Name: Tiefengewebs-Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in intaktem Maus- und Zebrafischgehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Drei-Photonen-Mikroskopie für tiefengewebliche Bildgebung im intakten Maus- und Zebrafischgehirn. Diese Methode ermöglicht hochauflösende neuronale Studien zu neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer.

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Diese Arbeit wurde von NSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex Hub und NIH 1U01NS103516 unterstützt.

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Dieses Protokoll erklärt Schritt-für-Schritt-Verfahren zum Einrichten der 3P-Bildgebung mit einem kommerziellen Mikroskop und einer Laserquelle. Im Vergleich zu 2PM hat 3PM einen Vorteil bei Anwendungen, die einen optischen Zugang in den tieferen Regionen erfordern, wie z.B. im Hippocampus des Mausgehirns. Obwohl 3PM hauptsächlich in den Neurowissenschaften verwendet wird, kann 3PM möglicherweise in anderen Geweben wie Lymphknoten, Knochen und Tumoren zur Tiefengewebsbeobachtung angewendet werden.
Es ist wichtig zu überprüfen, ob das Bildgebungssystem nahe an der Schussrauschgrenze arbeitet, wodurch sichergestellt wird, dass die Erkennungs- und Datenerfassungselektronik nach den PMTs ein vernachlässigbares Rauschen zum Bild beiträgt. Die Unsicherheit in der Anzahl der detektierten Photonen wird durch Photonenschussrauschen grundlegend begrenzt. Eine begrenzte Leistung bei Schussrauschen kann in einem typischen Multiphotonenmikroskop mit einem Photodetektor mit hoher Verstärkung (z. B. einem PMT) erreicht werden. Das Photonenschussrauschen folgt einer statistischen Poisson-Verteilung, wobei die Standardabweichung der Verteilung gleich der Quadratwurzel des Mittelwerts der Verteilung ist. Führen Sie Schritt 1.14 im Protokollabschnitt aus, um die eingeschränkte Leistung des Aufnahmerauschens zu überprüfen.
Um eine Lichtdämpfung durch H2O zu vermeiden, ist die Verwendung vonD2Ozum Eintauchen hilfreich, insbesondere bei einer Anregung von ~1.700 nm. WennD2Overwendet wird, ist es wichtig, D 2 O alle ~ 10 Minuten zu aktualisieren oder ein großes Volumen von D 2 O zu verwenden, um einen Austausch von D2 O / H2O während der Bildgebung zu vermeiden. Man kann die D2O auch aus der Raumumgebung3 abdichten. Wenn für die Bildgebung ein Objektiv mit langem Arbeitsabstand (WD) (z. B. WD bei 4 mm oder länger) verwendet wird, kann die Dicke der Tauchflüssigkeit 2-3 mm überschreiten. Die erhöhte Dicke macht die H2O-Absorption auch bei ~1.300 nm21 nicht zu vernachlässigen. Daher kann D2O auch für 1.300 nm 3PM erforderlich sein, wenn ein langes WD-Objektiv verwendet wird.
Da die 3P-Fluoreszenzintensität vom Würfel der Anregungspulsenergie am Fokus abhängt (Gl. (1)), ist die Einstellung der entsprechenden Laserleistung besonders wichtig, um ausreichende 3P-Fluoreszenzsignale zu erhalten und gleichzeitig thermische und nichtlineare Schäden in lebendem Gewebe zu vermeiden. Die durchschnittliche Laserleistung sollte unter der thermischen Schadensschwelle gehalten werden. Im Gehirn der Maus zum Beispiel, um thermische Gewebeschäden zu vermeiden, sollte die durchschnittliche Leistung auf der Gehirnoberfläche der Maus bei oder unter ~ 100 mW für ~ 1.300 nm Anregung in einer Tiefe von 1 mm und mit einem Sichtfeld (FOV) von 230 μm x230 μm 21 gehalten werden. Ebenso sollte die durchschnittliche Leistung bei ~1.700 nm bei oder unter ~50 mW in ~1 mm Tiefe und einem FOV von ~230 μm x 230 μm gehalten werden (unveröffentlichte Daten). Um eine Anregungssättigung und mögliche nichtlineare Schäden zu vermeiden, sollte die Anregungsimpulsenergie bei ~ 1.300 nm bzw.~ 1.700 nm Anregung bei <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">~ <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">1.300 nm gehalten werden.
Aufgrund der Lichtabsorption und -streuung in Geweben wird die Pulsenergie im Fokus nach dem Eindringen von Geweben durch 1 EAL auf 1/e (~ 37%) abgeschwächt. Die EAL variiert in verschiedenen Geweben und mit den Anregungswellenlängen, z.B. im Neokortex des Mausgehirns, beträgt die EAL ~300 μm und ~400 μm bei ~1.300 nm bzw. ~1.700 nm bzw. 3,29 (Abbildung 5). Um also die gleiche Pulsenergie im Fokus (z. B. 1 nJ / Puls) in einer Tiefe von n EALs zu halten, muss die Oberflächenpulsenergie mit 1 nJ × en multipliziert werden. Für eine schnelle Abbildung der Struktur- und Funktionsdynamik ist ein Anregungslaser mit einer hohen Wiederholrate (bei 1 MHz oder höher) wünschenswert, um eine hohe Bildratevon 5,6,7,10 zu erreichen. Der Pulsenergiebedarf und die durchschnittliche Laserleistungsgrenze schränken jedoch die anwendbare Wiederholrate ein.
