewählte Wellenlänge ein und klicken Sie auf OK (Ergänzende Abbildung S2B).</li>
			<li>Markieren Sie im Abschnitt Plattenlayout die zu lesenden Vertiefungen und klicken Sie auf OK (Ergänzende Abbildung S2C). Um die Platte zu lesen, legen Sie sie in das Fach ein und klicken Sie auf Read Plate. Warten Sie, bis die Werte auf dem Bildschirm angezeigt werden (Ergänzende Abbildung S2D) und exportieren Sie sie in eine Tabelle, um die Ergebnisse zu analysieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Datenanalyse und Berechnung der Medieninhibitorkonzentration (IC50)<ol>
<li>Subtrahieren Sie den Blindwert, der nur dem LIT-Medium, 1x PBS oder DMEM mit oder ohne Phenolrot entspricht, zuzüglich der CPRG-Reinigungsmittellösung. Wenn Sie die trypanozide Aktivität farbiger Verbindungen testen, messen Sie die Absorption zusätzlicher Blindkontrollen mit LIT oder DMEM mit jeder Konzentration des verwendeten Arzneimittels und subtrahieren Sie diese Werte dann von den Absorptionswerten, die mit den Parasiten bei jeder Konzentration erhalten werden. HINWEIS: Die Ergänzungstabelle S2 zeigt typische Werte, die in diesem Assay mit diesen Medien ohne Parasiten plus CPRG-Reinigungsmittellösung erhalten wurden. Die Unterschiede vor und nach der Zugabe von CPRG sind signifikant, stören aber nicht den Assay mit Parasiten (Supplemental Table S2).</li>
		<li>In statistischer Analysesoftware wird die Konzentration von BZN (in μM) im Vergleich zur Absorption bei 595 nm in einer xy-Tabelle dargestellt. Transformieren Sie die BZN-Konzentrationen in logarithmische Werte, indem Sie auf die Schaltfläche Analysieren klicken, die Option Transformieren auswählen | die x-Werte mit der Option x=log(x) transformieren und auf die Schaltfläche OK klicken.</li>
		<li>Beziehen Sie die IC50-Werte aus der statistischen Analysesoftware. HINWEIS: Der IC 50 ist definiert als die Arzneimittelkonzentration, die das Parasitenwachstum im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um50 % reduziert und als Wendepunkt der sigmoidalen Funktion berechnet wird, die zur Kurve passt.<ol>
<li>Klicken Sie in der statistischen Analysesoftware auf die Schaltfläche Analysieren, wählen Sie in der xy-Analyseliste Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) und klicken Sie auf OK.</li>
			<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Modell des Fensters Parameter in der Dosis-Wirkungs-Wirkungs-Gruppe der integrierten Gleichungen die Option Dosis-Wirkungs-Methode aus : log (inhibitor) vs. response - Variable Slope (vier Parameter). Lassen Sie alle anderen Registerkarten auf Standardwerten. Klicken Sie auf OK.</li>
			<li>Klicken Sie auf den Ergebnisbereich der statistischen Analysesoftware, um den IC50-Wert, den SD und die Güte der Passform zu finden.</li>
			<li>Klicken Sie auf den Diagrammabschnitt, um das XY-Diagramm der logarithmischen Konzentration des Arzneimittels im Vergleich zu den Absorptionswerten zu finden. Achten Sie darauf, dass die Kurvenanpassung auch in einer anderen Farbe grafisch dargestellt ist. HINWEIS: Ein kostenloses Online-IC50-Berechnungstool finden Sie unter https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Dieses Papier beschreibt einen Assay, der auf der Bestimmung der zytoplasmatischen β-Galactosidase-Aktivität basiert, die aufgrund der Membranlyse von T. cruzi epimastigotes, Trypomastigotes oder infizierten Zellen mit Amastigotes in Gegenwart des Substrats CPRG freigesetzt wird. Wir verwendeten T. cruzi Dm28c/pLacZ-Parasiten, einen stabilen Parasitenstamm, der nach Transfektion mit einem β-Galactosidase-tragenden Plasmid erhalten wurde, das von Buckner und Co-Autoren10 konstruie...

