Name: ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie das ACT1-CUP1-Assay Mutationen im Spleißfaktor in Hefe identifiziert und spezifische Spleißschritte analysiert. Diese Methode nutzt Phänotyp-Wachstum als einfachen Readout.

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Vielen Dank an Aaron Hoskins und die Hoskins-Labormitglieder an der University of Wisconsin-Madison für die Verwendung von Hefestämmen und Geräten bei der Generierung der Abbildungen 3-5. Vielen Dank an Harpreet Kaur und Xingyang Fu für ihre aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Vielen Dank an die unterstützenden Studenten, Mitarbeiter und Dozenten der Northwest University beim Schreiben, Bearbeiten und Filmen dieses Papiers. Vielen Dank an Isabelle Marasigan für die Hilfe beim Filmen dieser Methode.

1. Hefestammkonstruktion
<ol><li>Erzeugen oder erhalten Sie einen S. cerevisiae-Stamm , dessen Hintergrund leu2 und cup1Δ umfasst. Um diesen Hintergrund zu erzeugen, verwenden Sie die etablierte Hefemethode, die Lithiumacetat und einzelsträngige DNA39 verwendet. HINWEIS: Haploide Hefestämme können eine, zwei oder mehr Kopien von CUP1 6,38 enthalten. Beziehen Sie sich auf genomische Informationen für den ausgewählten Hefestamm, wenn Sie Knock-out-Primer entwerfen, die die CUP1-Genorte flankieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Hefetransformation durch, um das QSP entweder durch genomische Inkorporation oder auf einem Plasmid einzubauen. Verwenden Sie ein etabliertes Protokoll, wie es in früheren Forschungen 40,41,42 beschrieben wurde.</li>
	<li>Führen Sie eine Hefeumwandlung mit den resultierenden Stämmen aus Schritt 1.2 durch. , um das gewünschte ACT1-CUP1-Reporterplasmid hinzuzufügen. HINWEIS: Die Zellen müssen auf Leucin-Drop-out-Platten (-Leu) und -Medien gehalten werden, um die Retention der ACT1-CUP1-Reporterplasmide nach dieser Transformation sicherzustellen.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 1.2 aus. und 1.3. für jedes zu testende QSP- und jedes ACT1-CUP1-Reporterplasmid, einschließlich Kontrollstämme.</li>
</ol>2. Kupferplattenvorbereitung
<ol><li>Wählen Sie einen Kupferkonzentrationsbereich, der zu den zu testenden Reportern geeignet ist (siehe Tabelle 1 für die Letalität häufig verwendeter Reporter). HINWEIS: Ein Beispiel für einen umfassenden Kupferkonzentrationsbereich sind 30 verschiedene Kupferkonzentrationen von 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM und 2,5 mM Cu2+.</li>
	<li>Stellen Sie eine Stammlösung aus 1 MCuSO4 und einen sterilen Filter durch einen 0,22 μm PES (Polyethersulfon) Sterilfilter her.</li>
	<li>Bereiten Sie pro gewünschter Kupferplatte eine 2 ml Verdünnung der CuSO4-Brühe in sterilem Wasser vor. HINWEIS: Da die Platte mit 0 mM Cu 2+ immer als Referenz analysiert und abgebildet wird, wird empfohlen, zwei 0 mM Cu2+ Platten herzustellen, eine am Anfang und eine am Ende des Galvanisierungsschritts (Schritt 3.4.).<ol><li>Berechnen Sie die Lagermenge für die gewünschte Kupferendkonzentration in 40 ml des Plattenvolumens (Zusatztabelle 1).</li>
		<li>Die berechnete Menge steriles Wasser und 1 M CuSO4 Schaft in ein steriles 2 ml Röhrchen geben.</li>
	</ol></li>
	<li>Gießen Sie Platten für den ACT1-CUP1-Assay. HINWEIS: Eine Alternative zum folgenden Protokoll besteht darin, die Medien und Agar zunächst in einem großen Behälter zu kombinieren und nach dem Autoklavieren in kleinere Behälter aliquot zu machen, um unterschiedliche Kupferkonzentrationen für jede Platte zu erreichen. Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Medienkonzentration zwischen allen Platten konsistent ist, obwohl jede eine andere Kupferkonzentration aufweist.<ol><li>Beschriften Sie jede leere Platte, die gegossen werden soll, mit der endgültigen Kupferkonzentration, die sie enthält. Bereiten Sie mindestens eine quadratische Platte pro zu prüfender Kupferkonzentration vor.</li>