Wenn wir beispielsweise einen mäßig tiefen Bereich bei 4 EALs (dh ~ 1,2 mm im Mauskortex mit 1.300 nm Anregung) abbilden, sind ~ 55 nJ / Puls an der Oberfläche erforderlich, um 1 nJ / Puls im Fokus zu halten. Wenn die durchschnittliche Leistungsbegrenzung 100 mW beträgt, können wir eine Laserwiederholrate von ~ 2 MHz anwenden. Um jedoch tiefer in einer Tiefe von 7 EALs zu fotografieren, sind ~ 1.100 nJ / Puls an der Oberfläche erforderlich, um 1 nJ / Puls im Fokus zu halten. Unter der Annahme, dass die maximale durchschnittliche Leistung 100 mW beträgt, um thermische Schäden zu vermeiden, sollte die Laserwiederholrate auf 0,1 MHz reduziert werden, um einen Puls von 1.100 nJ / Puls an der Oberfläche zu erreichen. Tabelle 1 fasst typische Bildgebungsbedingungen in der Hirnrinde der Maus zusammen. Beachten Sie, dass bei den Abbildungstiefen in Tabelle 1 davon ausgegangen wird, dass die EAL im gesamten Mauskortex einheitlich ist.
Darüber hinaus besteht aufgrund der Laserleistungsbegrenzung im Tiefengewebe 3PM ein Kompromiss zwischen der Bildrate und der Bildpixelgröße, der besonders für die funktionelle Bildgebung wie die Kalziumbildgebung wichtig ist. Die maximal verfügbare Laserwiederholrate wird in jeder Tiefe basierend auf der erforderlichen Pulsenergie im Fokus und der anwendbaren durchschnittlichen Laserleistung, wie oben diskutiert, festgelegt, z. B. 2 MHz in einer Tiefe, die ~ 4 EALs mit 1.300 nm Anregung entspricht. Im Allgemeinen erfordert die Bildgebung mindestens einen Impuls pro Pixel. Dementsprechend wird die minimal verfügbare Pixelverweilzeit durch die Laserwiederholrate bestimmt, z.B. 0,5 μs/Pixel bei 2 MHz Anregung.
Um die hohe räumliche Auflösung (~1 μm in lateral) in 3P-Bildern beizubehalten, ist es ideal, 1 Pixel auf eine Fläche von ~1 μm 2 einzustellen, z.B. 256 x 256 Pixel für ein FOV von 250 x 250 μm2. Um eine schnelle Bildgebung mit einem beträchtlich großen Sichtfeld (z. B. 250 x 250 μm 2 mit 256 x256 Pixeln), 0,5 MHz, 1 MHz und 2 MHz Pulswiederholraten durchzuführen, ergeben sich theoretische maximale Bildraten von ~ 7,6, ~ 15 bzw. ~ 30 Bildern / s. Ebenso ist die Optimierung der Laserwiederholrate in Abhängigkeit von der Zieltiefe, der Scangeschwindigkeit und dem FOV unerlässlich, um eine ausreichende Pulsenergie unterhalb der thermischen Schadensschwelle anzuwenden. Um die Bildgebungsgeschwindigkeit zu erhöhen, kann eine adaptive Erregungsquelle verwendet werden, um alle Erregungsimpulse auf die Neuronen (d.h. Regionen von Interesse) zu konzentrieren, indem Laserpulse bei Bedarf an die Neuronenabgegeben werden 31.
3PM ist vorteilhaft im Vergleich zu 2PM in der Tiefenbildgebung innerhalb lebender Gewebe und durch stark streuende Medien wie einen Schädel, Knochen und die weiße Substanzschicht (dh die äußere Kapsel) des Mausgehirns. Die längere EAL und die nichtlineare Anregung höherer Ordnung von 3PE kommen der Tiefengewebebildgebung zugute. Um beispielsweise GCaMP6 im Mauskortex abzubilden, ist das 2P-Fluoreszenzsignal mit einer Anregung von 920 nm höher als das 3P-Fluoreszenzsignal mit einer Anregung von 1.300 nm in flachen Regionen bei <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">690 μm (dh ~ 2,3 EALs bei 1.300 nm)21. Aufgrund der längeren EAL bei 1.300 nm im Vergleich zu 920 nm ergibt 3PE jedoch eine stärkere Fluoreszenz als die 2P-Anregung (2PE) in einer Tiefe von ~690 μm und tiefer 21. Diese Tiefe ist definiert als "Signalübergangstiefe", bei der die Fluoreszenzsignalstärken von 2PE und 3PE mit der gleichen Wiederholrate und den gleichen maximal zulässigen Durchschnittsleistungenidentisch sind 21. Die Signalübergangstiefe hängt von den Anregungswellenlängen für 2PE und 3PE und dem Fluorophor ab.
In der Praxis ermöglicht die Anregung von 920 nm aufgrund der geringeren Wasseraufnahme eine höhere durchschnittliche Laserleistung als die Anregung von 1.300 nm. Die höhere durchschnittliche Leistung von 2PE würde die Signalübergangstiefe jedoch nur um 0,9 EALs4 erhöhen. Wenn die Probe dicht markiert ist, hat 3PE außerdem den zusätzlichen Vorteil einer viel höheren SBR. Daher kann 3PM bereits vor Erreichen der Signalübergangslänge besser für die Bildgebung sein als 2PM. Bei der Abbildung des Gehirngefäßsystems der Maus, das einen Volumenanteil (d. h. eine Markierungsdichte) von ~ 2% aufweist, übertrifft beispielsweise 1.300 nm 3PM mit 100 mW Erregungsleistung 920 nm 2PM mit 200 mW Anregungsleistung in einer Tiefe von ~ 700 μm für Fluorescein.
3PM hat auch einen Vorteil bei der Abbildung durch eine dünne, aber stark streuende Schicht, die die Punktspreizungsfunktion des Anregungsstrahls verzerren und einen Defokussierungshintergrund erzeugenkann 4. Zum Beispiel leiden 2PM-Bilder durch den intakten Schädel des Mausgehirns selbst in der geringen Tiefe von &lt;100 μm von der Gehirnoberfläche 13 unter dem Defokussierungshintergrund. Ein ähnlicher Defokushintergrund wurde in 2PM mit 1.280 nm Anregung durch die weiße Substanz im Gehirn der Mausbeobachtet 32. Wenn Gewebe durch trüben Schichten abgebildet werden, ist daher 3PM für kontrastreiche Bildgebung unabhängig von der Markierungsdichte besser als 2PM.
Wir berichteten kürzlich über ein Perlenphantom und eine theoretische Analyse, die zeigt, dass die Bildtiefengrenze von 3PM über 8 EALs33 liegt; 8 EALs entsprechen ~3 mm mit ~1.700 nm Anregung im Mauskortex. Der derzeit verfügbare Laser hat jedoch nicht genug Pulsenergie, um 8 EALs im Gehirn der Maus zu erreichen. Die Weiterentwicklung stärkerer Laser wird die derzeitige Abbildungstiefengrenze von 3PM verschieben.