Die Chagas-Krankheit (ChD) oder amerikanische Trypanosomiasis ist eine parasitäre Erkrankung, die durch den geißelten Protozoen Trypanosoma cruzi (T. cruzi) verursacht wird. ChD beginnt mit einer asymptomatischen oder oligosymptomatischen akuten Phase, die normalerweise nicht diagnostiziert wird, gefolgt von einer lebenslangen chronischen Phase. In der Chronizität manifestieren ~ 30% der Patienten Jahrzehnte nach der Infektion eine Vielzahl von schwächenden Zuständen, einschließlich Myokardiopathie, Mega-Verdauungssyndrome oder beides, mit einer Sterblichkeitsrate von 0,2% bis 20%1,2,3. Asymptomatische chronische Patienten haben möglicherweise keine klinischen Symptome, bleiben aber ihr ganzes Leben lang seropositiv.
Schätzungen zufolge sind weltweit ~ 7 Millionen Menschen infiziert, hauptsächlich aus Lateinamerika, wo ChD endemisch ist. In diesen Ländern wird T. cruzi hauptsächlich durch infizierte blutsaugende Triatomin-Käfer (vektorübertragene Übertragung) und seltener durch orale Übertragung durch die Aufnahme von Lebensmitteln übertragen, die mit Triatomin-Kot kontaminiert sind, der die Parasiten enthält2. Darüber hinaus kann der Parasit über die Plazenta von chagasischen Müttern auf Neugeborene, durch Bluttransfusionen oder während der Organtransplantation übertragen werden. Diese vektorunabhängigen Wege, die Infektion und die menschliche Migration zu erfassen, haben zur weltweiten Ausbreitung der Krankheit beigetragen, was sich in einer zunehmenden Zahl von Fällen in Nordamerika, Europa und einigen Ländern Afrikas, des östlichen Mittelmeerraums und des westlichen Pazifiks zeigt4. ChD gilt als vernachlässigte Krankheit, da die vektorübertragene Übertragung eng mit Armut verbunden ist und ein führendes Problem der öffentlichen Gesundheit ist, insbesondere in lateinamerikanischen Ländern mit niedrigem Einkommen. Obwohl es verfügbare Behandlungen gibt, ist die Mortalität aufgrund von ChD in Lateinamerika die höchste unter den parasitären Krankheiten, einschließlich Malaria2.
Es gibt zwei registrierte Medikamente für die ChD-Behandlung, die in den späten 1960er und frühen 1970er Jahren eingeführt wurden: Nifurtimox und Benznidazol5. Beide Medikamente sind in der akuten Phase der Erkrankung bei Erwachsenen, Kindern und angeborenen Neugeborenen sowie bei Kindern mit chronischer Infektion, bei denen die Heilung normalerweise erreicht wird, wirksam. Allerdings werden nur wenige Menschen früh genug diagnostiziert, um rechtzeitig behandelt zu werden. Nach den neuesten klinischen Studien haben beide Medikamente bei Erwachsenen erhebliche Einschränkungen und waren bei der Verringerung der Symptome bei Menschen mit chronischen Erkrankungen unwirksam; Daher ist ihre Verwendung in diesem Stadium umstritten. Weitere Nachteile sind die verlängerten Behandlungszeiten (60-90 Tage) und die häufigen, schwerwiegenden Nebenwirkungen, die bei einem Anteil der Infizierten 6,7 zum Absetzen der Therapie führen. Es wird geschätzt, dass weniger als 10% der Menschen mit ChD diagnostiziert wurden, und noch weniger haben Zugang zu Behandlung, da viele betroffene Personen in ländlichen Gebieten ohne oder mit knappem Zugang zur Gesundheitsversorgung leben8. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, neue Medikamente gegen T. cruzi zu finden, um effizientere, sicherere und auf das Feld anwendbare Behandlungen zu ermöglichen, insbesondere für die chronische Phase. In diesem Zusammenhang ist eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung wirksamerer Verbindungen die Einschränkung von Systemen zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in vitro und in vivo9.
Obwohl chemische Biologie und genomische Ansätze zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffziele in Kinetoplastid-Parasiten verwendet wurden, sind die verfügbaren genomischen Werkzeuge in T. cruzi im Gegensatz zu T. brucei oder Leishmania begrenzt. Daher ist das Screening von Verbindungen mit trypanozidaler Aktivität immer noch der am häufigsten verwendete Ansatz bei der Suche nach neuen chemotherapeutischen Arzneimittelkandidaten gegen ChD. Normalerweise muss die Arzneimittelentdeckung in T. cruzi mit der Prüfung der Wirkungen eines neuen Arzneimittels in einem In-vitro-Assay gegen das Epimastigote-Stadium beginnen. Jahrzehntelang war die einzige Möglichkeit, die hemmenden Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf T. cruzi zu messen, die manuelle mikroskopische Zählung, die mühsam, zeitaufwendig und bedienerabhängig ist. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für die Untersuchung einer kleinen Anzahl von Verbindungen, ist jedoch für das Hochdurchsatz-Screening großer Verbindungsbibliotheken inakzeptabel. Heutzutage beginnen viele Untersuchungen mit der Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, die in vitro untersucht werden, um ihre Fähigkeit zur Hemmung des Parasitenwachstums zu testen. Sowohl kolorimetrische als auch fluorometrische Methoden wurden entwickelt, um den Durchsatz in diesen Assays zu erhöhen, die Objektivität des Screenings zu verbessern und den gesamten Prozess weniger langwierigzu machen 9.
Eine der am weitesten verbreiteten kolorimetrischen Methoden basiert auf der β-Galactosidase-Aktivität transfizierter Parasiten, die erstmals von Bucknet und Mitarbeiternbeschrieben wurde 10. Das von den rekombinanten Parasiten exprimierte β-Galactosidase-Enzym hydrolysiert das chromogene Substrat, Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu Chlorphenolrot, das mit einem Mikroplattenspektralphotometer leicht kolorimetrisch gemessen werden kann. So kann das Parasitenwachstum in Gegenwart einer Vielzahl von Verbindungen gleichzeitig bewertet und in Mikrotiterplatten quantifiziert werden. Diese Methode wurde angewendet, um Medikamente in Epimastigot-Formen (im Insektenvektor vorhanden), Trypomastigotes und intrazellulären Amastigotes, den Säugetierstadien des Parasiten, zu testen. Darüber hinaus sind bereits mehrere rekombinante T. cruzi-Stämme verfügbar, die mit dem pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-Plasmid (pLacZ)10 transfiziert wurden, um das Escherichia coli-β-Galactosidase-Enzym zu exprimieren (und neue können konstruiert werden), was die Bewertung von Parasiten aus verschiedenen diskreten Typisierungseinheiten (DTUs) ermöglicht, die sich möglicherweise nicht gleichmäßig gegenüber denselben Verbindungen verhalten 10,11,12,13 . Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Bewertung von Verbindungen auf Aktivität gegen T. cruzi im Niedrig- und Hochdurchsatz-Screening12,13 eingesetzt. Ähnliche Ansätze wurden auch bei anderen Protozoenparasiten verwendet, darunter Toxoplasma gondii und Leishmania mexicana14,15.
Dieses Papier beschreibt und zeigt eine detaillierte Methode für ein In-vitro-Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von T. cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren. Die hier vorgestellten Assays wurden mit einer β-Galactosidase-exprimierenden T. cruzi-Linie durchgeführt, die durch Transfektion von T. cruzi Dm28c-Stamm aus DTU I13 mit pLacZ-Plasmid (Dm28c/pLacZ) erhalten wurde. Darüber hinaus könnte das gleiche Protokoll leicht an andere Stämme angepasst werden, um die Leistung zwischen Verbindungen und zwischen T. cruzi-Stämmen oder DTUs zu vergleichen.