		<li>Kennzeichnen Sie eine 100-ml-Flasche pro zu testender Kupferkonzentration.</li>
		<li>Zu jeder Flasche fügen Sie 790 mg Agar (2% w/v Agar) und einen Rührriegel hinzu.</li>
		<li>In einem großen Becherglas das -Leu-Wachstumsmedium für alle zu gießenden Kupferplatten vermischen. Pro herzustellender Platte werden 265 mg Hefestickstoffbase (YNB) und 64 mg Drop-out-Mischung minus Leucin (und alle anderen Nährstoffe, die zur Aufrechterhaltung des QSP-Plasmids in den Zellen erforderlich sind) in 34 ml entionisiertem Wasser gelöst.</li>
		<li>Zu jeder vorbereiteten 100-ml-Flasche 34 mL der -Leu-Wachstumsmedienlösung geben und mit Aluminiumfolie verschließen. Beschriften Sie die Folie mit der vorgesehenen Kupferkonzentration.</li>
		<li>Autoklav zum Sterilisieren und Auflösen des Agars unter Verwendung des empfohlenen Flüssigkeitszyklus für den Autoklaven.</li>
		<li>Geben Sie so schnell wie möglich 4 ml 20% w/v Glukose (steril gefiltert) in jede Flasche.</li>
		<li>Passen Sie die Etiketten an und fügen Sie die 2-ml-Verdünnungen von CuSO4 in die beabsichtigte Flasche hinzu. HINWEIS: Da Dutzende von Kupferplatten gleichzeitig hergestellt werden können, jede mit einer anderen Konzentration, verhindert das Kennzeichnen aller Flaschen, Röhrchen und Platten deutlich mit der beabsichtigten Kupferkonzentration Verwechslungen beim Gießen der Platte.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Rührplatte, um ~ 30 s zu mischen und gießen oder pipeten Sie 35 ml in die beschriftete Platte, um Blasen zu vermeiden. Vor der Lagerung oder Verwendung abkühlen lassen. HINWEIS: Häufig werden die Platten 1 Tag oder 2 Tage vor dem Test hergestellt und bei 4 °C bis einige Stunden vor Gebrauch gelagert. Die Platten sollten Raumtemperatur (RT) haben, bevor die Beschichtung beginnt (Schritt 3.4.).</li>
	</ol></li>
</ol>3. ACT1-CUP1 Assay
<ol><li>Streifen Sie die gewünschten Stämme auf -Leu-Platten aus. HINWEIS: Wenn Sie mit Kryobeständen arbeiten, sollte darauf geachtet werden, dass die Zellen vor der Beschichtung ausreichend aus der Lagerung wiederbelebt werden. Ein empfohlenes Verfahren hierfür ist es, aus dem kryogenen Bestand zu streifen und ihn 3-5 Tage bei 30 °C wachsen zu lassen. Dann ein kleines Muster umwerfen und weitere 2-3 Tage bei 30 °C wachsen lassen.</li>
	<li>Züchten Sie über Nacht Kulturen in 10 ml Medien.<ol><li>Die -Leu-Wachstumsmedien werden mit den gleichen Verhältnissen wie in Schritt 2.4.2 beschrieben hergestellt. Pro 10 ml Medium werden 66 mg Hefestickstoffbase (YNB) und 16 mg Drop-out-Mischung minus Leucin zu 9 ml entionisiertem Wasser gegeben. Durch einen 0,22 μm PES-Sterilfilter geleitet.</li>
		<li>Pro Hefestamm werden 9 ml -Leu-Wachstumsmedien und 1 ml 20% w/v-Glucose (steril gefiltert) in ein steriles 50-ml-konisches Röhrchen gegeben.</li>
		<li>Sammeln Sie mit einem sterilen Stab oder einer Pipetenspitze ein kleines (~ 1 mm rundes) Hefemuster und impfen Sie das Medium.</li>
		<li>Alle Nachtkulturen bei 180 U/min und 30 °C schütteln. HINWEIS: Falls verfügbar, können Rotatoren anstelle eines Shakers verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Stämme werden auf einen OD600 0,5 ± 0,05 in 10% Glycerin verdünnt.<ol><li>Pro Stamm 100 μL Kultur in eine Küvette mit 900 μL Wasser geben.</li>
		<li>Messen Sie den OD600 mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Berechnen Sie die erforderliche Verdünnung bei einem OD600 von 0,5 in einem Endvolumen von 2 ml.</li>