In den Biowissenschaften waren Multiphotonenmikroskopie-Techniken (MPM) wie 2PM und 3PM leistungsstarke Werkzeuge für die tiefe In-vivo-Bildgebung mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung und hohem Kontrast in streuenden Geweben. Darüber hinaus verursachen diese Methoden weniger Photobleichen im Vergleich zur konfokalen Ein-Photonen-Mikroskopie 1,2,3,4. 3PM ist vorteilhaft für tiefere Gewebebildgebung im Vergleich zu 2PM aufgrund von zwei Hauptmerkmalen: (i) Die Verwendung einer längerwelligen Anregung (~ 1.300 nm oder ~ 1.700 nm) reduziert die Gewebestreuung und (ii) der Anregungsprozess höherer Ordnung (dh das Fluoreszenzsignal hängt vom Würfel der Anregungsleistung in 3PM anstelle des Quadrats der Anregungsleistung in 2PM ab), der die unerwünschte Hintergrundfluoreszenz unterdrückt3 . Folglich ermöglicht 3PM eine kontrastreiche Bildgebung an tieferen Regionen in lebenden Geweben wie dem Hippocampus in einem intakten erwachsenen Mausgehirn 3,5,6,7,8,9,10,11 und dem gesamten Vorderhirn des erwachsenen Zebrafisches 12, einschließlich Ca2+. Aktivitätsaufzeichnung und mehrfarbige Beobachtungen. Darüber hinaus wurden mit 3PM durch die intakten Schädel von Maus und adulten Zebrafischen12,13 kontrastreiche Bilder erhalten.
Heute sind Anregungslaserquellen, die für die 3P-Anregung (3PE) bei ~1.300 und ~1.700 nm geeignet sind, im Handel erhältlich. Da das Laserscanning-System für 2PM und 3PM im Wesentlichen gleich ist, ist die Umstellung eines bestehenden 2P-Setups in ein 3P-Setup in Biologielabors mit der Installation eines kommerziell erhältlichen Lasers für 3PE möglich. Das 3P-Fluoreszenzsignal hängt von der Laserleistung, der Pulsdauer, der Laserwiederholrate und der numerischen Apertur (NA) der Objektivlinse ab. Unter der Annahme eines beugungsbegrenzten Fokus (d. h. die Rückblende der Objektivlinse wird durch den Anregungsstrahl überfüllt), beschreibt Eq (1) den zeitgemittelten Fluoreszenzphotonenfluss aus dem von 3PE resultierenden Brennvolumen.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
Dabei ist f die Laserwiederholrate, τ die Laserpulsdauer (volle Breite bei halbem Maximum), φ ist die Systemsammlungseffizienz, η ist die Fluoreszenzquanteneffizienz, σ 3 ist der 3P-Absorptionsquerschnitt, C ist die Fluorophorkonzentration, n0 ist der Reflexionsindex des Probenmediums (z. B. Wasser), λ ist die Anregungswellenlänge im Vakuum, NA ist die numerische Apertur der Objektivlinse, a 3 ist die räumliche Integrationskonstante des Brennvolumens, ist der zeitgemittelte Anregungsphotonenfluss (Photonen/s) unter der Objektivlinse, <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg"> z ist die abgebildete Tiefe und EAL ist die effektive Dämpfungslänge14. Hier haben wir angenommen, dass der EAL (typischerweise &gt; 100 μm) viel größer ist als die axiale Auflösung des Mikroskops (typischerweise &lt; 10 μm). Unter paraxialer Näherung ist eine3 gleich 28,114. GP(3) ist die zeitliche Kohärenz der Anregungsquelle 3. Ordnung, und gp(3) ist 0,41 bzw. 0,51 für hyperbolisch-sekant-quadratische Impulse bzw. Gaußsche Impulse. Die Abscheideeffizienz φ kann unter Berücksichtigung der Fluoreszenzsammlung durch die Objektivlinse, der Transmission der Objektivlinse, der Reflektivität des dichroitischen Spiegels, der Durchlässigkeit der Filter und der Detektionseffizienz des Detektors (z. B. Photomultiplierröhre oder PMT) geschätzt werden. Da die 3P-Fluoreszenzintensität stark von verschiedenen Parametern abhängt, ist eine Optimierung des 3P-Aufbaus erforderlich, um die 3P-Fluoreszenzsignale zu maximieren.
Dieses Protokoll veranschaulicht den Optimierungsprozess eines typischen 3P-Setups, der insbesondere für Biologielabors nützlich sein wird, die über ein 2P-Setup verfügen und planen, seine Fähigkeit auf 3P-Bildgebung auszuweiten oder ihr kommerzielles 3P-Setup mit optimaler Leistung zu halten. Dieser Videoartikel demonstriert auch die 3P-Bildgebung von Tiefengewebe in lebenden Tiergehirnen. Der erste Abschnitt befasst sich mit der Optimierung eines typischen 3P-Aufbaus mit einer handelsüblichen Laserquelle und einem Multiphotonenmikroskop. Der zweite und dritte Abschnitt beschreiben die Vorbereitung von Zebrafischen bzw. Mäusen auf 15 Uhr neuronaler Strukturen und Aktivitäten. Die Kraniotomie-Operation der Maus wurde bereits in Protokollpapieren sowiein 15,16,17 berichtet. Der vierte Abschnitt demonstriert die intravitale 3P-Bildgebung in Zebrafisch- und Mäusegehirnen.