<table><tbody><tr><td>1 l Becherglas</td><td>Schott Duran</td><td>10005227</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette steril</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP211010</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serologische Pipette steril</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419656</td><td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazol-1-acetamid</td></tr><tr><td>Biosicherheitsschrank</td><td>Telstar</td><td>Bio II A/P</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15 mL</td> steriler Boden <td>Tarson</td><td>546021</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 mL steriler Boden mit konischem Boden</td><td>Tarson</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-15A</td><td></td></tr><tr><td>CPRG</td><td>Roche</td><td>10 884308001</td><td>Chlorphenolrot-&beta;- D-Galactopyranosid</td></tr><tr><td>DMEM, Thermo</td><td>Fisher Cientific</td><td>12100046</td><td>Pulver</td>mit hohem Glukosegehalt</tr><tr><td>DMSO</td><td>Sintorgan</td><td>SIN-061</td><td>Dimethylsulfoxid</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Internegocios SA</td><td>FCS FRA 500</td><td>Sterile und hitzeinaktivierte</td></tr><tr><td>G418-Dissulfatsalzlösung</td><td>Roche</td><td>G418-RO</td><td>Stammkonzentration: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Glukose D(+)</td><td>Cicarelli</td><td>716214</td><td></td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Nalgene</td><td>3663-1000</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Cicarelli</td><td>867212</td><td></td></tr><tr><td>Leberinfusion</td><td>Difco</td><td>226920</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Tarson</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Biotek</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Cicarelli</td><td>834214</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Cicarelli</td><td>750214</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Kammer</td><td>Boeco</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Antrace</td><td>NIDP40</td><td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Software für statistische</td></tr><tr><td>Analysen: Natriumbicarbonat</td>, <td>Cicarelli</td><td>929211</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16, Zentrifuge</td>, <td>Thermo Fisher Cientific</td><td>75004380</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Kolben</td>, <td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Tryptose</td>, <td>Merck</td><td>1106760500</td><td></td></tr><tr><td>Vero Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1587</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro arzneimittelscreening gegen alle lebenszyklusstadien von trypanosoma cruzi unter verwendung von parasiten, die β-galactosidase exprimieren