		<li>Verdünnen Sie jeden Stamm auf OD600 0,5 in 10% Glycerin (steril).</li>
		<li>Messen Sie den OD600 erneut, um zu bestätigen, dass die Zelldichte im gewünschten Bereich von 0,5 ± 0,05 liegt.</li>
	</ol></li>
	<li>Platten Sie die Dehnungen auf den Kupferplatten. HINWEIS: Eine Vielzahl von Methoden kann verwendet werden, um die Stämme zu beschichten, einschließlich Handpipettieren von 5-10 μL-Volumina, Verwendung eines Wiederholungs- oder Mehrkanalpipettors oder Stanzen mit einem Pin-Replikator. Diese letzte Methode wird unten beschrieben, obwohl die meisten Schritte unabhängig von der Methode ähnlich sind.<ol><li>Richten Sie einen sterilen Arbeitsplatz und einen brennenden Bunsenbrenner ein.</li>
		<li>Bei einem 48-poligen Replikator pipieren Sie 200 μL jedes verdünnten Stammes in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte. Füllen Sie die leeren Räume im 6 x 8 Raster mit 200 μL 10% Glycerin (steril). HINWEIS: Ein Beispiel für ein Beschichtungsschema für neun Hefestämme ist in Zusatztabelle 2 enthalten.</li>
		<li>Tauchen Sie den Replikator in eine flache Schale mit 95% (v / v) Ethanol und flammen Sie zur Sterilisation. Lassen Sie es mindestens 2 Minuten abkühlen, nachdem die Flamme erloschen ist, um einen Hitzeschock der Zellen zu vermeiden.</li>
		<li>Stellen Sie vier Teller in die Nähe des Brenners und entfernen Sie die Deckel.</li>
		<li>Tauchen Sie den Replikator in die 96-Well-Platte und heben Sie ihn in einer schnellen Bewegung an.</li>
		<li>Vorsichtig auf den Teller legen und leicht hin und her schaukeln, um einen guten Transfer zu erleichtern.</li>
		<li>Mit einer schnellen Bewegung anheben und in genau der gleichen Ausrichtung in die 96-Well-Platte legen.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für bis zu drei weitere Platten. Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie den Replikator in Ethanol tauchen, brennen, um zu sterilisieren, und warten, um alle vier Platten abzukühlen.</li>
		<li>Nachdem eine Platte beschichtet wurde, bewegen Sie sich mit einer sanften Bewegung zur Seite, aber immer noch innerhalb des Sterilisationsschirms der Flamme. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Hefeverdünnungen und -beschichtungen in der Nähe einer Flamme durchzuführen. Die Platten können beim Trocknen leicht verunreinigen.</li>
		<li>Lassen Sie die Teller vollständig trocknen, bevor Sie die Deckel aufsetzen, normalerweise 3-5 min.</li>
		<li>Die Platten 3 Tage bei 30 °C inkubieren.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Datenerhebung und -analyse
<ol><li>Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und prüfen Sie sie visuell.</li>
	<li>Nehmen Sie die Bilder der Platten mit einer verfügbaren Kamera oder einem anderen digitalen Bildgebungssystem auf.</li>
	<li>Aufzeichnung (oder Punktzahl) für jede Sorte wird das letzte sichtbare Wachstum der Kupferkonzentration beobachtet. HINWEIS: Die Zellen sind in der Lage, sich zu spleißen und bis zu dieser Konzentration lebensfähig zu bleiben. Verwenden Sie aus Gründen der Konsistenz immer die gleiche Methode, entweder mit dem Auge oder anhand der Plattenbilder, um die letzte lebensfähige Kupferkonzentration zu ermitteln. Sehr kleine Kolonien sind manchmal mit dem Auge sichtbar, aber nicht auf dem Bild. Der Unterschied zwischen direkter visueller Inspektion oder Aufzeichnung von Bildern ist gering, normalerweise ein Schritt im Farbverlauf. Da Bilder der Kolonien häufig in Publikationen verwendet werden, wird eine Bewertung anhand der Bilder empfohlen.</li>