<table><tbody><tr><td>5% Povidon-Jod</td><td>Amazon</td><td>NDC 67818-155-32</td><td>Ekzeptische Reinigung von Operationsbereichen</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Ekzeptische Reinigung von Operationsbereichen</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A4718-256</td><td>Vorbereitung der Zebrafischkammer</td></tr><tr><td>Atropin</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bergamo II</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Multiphotonen-Bildgebungsmikroskop</td></tr><tr><td>Bupivacain</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donut-Formglas (ID4.5, OD6.5)</td><td>Potomac Photonics</td><td></td><td>Deckglas für Kraniotomie-Augensalbe</td></tr><tr><td>(oder topische Augensalbe)</td><td>Puralube Vet Salbe</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>Wird als Gleitmittel verwendet, um Reizungen vorzubeugen oder die Trockenheit des Auges während der Operation und Anästhesie zu lindern</td></tr><tr><td>GaAsP Amplified PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMT2100</td><td>PMT Detektor</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycopyrrolat</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heizung (800 W)</td><td>Finnex</td><td></td><td>Aquarium Heizung für Zebrafischwasser)</td></tr><tr><td>Isofluran USP 250 mL</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-0013-25</td><td>Für die Anästhesie von Mäusen</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Kimtech</td><td></td><td></td><td>Laborgewebe zur Vorbereitung von Zebrafischen</td></tr><tr><td>Nanofil Spritze (10 Mikrometer) mit 36 G Nadel</td><td>WPI</td><td>NANOFIL + NF36BV</td><td>Spritze und Nadel zur Injektion von Pancuroniumbromid</td></tr><tr><td>Optischer Klebstoff</td><td>Norland</td><td>NOA 68</td><td>Zum Zusammenkleben von rundem Deckglas und Donut-förmigem Glas.</td></tr><tr><td>Pancuroniumbromid</td><td>Cornell Veterinary Care</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Elemental Science</td><td>ESI MP2</td><td>Wasserpumpe für die Einrichtung von Zebrafischen</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch (ID 0,58 mm, AD 0,965 mm.)</td><td>Elemental Science</td><td>MP2 Pump Tubing</td><td>Schlauch, der in den Mund des Zebrafisches geht</td></tr><tr><td>Runder Deckschirm Deutsches Glas #1,5, 5 mm</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>7229605</td><td>Deckglas für die Kraniotomie</td></tr><tr><td>Spirit-NOPA</td><td>Spectra Physics</td><td></td><td>Abstimmbarer optischer parametrischer Verstärker</td></tr><tr><td>SR400</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR400</td><td>Photonenzähler</td></tr><tr><td>Standard-Photodioden-Leistungssensor</td><td>Thorlabs</td><td>S122C</td><td>Leistungsdetektor</td></tr><tr><td>Sterilisierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>SKU 806552-500ml</td><td>Wird bei der Operation des Gehirns von Mäusen verwendet</td></tr><tr><td>Chirurgisches Abdecktuch</td><td>Dynarex Einweg-Handtuchtuch</td><td>4410</td><td>Für die ekptische Mauschirurgie</td></tr><tr><td>Dünnes Streifen-Boxwachs</td><td>Corning Rubber Co., Inc.</td><td></td><td>Halten des Schlauchs in der Zebrafischkammer</td></tr><tr><td>ThorImage</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Bildaufnahmesoftware</td></tr><tr><td>Tricain (Ethyl-m-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz)</td><td>MP</td><td>103106</td><td>Zebrafischanästhesie und Euthanasie</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch (I.D. 1/16 Zoll, AD 1/8 Zoll)</td><td>Tygon</td><td></td><td>Schlauch für den Wasserfluss für die Zubereitung von Zebrafischen</td></tr><tr><td>VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>Zum Recycling von Isofluran</td></tr><tr><td>Vetbond Gewebekleber</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Zum Verkleben des Glasfensters auf dem Schädel der Maus und zum Verkleben des Laborgewebes bei der Vorbereitung der Fische.</td></tr><tr><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Olympus</td><td></td><td>Multiphotonen-Anregungsobjektiv</td></tr></tbody></table>

tiefengewebs-drei-photonen-fluoreszenzmikroskopie in intaktem maus- und zebrafischgehirn

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphotonenmikroskopie-Techniken wie die Zwei-Photonen-Mikroskopie (2PM) und die Drei-Photonen-Mikroskopie (3PM) sind leistungsstarke Werkzeuge für die Tiefengewebe-In-vivo-Bildgebung mit subzellulärer Auflösung. 3PM hat zwei Hauptvorteile für die Tiefengewebebildgebung gegenüber 2PM, die in Biologielabors weit verbreitet ist: (i) längere Dämpfungslänge in streuendem Gewebe durch den Einsatz von ~ 1.300 nm oder ~ 1.700 nm Anregungslaser; (ii) geringere Hintergrundfluoreszenzerzeugung aufgrund einer nichtlinearen Anregung höherer Ordnung. Infolgedessen ermöglicht 3PM eine kontrastreiche strukturelle und funktionelle Bildgebung tief in streuendem Gewebe wie dem intakten Mausgehirn von den kortikalen Schichten bis zum Hippocampus und dem gesamten Vorderhirn erwachsener Zebrafische.
Heute sind Laserquellen, die für 3PM geeignet sind, kommerziell erhältlich, was die Umwandlung eines bestehenden Zwei-Photonen-Bildgebungssystems (2P) in ein Drei-Photonen-System (3P) ermöglicht. Darüber hinaus sind mehrere kommerzielle 3P-Mikroskope erhältlich, wodurch diese Technik für biologische Forschungslaboratorien leicht zugänglich ist. Dieses Papier zeigt die Optimierung eines typischen 3PM-Setups, insbesondere für Biologiegruppen, die bereits ein 2P-Setup haben, und demonstriert intravitale 3D-Bildgebung in intakten Maus- und erwachsenen Zebrafischgehirnen. Dieses Protokoll deckt das gesamte experimentelle Verfahren der 3P-Bildgebung ab, einschließlich Mikroskopausrichtung, Vorzwitschern von ~ 1.300 und ~ 1.700 nm Laserpulsen, Tierpräparation und intravitaler 3P-Fluoreszenzbildgebung tief in erwachsenen Zebrafisch- und Mäusegehirnen.