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit (ChD), einer endemischen Krankheit von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit in Lateinamerika, die aufgrund der Zunahme der Migration auch viele nicht-endemische Länder betrifft. Diese Krankheit betrifft fast 8 Millionen Menschen, wobei neue Fälle auf 50.000 pro Jahr geschätzt werden. In den 1960er und 70er Jahren wurden zwei Medikamente zur ChD-Behandlung eingeführt: Nifurtimox und Benznidazol (BZN). Beide sind wirksam bei Neugeborenen und während der akuten Phase der Krankheit, aber nicht in der chronischen Phase, und ihre Verwendung ist mit wichtigen Nebenwirkungen verbunden. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die Suche nach neuen Medikamenten gegen T. cruzi zu intensivieren.
T. cruzi wird durch hämatophage Insektenvektoren der Familien Reduviidae und Hemiptera übertragen. Einmal im Säugetierwirt, multipliziert es sich intrazellulär als die nicht geißelte amastigote Form und differenziert sich in die Trypomastigote, die nicht-replizierende infektiöse Form des Blutkreislaufs. Innerhalb des Insektenvektors wandeln sich Trypomastigoten in das Epimastigote-Stadium um und vermehren sich durch binäre Spaltung.
Diese Arbeit beschreibt einen Assay, der auf der Messung der Aktivität der zytoplasmatischen β-Galactosidase, die aufgrund der Parasitenlyse in die Kultur freigesetzt wird, unter Verwendung des Substrats Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG) basiert. Zu diesem Zweck wurde der T. cruzi Dm28c-Stamm mit einem β-Galactosidase-überexprimierenden Plasmid transfiziert und für das pharmakologische In-vitro-Screening in Epimastigote-, Trypomastigote- und Amastigote-Stadien verwendet. Dieses Papier beschreibt auch, wie man die enzymatische Aktivität in kultivierten Epimastigoten, infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten und Trypomastigotes, die aus den kultivierten Zellen freigesetzt werden, am Beispiel des Referenzarzneimittels, Benznidazol, messen kann. Dieser kolorimetrische Assay ist einfach durchzuführen und kann auf ein Hochdurchsatzformat skaliert und auf andere T. cruzi-Stämme angewendet werden.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden β-Galactosidase-exprimierende Dm28c-Epimastigoten mit 6 Konzentrationen von BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (oder interessanten Verbindungen) für 72 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde CPRG-Reagenz zusammen mit Reinigungsmittel hinzugefügt, das die Zellen lysiert und β-Galactosidase freisetzt. CPRG wird durch die β-Galactosidase gespalten, um Chlorphenolrot zu erzeugen, was zu einer Farbänderung von gelb zu rötlich führt (Abbildung 2A). Chlorpheno...