	<li>Kombinieren Sie Daten aus mehreren ACT1-CUP1-Assays für denselben Stamm, um Rückschlüsse darauf zu ziehen, wie sich der QSP auf das Spleißen auswirkt. HINWEIS: Die Veröffentlichungszahlen zeigen üblicherweise Bilder der Hefekolonien bei 0 mM Cu2+ Konzentration, der letzten lebensfähigen Kupferkonzentration und der nachfolgenden Konzentration, in der die Kolonie gestorben ist. Daten können auch als Balkendiagramm mit Fehlerbalken für die Standardabweichung zwischen Replikaten angezeigt werden. Die Daten müssen nicht normalisiert werden, sondern können durch Setzen der Lebensfähigkeit der WT-Spleißfaktorkontrolle auf 1 und Vergleich der Wirkung der eingeführten Mutation(en) erfolgen.</li>
</ol>

Der Autor hat nichts offenzulegen.

ACT1-CUP1 ist ein Wachstumstest, und es muss darauf geachtet werden, dass beobachtete Wachstumsunterschiede nur auf Spleißfehler zurückzuführen sind. Alle Stämme sollten vor der Beschichtung auf ähnliche Weise gehandhabt werden, einschließlich einer ähnlichen Länge und Art von Wachstums- und Lagerbedingungen. Bei Verwendung temperaturempfindlicher Stämme sollten ACT1-CUP1-Assays nur unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen diese Stämme vergleichbar mit Wildtypen wachsen. In diesem Zusammenhang wird für die QSP-...

Das Spleißosom ist eine große, biologische Maschine, die die Entfernung von Introns, nicht-kodierenden Regionen in der Vorläufer-Boten-RNA (pre-mRNA)1,2, katalysiert. Die Charakterisierung der Wirkung einer Einzelpunktmutante in 1 der fast 100 Proteine und 5 nicht-kodierenden RNAs ist oft mehrdeutig, wenn das Protein oder die RNA isoliert untersucht wird. Die Veränderung der Funktion der mutierten Komponente kann am besten in vivo im Kontext des vollen, funktionierenden Spleißosoms beurteilt werden.
Der hier beschriebene Kupferwachstumstest ist ein schnelles Maß für die Spleißeffizienz in Saccharomyces cerevisiae oder Knospungshefe. Dieser von C.F. Lesser und C. Guthrie entwickelte und 1993 veröffentlichte Assay kombiniert die einfache Arbeit mit einem einfachen Modellorganismus und dem einfachen Auslesen der Zelllebensfähigkeit3. Die Lebensfähigkeit korreliert damit, wie gut die Spleißosomen in diesen Zellen das Reportertranskript erkennen und spleißen können.
Dieser Kupferwachstumstest wird häufiger als ACT1-CUP1-Assay bezeichnet. Der Name ACT1-CUP1 stammt von den beiden Genen, die fusioniert wurden, um einen Reporter der Spleißeffizienz zu schaffen. ACT1 ist das Aktin-Gen der Hefe, das stark exprimiert wird und ein effizient gespleißtes Intron 4,5 aufweist. Cup1p ist ein Kupferchelator, der Kupfer in der Zelle sequestriert, um Störungen mit regulären Zellfunktionenzu verhindern 6,7,8. Der ACT1-CUP1-Reporter enthält diese Gene sequenziell, so dass CUP1 nur dann im richtigen Leserahmen ist, wenn das Intron von ACT1 vor der mRNA gespleißt wird (Abbildung 1). Das resultierende Fusionsprotein enthält die ersten 21 Aminosäuren des Aktins und das Cup1p-Protein in voller Länge, was die Lebensfähigkeit der Hefe in einer kupferreichen Umgebung erhöht3. So führt eine Erhöhung der Spleißmenge des Reporters zu einer höheren Konzentration von Cup1p und einer höheren Kupferbeständigkeit (Abbildung 1). Im Vergleich zu anderen Reportergenen beeinflusst CUP1 die Zelllebensfähigkeit bereits bei niedrigen Konzentrationen, hat einen großen Sensitivitätsbereich und kann verwendet werden, um Mutationen 3,6,7 direkt für das Spleißenauszuwählen. Darüber hinaus ist CUP1 für das Standard-Hefewachstum nicht essentiell, so dass die zelluläre Homöostase während des Aufbaus für diesen Assay nicht beeinflusst wird. Ergänzend zu Deletions- oder Temperaturwachstumsassays liefert ACT1-CUP1 Informationen über die Auswirkungen auf das Spleißen unter ansonsten optimalen Hefewachstumsbedingungen.