Der erfolgreiche Abschluss dieses Protokolls führt zu einem richtig ausgerichteten Mikroskop mit optimalen Lichtparametern (z. B. Pulsdauer, NA) und Tierpräparaten, die für in vivo 3PM geeignet sind. Das handelsübliche 3P-Setup umfasst geeignete Spiegel und Linsen für ~1.300 nm und ~1.700 nm; Daher ist keine Änderung der Optik erforderlich, wenn die Anregungswellenlänge zwischen 1.300 nm und 1.700 nm geschaltet wird. Wenn die Linsen in einem 3P-Setup keine geeignete Beschichtung für 1.300 und 1.700 nm haben, müssen diese durch geeignete ersetzt werden, um den Laserleistungsverlust zu reduzieren. Mit der optimierten 3PM und der richtigen Tierpräparation können in vivo Fluoreszenz- und THG-Bilder mit hohem Kontrast tief im Gehirn gesammelt werden.
Abbildung 3 zeigt repräsentative 3P-Bilder von intakten erwachsenen Zebrafischen. Eine hochauflösende, nicht-invasive und tiefe Bildgebung von genetisch markierten Neuronen im erwachsenen Zebrafischgehirn wird mit 3PM erreicht. Obwohl im erwachsenen Zebrafischgehirn mit 2PM24,25,26,27 über eine Bildgebung in der Telenzephalon-Region berichtet wurde, ermöglicht 3PM den Zugang zum gesamten Telencephalon und zu Regionen, die mit anderen Techniken schwieriger oder unmöglich zu beobachten sind. Die Verteilung der Zellschichten im optischen Tectum und Kleinhirn kann in Abbildung 3C beobachtet werden. Bei einer erfolgreichen Bildgebungssitzung ist der Knochen im THG-Kanal und Neuronen im Fluoreszenzkanal sichtbar. Für die Bildgebung von erwachsenen Zebrafischen wurde die Kamerafunktion des Mikroskops verwendet, um den Fisch zu lokalisieren (Abbildung 3A). Dieser Schritt ist für die Bildgebung des Mausgehirns nicht notwendig, da das Glasfenster groß genug ist, um das Gehirn leicht zugänglich zu machen. Hochauflösende Strukturbilder des erwachsenen Zebrafischgehirns wurden mit dem in den vorherigen Abschnitten beschriebenen System erhalten. Der Schädel ist im THG-Kanal zu sehen (Abbildung 3B), der hilft, durch das Gehirn zu navigieren und die obere Oberfläche zu finden. Wie in Abbildung 3C beobachtet, sind Neuronen mit einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (SBR) tief im erwachsenen Gehirn unterscheidbar. Das Gewebe über dem Gehirn ist aufgrund der Autofluoreszenz im Fluoreszenzkanal sichtbar.
Abbildung 4 zeigt mehrfarbige 3P-Bilder von GCaMP6s-markierten Neuronen (grün) und Texas Red-markierten Blutgefäßen (rot) zusammen mit THG (blau) Signalen im erwachsenen Mausgehirn mit 1.340 nm Anregung10. Die Bilder stammen aus früheren Arbeiten10. In Abbildung 4 wurde die Pulsenergie im Fokus in der gesamten Tiefe bei ~ 1,5 nJ gehalten, um ausreichende Fluoreszenz- und THG-Signale zu erhalten, und die maximale durchschnittliche Laserleistung betrug ~ 70 mW. Die Pulsdauer wurde auf ~60 fs eingestellt und die effektive NA betrug ~0,8. Mit der Optimierung des 3PM-Aufbaus konnten kontrastreiche Bilder bis zu 1,2 mm von der Gehirnoberfläche in der CA1-Hippocampus-Region erfolgreich erhalten werden (Abbildung 4A,B). Abbildung 4C,D zeigt Ca2+ Aktivitätsspuren von GCaMP6s-markierten Neuronen in einer Tiefe von 750 μm für eine 10-minütige Aufnahmesitzung, die eine hohe Aufnahmetreue zeigt.
Wenn der Anregungslaser falsch ausgerichtet ist, kann eine Ungleichmäßigkeit der Signalhelligkeit über das Sichtfeld beobachtet werden. Wenn die Laserparameter wie die Pulsdauer, die Anregungspulsenergie im Fokus und die effektive NA nicht optimiert sind, ist das THG-Bild vom Fischschädel oder dem Kraniotomiefenster des Mausgehirns nicht sichtbar und / oder erfordert eine hohe Erregungspulsenergie (z. B. &gt;2 nJ / Puls beim Fokus). Daher können die THG-Signale an der Gehirnoberfläche als Indikator für ein optimiertes 3PM-Setup verwendet werden, bevor mit der Tiefengewebebildgebung begonnen wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines 15-Uhr-Setups. Die Wellenlänge des Anregungslasers wird auf ~1.300 nm oder ~1.700 nm eingestellt, die vom Leerlaufport des NOPA ausgegeben wird. Der Prismenpaar-Kompressor und der Si-Plattenkompressor werden für den ~1.300-nm- bzw. ~1.700-nm-Laser verwendet, um den Anregungslaserpuls vorzuchirpieren. Die ~1.300 nm und ~1.700 nm Laserstrahlen können mit Flipperspiegeln geschaltet werden. Der Signalport des NOPA wird verwendet, um das auslösende Signal zu erhalten. Eine halbe Wellenplatte und ein PBS werden verwendet, um die Anregungsleistung zu steuern. Die Fluoreszenz und THG werden durch GaAsP PMTs detektiert. Geeignete Kombinationen von dichroitischen Spiegeln und Bandpassfiltern werden verwendet, um die Fluoreszenz- und THG-Signale zu trennen. Abkürzungen: 3PM = Drei-Photonen-Mikroskopie; NOPA = nicht-kollinearer optischer parametrischer Verstärker; PBS = polarisierender Strahlteiler; THG = dritte harmonische Generation; DAQ = Datenerfassung; PMT = Photomultiplierröhre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Screenshots für die intravitale Bildgebung bei Fischen (Protokollabschnitt 4.1). (A) Kameramodusansicht der Bildaufnahmesoftware mit 4-fachem Objektiv an Ort und Stelle. Die wichtigsten Funktionen der Software sind wie folgt beschrieben und nummeriert: 1. Bildgebungsmodus der Bildaufnahmesoftware. Die Modusoptionen sind Kamera, Multiphoton und Multiphoton GG. Für die Weißlichtbebilderung mit CCD-Kamera wird der Kameramodus gewählt. 