Wir beschreiben einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der β-Galactosidase-Aktivität in drei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit. Dieser Assay kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay in den drei Lebenszyklusphasen von Trypanosoma cruzi zur Identifizierung neuer Arzneimittelkandidaten für die Chagas-Krankheit. Dies kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren. Das Verfahren wird von Romina Manarin, einer Laborzellkulturtechnikerin aus dem Labor von Pamela crib, demonstriert.Beginnen Sie mit der Kultivierung von Beta-Galactosidase, die Trypanosoma cruzi epimastigotes in einem T-25-Gewebekulturkolben exprimieren, und inkubieren Sie bei 28 Grad Celsius, um sie axenisch zu züchten. Quantifizieren Sie mit einer Neubauer-Kammer das Parasitenwachstum, bevor Sie subkultivieren. Um die Kulturen in einer logarithmischen Phase zu halten, subkulturieren Sie alle 48 bis 72 Stunden in fünf Millilitern LIT-Medium, ergänzt mit 10% FCS und Geneticin in Sulfat bei einer Endkonzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter.Schließen Sie dann die Kappe sicher, bevor Sie bei 28 Grad Celsius in vertikaler Position inkubieren. Aus der Log-Phase-Kultur wird eine Suspension von Epimastigot in LIT-Medium hergestellt, die mit Geneticin und Sulfat in

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In diesem Video beschreiben wir eine einfache und robuste Methode zur Bestimmung des zytotoxischen Potenzials eines Trypanozid-Medikaments gegen einen Parasiten, Trypanosoma cruzi, das das Enzym β-Galactosidase exprimiert. β-Galactosidase dient als Indikator für die Zelllyse, und seine Aktivität kann verwendet werden, um die Wirkung des Medikaments zu beurteilen.

β-Galactosidase-Assay zur Bewertung der arzneimittelinduzierten Zytotoxizität bei Parasiten

In diesem Protokoll Eindringmittel beschrifteten T. Trypanosoma wurden in durchsichtigen Zebrafischlarven injiziert und Parasiten Motilität wurde in Vivo mit Lichtblattmikroskopie Fluoreszenz beobachtet.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Die Trypanosomen Trypanosoma Agent der Chagas-Krankheit produziert langlebige asymptomatische Infektionen, die abrupt in klinisch anerkannten Pathologie zu entwickeln. Die folgenden Forschungs-Protokoll beschreibt eine kurzfristige familienbasierte epidemiologische Studie um die T. Trypanosoma Infektion, sexuell übertragbare von übergeordneten an Nachkommen zu entwirren.

Sexuelle Übertragung von amerikanischen Trypanosomen von Männchen und Weibchen zu Naive Mates

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Einführung eines Genknockouts in den extrazellulären Amastigot von Trypanosoma cruzi, mit dem CRISPR/Cas9-System. Dem Wachstumsphänotyp kann entweder durch Zellzählung der axtischen Amastigotenkultur oder durch Proliferation intrazellulärer Amastigoten nach der Invasion der Wirtszelle gefolgt werden.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis- und L . donovani-Stämmen verwendet wird, die das Gen für eGFP als stabiles integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Transfizierte Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität in beiden Spezies wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.

Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

Diese Studie zeigt ein detailliertes Protokoll zur Durchführung der Ultrastrukturexpansionsmikroskopie in drei in vitro Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger, der für die Chagas-Krankheit verantwortlich ist. Wir schließen die optimierte Technik für Zytoskelettproteine und die Pan-Proteom-Markierung ein.

Ultrastrukturelle Expansionsmikroskopie in drei in vitro Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi

Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Durchführung von Arzneimittelwirksamkeitsstudien in einem biolumineszierenden Modell der Trypanosoma cruzi-Infektion , wobei der Schwerpunkt auf der Datenerfassung, -analyse und -interpretation liegt. Fehlerbehebungs- und Qualitätskontrollverfahren zur Minimierung technischer Probleme werden ebenfalls bereitgestellt.

Entmystifizierung der In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung eines Mausmodells für die Chagas-Krankheit für Wirksamkeitsstudien von Arzneimitteln

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening für Trypanosoma cruzi in allen drei Lebenszyklusstadien. Diese kolorimetrische Methode mit β-Galactosidase ermöglicht die schnelle Identifizierung neuer trypanozider Wirkstoffe gegen Chagas-Krankheit.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren (Video) | JoVE Journal

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

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