Das Spleißosom erkennt sein Substrat durch drei intronische Sequenzen, nämlich die 5'-Spleißstelle (5' SS), die Zweigstelle (BS) und die 3'-Spleißstelle (3' SS). Zahlreiche ACT1-CUP1-Reporter wurden an diesen Standorten generiert, die Nicht-Konsens-Sequenzen enthalten. Eine Auswahl der häufigsten ACT1-CUP1-Reporter ist in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Da das Spleißosom mit jeder Spleißstelle an verschiedenen Punkten des Spleißzyklus einzigartig interagiert, kann die Robustheit des Spleißosoms in verschiedenen Schritten getestet werden, je nachdem, welcher Nicht-Konsens-Reporter verwendet wird. Nicht-Konsens-Reporter werden nach der mutierten Position innerhalb des Introns und der Basis, zu der es mutiert wurde, benannt. Zum Beispiel ist A3c ein Reporter mit einer Mutation am 5' SS, insbesondere Position 3 vom Konsensadenosin zu einem Cytosin. Dieser Reporter wird stark mit Spleißosomenmutationen interagieren, die die 5'-SS-Selektion und -Verwendung beeinflussen. In ihrer ersten Studie bestimmten Lesser und Guthrie, welche 5'-SS-Mutationen das Spleißen hemmten3. Später im selben Jahr wurden Nicht-Konsens-Reporter an allen drei Spleißstellen von Burgess und Guthrie in einem Suppressor-Screening von Mutationen in der ATPase Prp16p9 veröffentlicht. Der ACT1-CUP1-Assay war ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißosoms und zur Ableitung der Funktion der Spleißosomen anderer Eukaryoten.
Da ACT1-CUP1-Reporter ohne Konsens das Spleißosom für weitere Störungen sensibilisieren, kann der Einfluss einer einzelnen Spleißfaktormutation durch die Reporter charakterisiert werden, die sie positiv oder negativ beeinflusst. Dies wurde auf vielfältige Weise auf das Spleißen von Forschungsfragen angewendet. Erstens kann und wurde der ACT1-CUP1-Assay als genetischer Screen für Mutationen in Spleißfaktoren verwendet. So dient beispielsweise Prp8p, das größte Spleißprotein, als Plattform, auf der der RNA-Kern des Spleißosoms die Spleißreaktion katalysiert. Dies wurde zum Teil dadurch abgeleitet, wie Prp8p-Mutanten das Spleißen verschiedener ACT1-CUP1-Reporter verbesserten oder reduzierten 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere Proteinkomponenten des Spleißosoms wurden ebenfalls mit ACT1-CUP1 untersucht, darunter Hsh155p, Cwc2p, Cef1p und Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Die energetischen Schwellenwerte für Prp16p und vier weitere ATPasen, die am spleißeosomalen Übergang beteiligt sind, wurden ebenfalls mit diesem Assay 9,26,27,28,29,30 untersucht. Die kleinen nukleären RNAs (snRNAs) wurden ebenfalls umfassend unter Verwendung von ACT1-CUP1 untersucht, um die von ihnen koordinierten prä-mRNA-Sequenzen und die Veränderungen in der Sekundärstruktur der snRNAs während des Spleißens zu identifizieren 3,31,32,33,34,35,36,37.