2. Wenn Sie auf die Live-Schaltfläche klicken, wird die Kamera eingeschaltet (oder PMTs, wenn sie sich in Multiphotonen-Optionen befinden), und eine Echtzeitansicht des Mikroskops kann beobachtet werden. 3. Auf der Registerkarte Capture Setup werden die gewünschten Bildgebungsparameter (Leistung, Position, Tiefe) eingestellt. 4. Auf der Registerkarte Aufnahme wird ein Ordnerspeicherort für die zu speichernden Bilder zugewiesen. Die Bildgebung kann in diesem Tab gestartet werden. 5. Die Z-Control-Einstellung steuert die Bildtiefe durch Bewegen des Z-Stage-Motors. 6. Repräsentatives Bild eines Zebrafischkopfes. Die rostrale Seite des Kopfes befindet sich auf der linken Seite. (B) Repräsentative Ansicht des Kameramodus mit 25-fachem Objektiv. (C) Repräsentative Ansicht des Multiphotonen-GG-Modus, die das THG-Bild des in (B) gezeigten Bildes enthält. Abkürzungen: CCD = charge-coupled device; PMT = Photomultiplierröhre; THG = dritte harmonische Generation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative Bilder des erwachsenen Zebrafischgehirns, die mit der Bildaufnahmesoftware aufgenommen wurden . (A) Kameramodus-Bild des erwachsenen Zebrafischkopfes, aufgenommen mit einem 4-fachen Objektiv. Der obere Teil des Bildes ist die Rostralrichtung. Die OT-Lappen und CB sind umrissen. (B) Repräsentatives Bild, aufgenommen im Multiphotonen-GG-Modus mit einem 25-fachen Objektiv, das das THG-Bild von (A) enthält. (C) Fluoreszenzbilder des erwachsenen Zebrafischgehirns am Schnittpunkt des Kleinhirns und des optischen Tektums, wo GFP im Zytoplasma von Neuronen in verschiedenen Tiefen exprimiert wird. Maßstabsstäbe = 100 μm. Abkürzungen: OT = optic tectam; CB = Kleinhirn; THG = dritte harmonische Generation; GFP = grün fluoreszierendes Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> Abbildung 4: Mehrfarbige 3PM von GCaMP6s-markierten Neuronen (grün), Texas Red-markierte Blutgefäße (rot) und dritte harmonische Generation (blau) bei 1.340 nm Anregung im Mäusegehirn. (A) Z-Stack-Bilder bis zu 1.200 μm von der Gehirnoberfläche mit einem Sichtfeld von 270 x 270 μm (512 x 512 Pixel pro Bild). Die Laserleistung wurde je nach Abbildungstiefe variiert, um ~ 1,5 nJ Pulsenergie im Fokus zu halten. Die maximale durchschnittliche Leistung unter dem Ziel betrug 70 mW. (B) Ausgewählte 2D-Bilder in verschiedenen Bildtiefen. (C) Aktivitätsaufzeichnungsstelle in 750 μm unter der Dura mit einem Sichtfeld von 270 x 270 μm (256 x 256 Pixel). (D) Spontane Spuren der Gehirnaktivität, die bei einer wachen Maus von den in (C) angegebenen markierten Neuronen aufgezeichnet wurden. Die Bildrate betrug 8,3 Hz bei einer Pixelverweilzeit von 0,51 μs. Die Laserwiederholrate betrug 2 MHz und die durchschnittliche Leistung unter der Objektivlinse betrug 56 mW. Jede Spur wurde auf ihre Baseline normalisiert und mit einem Hamming-Fenster von 0,72 s Zeitkonstante im Tiefpass gefiltert. Maßstabsstäbe = 50 μm. Diese Figur und die Figurenlegende sind von 10 abgebildet. Abkürzung: 3PM = Drei-Photonen-Mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> Abbildung 5: Effektive Dämpfungslänge im Neokortex des Mausgehirns. EAL (Magenta-Linie) wird aus der Gewebestreuung (rote Linie) und der Wasseraufnahme im Gewebe (blaue Linie) berechnet, wobei eine Wasserzusammensetzung von 75% angenommen wird. Die schwarzen Sterne zeigen berichtete experimentelle Daten von EAL im Neokortex des Mausgehirns 3,21,28,29. Beachten Sie, dass EAL in verschiedenen Geweben variiert. Abkürzung: EAL = effektive Dämpfungslänge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anregungswellenlänge (nm)</td>
			<td>Tauchwasser</td>
			<td>Maximale Laserleistung (mW)</td>
			<td>Maximale Pulsenergie im Fokus* (nJ)</td>
			<td>Typische EAL im Mauskortex (μm)</td>
			<td>Abbildungstiefe im Mauskortex** (mm)</td>
			<td>Pulsenergie unter dem Ziel*** (nJ)</td>
			<td>Maximale Laserwiederholrate**** (MHz)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2O oder D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400 Einwohner</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Typische 3-P-Anregungsbedingungen für die Kortexbildgebung der Maus. * Mit einem hohen NA (~ 1,0) Objektiv, einer Pulsbreite von ~ 50 fs und typischen Fluorophoren wie fluoreszierenden Proteinen (z. B. GFP und RFP). ** Unter der Annahme, dass die EAL im gesamten Kortex einheitlich ist. Um ~ 1 nJ / Puls im Fokus zu erreichen, berechnet aus dem EAL und der Abbildungstiefe. Berechnet aus der Pulsenergie unter dem Objektiv und der maximalen permissiven Laserleistung. Abkürzungen: 3P = Drei-Photonen; NA = numerische Apertur; GFP = grün fluoreszierendes Protein; RFP = rot fluoreszierendes Protein; EAL = effektive Dämpfungslänge.