Der ACT1-CUP1-Assay erfordert einen Hefestamm, bei dem alle Kopien des CUP1-Gens ausgeschaltet wurden. Da CUP1 eine hohe Exemplarzahl 6,38 haben kann, kann die Vorbereitung eines vollständigen Knock-out-Stammes mehrere Runden oder ein umfangreiches Screening erfordern. Infolgedessen wurden Cup1Δ-Hefestämme oft zwischen Laboren geteilt, ebenso wie die Reporter.
Wenn Mutation(en) in einem Spleißfaktor anhand einer Plasmidkopie beurteilt werden, sollte das Wildtyp-Gen für diesen Faktor ausgeschaltet werden. Darüber hinaus sollte der Hefehintergrund die Auswahl von mindestens zwei Plasmiden ermöglichen, von denen eines einen ACT1-CUP1-Reporter enthält, das historisch auf einem Leucin-Nährstoffselektionsplasmid basiert, und eines, das eine Mutation oder Störung in der zu untersuchenden Spleißmaschinerie enthält (Abbildung 2). In der Regel testen in einem einzigen Assay mehrere Hefestämme, von denen jeder die QSP (Query Splicing Perturbation) trägt, und ein anderer Reporter die Auswirkungen der Abfrage auf das Spleißen.
Die unabhängigen Variablen im ACT1-CUP1-Assay ermöglichen es einem Forscher, den Schweregrad eines QSP zu beurteilen. Diese unabhängigen Variablen sind die Konzentration von Kupfer und die Auswahl mehrerer Nicht-Konsens-Spleißreporter. Erstens, da die Hefestämme auf Platten gezüchtet werden, die eine Reihe von Kupferkonzentrationen enthalten (Abbildung 2), beinhaltet die Erstellung des Assays die Auswahl des verwendeten Konzentrationsgradienten. Studien können einen Kupferkonzentrationsgradienten verwenden, um eine erste Anzeige der Lebensfähigkeit zu erhalten, und dann den Assay mit einem feineren Gradienten wiederholen, um subtile Rentabilitätsunterschiede zu identifizieren. Die zweite Variable ist die große Auswahl an ACT1-CUP1-Reportern, die getestet werden können (Abbildung 1 und Tabelle 1). Wenn der QSP die Lebensfähigkeit der Hefe in Gegenwart eines Nicht-Konsens-Reporters anders beeinflusst als der Wildtyp, kann der Schluss gezogen werden, dass der QSP einen Schritt beim Spleißen oder einen Bereich des Spleißosoms beeinflusst, der während der Erkennung oder Verarbeitung dieser Region des Introns wichtig ist.
Die Hefe-Toolbox ist umfangreich und der ACT1-CUP1-Assay ist ein integraler Bestandteil der Spleißforschung. Der ACT1-CUP1-Assay wird häufig zusammen mit einer eingehenderen genetischen, strukturellen und/oder biochemischen Analyse auf die Auswirkungen eines QSP durchgeführt. Da diese detaillierteren Studien in der Regel ein längeres Verfahren und/oder einen höheren Preis haben, ist ein häufiger Ansatz, zuerst mit ACT1-CUP1 nach interessanten Mutanten zu suchen.