Die Drei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht eine kontrastreiche Fluoreszenzbildgebung tief in lebenden biologischen Geweben wie Maus- und Zebrafischgehirnen mit hoher raumzeitlicher Auflösung.

Tiefengewebs-Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in intaktem Maus- und Zebrafischgehirn

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Das Protokoll veranschaulicht, wie eine In-vivo-Tiefengewebe-Drei-Photonen-Mikroskopie im Gehirn von Mäusen und bei erwachsenen Zebrafischen durchgeführt werden kann. Zwei wichtige Modellsysteme in den Life Sciences. Die langwellige Drei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht in vivo eine hochauflösende Bildgebung intakter Gewebe oder Organe in Tiefen, die durch Zwei-Photonen-Mikroskopie nicht zugänglich sind.Diese Technik kann uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer und Autismus zu verstehen, bei denen ein vollständiges Verständnis der Auswirkungen der Krankheit auf das Gehirn fehlt. Kibaek Choe, der Postdoktorand aus unserem Labor, wird das Verfahren zur Bildgebung des Gehirns der Maus demonstrieren, und Kristine Kolkman, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin des Fetcho Research Laboratory, wird das Verfahren zur Bildgebung des Zebrafischgehirns demonstrieren. Schalten Sie zunächst den Laser ein und stellen Sie die mittlere Wellenlänge des Leerlaufausgangs des nicht-kollinearen optischen parametrischen Verstärkers auf 1.300 oder 1.700 Nanometer ein, platzieren Sie dann Pulskompressoren auf dem Lichtweg, um den Femtosekundenlaser vorzuchirpen und die Pulsdauer für die Drei-Photonen-Bildgebung zu optimieren.Stellen Sie den Winkel zwischen der Siliziumplatte und dem Laserpfad auf den Brewster-Winkel ein, um die Laserdurchlässigkeit zu maximieren, und drehen Sie dann die Siliziumplatte, um den Brewster-Winkel zu erreichen, indem Sie die Reflexion minimieren. Als nächstes platzieren Sie Flipperspiegel, um bequem zwischen den 1.300- und 1.700-Nanometer-Strahllinien zu wechseln. Platzieren Sie eine halbe Wellenplatte, die auf einer Rotationsstufe montiert ist, und einen polarisierenden Strahlteiler, um die Intensität des Lasers zu steuern, und platzieren Sie dann einen Strahlblocker im Reflexionspfad des Strahlteilers.Bereiten Sie eine Petrischale mit 0,5 Zentimetern 2% Agar mit hohem Schmelzpunkt zu. Sobald der Agar abgekühlt und erstarrt ist, schneiden Sie ein rechteckiges Loch in den Agar, das länger und etwas breiter ist als der Fisch. Befestigen Sie mit Wachs dünne Schläuche an der Petrischale mit einem Ende im Rechteck und einem Schlauch mit größerem Durchmesser am Rand der Petrischale.Als nächstes betäuben Sie den Fisch, indem Sie ihn in eine 0,2 Milligramm pro Milliliter Tricainlösung geben, dann den betäubten Fisch auf seine Seite auf einen nassen Schwamm legen, dann mit einer Mikrospritze, retro-orbital 3 Mikroliter Pancuroniumbromid injizieren, um den Fisch zu lähmen, und legen Sie ihn kurz in Hanks Lösung, um sicherzustellen, dass er vollständig gelähmt ist. Als nächstes legen Sie den Fisch dorsal-side nach oben in die Petrischale mit dem Kopf zum Schlauch, dann mit einer Pinzette, öffnen Sie vorsichtig das Maul des Fisches und schieben Sie den Schlauch in den Mund. Schieben Sie den Fisch vorsichtig in Richtung des Schlauches, so dass sich der Schlauch an der Rückseite des Mauls des Fisches befindet.Trocknen Sie das Agar schnell, aber vorsichtig um den Fisch herum und entfernen Sie das Wasser auf dem Fisch. Tauchen Sie ein kleines Stück Laborgewebe in Laborkleber und legen Sie das Gewebe auf beiden Seiten des Fisches auf das Agar und über den Rücken des Fisches mit den Kiemen. Als nächstes betäuben Sie die Haut des Fisches, indem Sie einen kleinen Tropfen Bupivacain direkt auf die Oberfläche des Kopfes geben und dann die Petrischale mit dem Fisch zum Mikroskop bringen.Füllen Sie die Schale mit Wasser aus der Fischanlage und schließen Sie den Schlauch an eine Wasserpumpe an, um Systemwasser in das Maul des Fisches zu pumpen. Stellen Sie sicher, dass das Wasser mit einem Bubbler angereichert und mit einer Aquarienheizung auf 30 Grad Celsius erwärmt wird. Platzieren Sie für die Bildgebung ein Objektiv mit geringer Vergrößerung auf dem Drei-Photonen-Mikroskop, legen Sie dann die Petrischale mit den Fischen und den Röhren unter das Mikroskop und verwenden Sie eine LED-Lichtquelle, um die Petrischale zu beleuchten.Öffnen Sie in der Bildaufnahmesoftware den Kameramodus, klicken Sie auf Live, wählen Sie Kanal A auf der rechten Seite des Bildschirms und passen Sie die Histogrammeinstellungen an, um das Bild klar zu sehen. Nachdem Sie die Motoreinstellung am Motorregler auf Basis eingestellt haben, senken Sie das Objektiv ab, bis der Fisch sichtbar ist. Platzieren Sie die Mitte des Fischkopfes in der Mitte des Sichtfeldes und bewegen Sie dann das Ziel nach oben und weg vom Kopf des Fisches.Ersetzen Sie das Objektivobjektiv mit geringer Vergrößerung durch das Objektivobjektiv mit hoher numerischer Blende für die Aufnahme von drei Photonen und bewegen Sie es dann nahe an den Kopf des Fisches. Setzen Sie die Achswerte aller Motoren auf Null. Senken Sie die Objektivlinse langsam ab, um sicherzustellen, dass das Objektiv den Kopf nicht physisch berührt.Hören Sie in der CCD-Kamerasoftware auf, das Objektiv zu bewegen, wenn die Oberseite des Kopfes sichtbar ist, und setzen Sie die Positionen X, Y und Z auf Null. Schalten Sie die LED-Lichtquelle aus und schließen Sie den dunklen Vorhang um das System, stellen Sie dann die Bilderfassungssoftware für die Drei-Photonen-Bildgebung in den Multiphotonen-GG-Modus ein und stellen Sie die Leistung unter der Objektivlinse auf weniger als ein Milliwatt ein. Klicken Sie in der Bilderfassungssoftware auf die Schaltfläche Live.Öffnen Sie PMT-Kanäle und passen Sie die PMT-Verstärkung und den Hintergrundpegel nach Bedarf an. Bewegen Sie sich langsam die Objektivlinse hinauf, um die Oberfläche des Kopfes zu lokalisieren, indem Sie den THG-Kanal von den großen Blutgefäßen und der Fensterglasoberfläche aus überwachen. Nachdem Sie die Objektivlinse in die Nähe des Fensters bewegt haben, wenden Sie Wasser zwischen dem Objektiv und dem Schädelfenster an und stellen Sie dann die Achsenwerte aller Motoren auf Null ein.Klicken Sie in der Bilderfassungssoftware auf die Schaltfläche Live. Öffnen Sie PMT-Kanäle und passen Sie die PMT-Verstärkung und das Hintergrundniveau nach Bedarf an, und bewegen Sie sich dann langsam die Objektivlinse nach oben, um die Oberfläche des Deckschlupfes zu lokalisieren, indem Sie den THG-Kanal von den großen Blutgefäßen und der Fensterglasoberfläche aus überwachen. Passen Sie bei Bedarf die Fensterausrichtung an und setzen Sie dann die Motoren auf Null, um die Oberfläche des Gehirns zu definieren.Führen Sie eine Bildgebung durch und passen Sie die Leistungsstufe entsprechend der Abbildungstiefe an. Hochauflösende, nicht-invasive und tiefe Bildgebung von genetisch markierten Neuronen im erwachsenen Zebrafischgehirn wird mittels Drei-Photonen-Mikroskopie erreicht. Auch die Verteilung der Zellschichten im optischen Tectum und Kleinhirn kann beobachtet werden.Die Kamerafunktion des Mikroskops wurde verwendet, um den Fisch zu lokalisieren. Der Schädel ist im THG-Kanal zu sehen, der hilft, durch das Gehirn zu navigieren und die obere Oberfläche zu finden. Neuronen sind mit einem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis tief im erwachsenen Gehirn unterscheidbar.Mehrfarbige Drei-Photonen-Bilder von GCaMP6s-markierten Neuronen und Texas Red-markierten Blutgefäßen zusammen mit THG-Signalen im erwachsenen Mäusegehirn sind hier zu sehen. Mit der Setup-Optimierung gelang es, kontrastreiche Bilder bis zu 1,2 Millimeter von der Gehirnoberfläche in der CA1-Hippocampus-Region zu erhalten. Calciumaktivitätsspuren von GCaMP6s-markierten Neuronen in einer Tiefe von 750 Mikrometern für eine 10-minütige Aufnahmesitzung zeigten eine hohe Aufnahmetreue.Dieses Setup kann helfen, neuronale Aktivität zu visualisieren, um die Gehirnfunktion zu verstehen. Es kann auch verwendet werden, um die Zellbewegung innerhalb des biologischen Gewebes zu verfolgen, um verschiedene biologische Systeme zu verstehen. Darüber hinaus kann auch die Blutflussgeschwindigkeit gemessen werden, um die Gesundheit des Tieres zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Montage Zebrafischembryonen für langfristige Bildgebung, Zwei-Photonen-Imaging-und Gewebe-Schaden Techniken und Zeitraffer-konfokale Bildgebung.