Hier wird ein ACT1-CUP1-Assay-Protokoll einschließlich Kupferplattenvorbereitung bereitgestellt. Dieser Assay liefert den Forschern eine erste Antwort auf die Wirkung eines QSP auf das Spleißen und welche intronischen Regionen am stärksten von der Störung betroffen sind.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>2 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>50 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-332</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-760</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>190 Proof Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-600</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>500 mL Filtersystem (0,22 &Mikro; m)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229707</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Jedes Agar in molekularer Qualität funktioniert.</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>Humboldt</td><td>PN6200.1</td><td>oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Zelldichtemessgerät</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>Oder ein anderes Spektralgerät, das die Absorption bei 595 nm messen kann.</td></tr><tr><td>Kupfersulfat Pentahydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>LC134051</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Digitales Bildgebungssystem</td><td>Cytiva</td><td>29399481</td><td>ImageQuant 4000 (verwendet für Abbildung 3)&nbsp; Amersham ImageQuant 800, oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Dropout-Mix (-Leu)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>Verwenden Sie den passenden Dropout-Mix für Ihr Experiment. Es ist möglich, dass Sie auch einen Hefenährstoffmarker für Ihre Abfragestörung verwenden. In diesem Fall sollte die Drop-Out-Mischung für diesen Marker und Leu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>Oder einen vergleichbaren Artikel von einem anderen Hersteller sein.</td></tr><tr><td>Gelband-Quantifizierungssoftware</td><td>Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1 (verwendet für Abbildung 5A) oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Handkamera</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Nahinfrarot-Gel-Bildgebungsgerät</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR (in Abbildung 5a verwendet) oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Klemme in Laborqualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-7Q</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Ständer und Klemme in Laborqualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-101</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Magnetrührstäbchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td>Oder vergleichbarer Artikel von einem anderen Hersteller.</td></tr><tr><td>Pin-Replikator</td><td>VP Scientific</td><td>VP 407AH</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Mikro-Einwegküvetten</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Schüttler</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Biowave</td><td>80-3000-45</td><td>Oder jedes Spektophotometer, das die Extinktion bei 600 nm messen kann.</td></tr><tr><td>Quadratische Platten</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>Kreisförmige Platten können ebenfalls verwendet werden, sind jedoch schwieriger, wenn ein Pin-Replikator verwendet wird.</td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-520-16S</td><td>Oder vergleichbarer Artikel von einem anderen Hersteller.</td></tr><tr><td>Hefestickstoffbasis</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.</td></tr></tbody></table>

act1-cup1-assays bestimmen die substratspezifischen sensitivitäten von spleißeosomalen mutanten in knospender hefe

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutationen, die in das Spleißosom oder sein Substrat eingebracht wurden, haben wesentlich zum Verständnis der Feinheiten der spleißeosomalen Funktion beigetragen. Ob krankheitsbedingt oder funktionell selektiert, viele dieser Mutationen wurden mit Wachstumstests im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Hefe) untersucht. Der spleißspezifische Kupferwachstumsassay oder ACT1-CUP1-Assay bietet eine umfassende Analyse der Mutation auf phänotypischer Ebene. Der ACT1-CUP1-Assay verwendet Reporter, die bei korrektem Spleißen Kupfertoleranz verleihen. In Gegenwart von Kupfer korrelieren also Veränderungen der Hefelebensfähigkeit mit Veränderungen der mRNA-Produktion durch Spleißen. In einem typischen Experiment wird das Hefespleißosom mit verschiedenen Nicht-Konsens-Spleißreportern und der interessierenden Spleißfaktor-Mutation herausgefordert, um synergetische oder antithetische Auswirkungen auf das Spleißen nachzuweisen. Hier wird eine vollständige Beschreibung der Kupferplattenherstellung, der Beschichtung von Hefezellen und der Datenauswertung gegeben. Eine Auswahl ergänzender Experimente wird beschrieben, die die Vielseitigkeit der ACT1-CUP1-Reporter hervorheben. Der ACT1-CUP1-Assay ist dank des direkten Auslesens von Mutationseffekten und der Vergleichsmöglichkeiten aus der fortgesetzten Verwendung im Feld ein praktisches Werkzeug in der Spleiß-Toolbox.

Wachstumsassays wie ACT1-CUP1 erfordern die visuelle, vergleichende Beurteilung mehrerer Kolonien. Hier wurde jeder Stamm über Nacht bis zur Sättigung gezüchtet, auf einen OD600 von 0,5 verdünnt und auf 20 Platten mit einem Bereich von Kupferkonzentrationen von 0 mM bis 1,1 mM CuSO4 plattiert (Abbildung 3). Dieser Bereich ist kleiner als der im Protokoll aufgeführte, da er eine vollständige Bewertung der Auswirkungen der verwendeten und unten beschriebenen QSPs und ACT1...