Zwei-Photonen-Axotomie und Zeitraffer-konfokale Bildgebung in lebenden Zebrafisch-Embryonen

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Mehrphotonenmikroskopie ganzer Mausorganen ist durch optisches Löschen des Organs vor der Bildgebung möglich, aber nicht alle Protokolle bewahren das Fluoreszenzsignal von fluoreszierenden Proteinen. Unter Verwendung eines optischen Clearing-Methode mit Ethanol-basierte Austrocknung und Benzylalkohol: Benzylbenzoat Lichtung zeigen wir, hochauflösende Multiphotonen Bilder gesamte Gehirn der Maus zum Ausdruck YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Quelle: Hontani, Y., et al. Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie im Tiefengewebe in intakten Gehirnen von Mäusen und Zebrafischen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt den Aufbau und die Durchführung der Drei-Photonen-Bildgebung in einem anästhesierten Zebrafischgehirn. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Neuronen in der Tiefengewebe und enthüllt so die neuronale Aktivität und Struktur in Echtzeit für neurowissenschaftliche Forschungsanwendungen.

Tiefengewebsbildgebung eines Zebrafischgehirns mit einem Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

In diesem Artikel beschreiben wir die volle experimentelle Verfahren zu rekonstruieren, mit hoher Auflösung, feinen Hirnanatomie von fluoreszenzmarkierten Gehirn der Maus. Die beschriebenen Protokoll umfasst die Probenvorbereitung und Clearing-, Proben-Montage für Imaging, Daten Post-Processing und Multi-Skalen-Visualisierung.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Großskalige 2D-Elektronenmikroskopie (EM) oder Nanotomie ist die gewebeweite Anwendung von EM mit nanoskaliger Auflösung. Hier beschreiben wir eine universelle Methode zur Nanotomie, die zur Untersuchung des Gehirns von Zebrafischlarven in der Gesundheit und bei nicht-invasiven Hirnverletzungen angewendet wird.

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Hier wird ein Protokoll für die in vivo Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Das experimentelle Verfahren umfasst die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Visualisierung.

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Erfahren Sie die Drei-Photonen-Mikroskopie für tiefengewebliche Bildgebung im intakten Maus- und Zebrafischgehirn. Diese Methode ermöglicht hochauflösende neuronale Studien zu neurologischen Erkrankungen wie Alzheimer.

Tiefengewebs-Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie in intaktem Maus- und Zebrafischgehirn

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