Der ACT1-CUP1-Assay, ein Kupferwachstumsassay, ermöglicht eine schnelle Ablesung des Precursor-Messenger-RNA-Spleißens (pre-mRNA) und des Einflusses mutierter Spleißfaktoren auf die spleißöosomale Funktion. Diese Studie bietet ein Protokoll und hebt die Anpassungsmöglichkeiten hervor, um die interessierende Spleißfrage zu beantworten.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

Der ACT1-CUP1-Assay kann feststellen, ob eine Mutation das Pre-Messenger-RNA-Spleißen beeinflusst, und einen Hinweis darauf geben, welcher Spleißschritt am stärksten betroffen ist. Der ACT1-CUP1 Assay verbindet die Spleißfaktormutation mit ihrem Einfluss auf den komplexen Prozess des Spleißens. Es nutzt das einfache Auslesen des Wachstumsphänotyps und hat einen breiten Empfindlichkeitsbereich.Bei der Durchführung eines ACT1-CUP1-Assays ist eine effiziente Zeitnutzung wichtig. Beginnen Sie mit einem Assay von fünf bis 10 Stämmen, um stressbedingte Wachstumsanomalien zu minimieren. Ich und Isabelle Marasigan, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren den Prozess.Fügen Sie zunächst 790 Milligramm Agar und einen Rührriegel zu jeder Flasche hinzu. Bereiten Sie in einem großen Becherglas das Leucin-Dropout-Wachstumsmedium für alle zu gießenden Kupferplatten vor. Dazu gehören 265 Milligramm Hefestickstoffbasis, 64 Milligramm Dropout-Mischung minus Leucin und 34 Milliliter entionisiertes Wasser für jede zu gießende Platte.Zum Auflösen umrühren Geben Sie dann 34 Milliliter der Leucin-Dropout-Wachstumsmedienlösung zu jeder vorbereiteten 100-Milliliter-Flasche hinzu und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie. Als nächstes Autoklaven, um den Agar zu sterilisieren und aufzulösen, unter Verwendung des empfohlenen Flüssigkeitszyklus für den Autoklaven. Fügen Sie so schnell wie möglich nach dem Autoklavieren vier Milliliter 20% Glukose zu jeder Flasche hinzu.Passen Sie dann das Tubenetikett an das Flaschenetikett an, um die jeweils zwei Milliliter Kupfersulfatverdünnungen in die beabsichtigte Flasche zu geben. Verwenden Sie eine Rührplatte, mischen Sie für ca. 30 Sekunden und gießen oder pipettieren Sie 35 Milliliter in die beschriftete Platte, um Blasen zu vermeiden. Fügen Sie pro Hefestamm neun Milliliter Leucin-Dropout-Wachstumsmedien und einen Milliliter 20% Glukose in ein steriles, 50-Milliliter-konisches Röhrchen hinzu.Sammeln Sie mit einem sterilen Stab oder einer Pipettenspitze ein kleines Stück Hefe und impfen Sie die Medien. Dann schütteln Sie alle Nachtkulturen bei 180 U / min und 30 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Kultur zu einer Küvette hinzu, die 900 Mikroliter Wasser pro Stamm enthält.Anschließend messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer und berechnen die erforderliche Verdünnung bei einer optischen Dichte von 0,5 in einem Endvolumen von zwei Millilitern. Verdünnen Sie dann jeden Stamm auf die optische Dichte 0,5 in 10% Glycerin und messen Sie die optische Dichte erneut, um zu bestätigen, dass die Zelldichte im gewünschten Bereich liegt. Nachdem Sie einen sterilen Arbeitsort eingerichtet haben, zünden Sie einen Bunsenbrenner an.Für einen 48-poligen Replikator pipetten Sie 200 Mikroliter jedes verdünnten Stammes in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte und füllen die leeren Räume im Sechs-mal-Acht-Raster mit 200 Mikrolitern 10% Glycerin. Dann tauchen Sie den Replikator in eine flache Schale mit 95% Ethanol und flammen Sie zur Sterilisation. Lassen Sie es mindestens zwei Minuten abkühlen, nachdem die Flamme erloschen ist, um einen Hitzeschock für die Zellen zu vermeiden.Stellen Sie vier Teller in die Nähe des Brenners und entfernen Sie die Deckel. Tauchen Sie den Replikator in die 96-Well-Platte und heben Sie ihn in einer schnellen Bewegung an. Dann vorsichtig auf den Teller legen und leicht hin und her schaukeln, um einen guten Transfer zu erleichtern.Mit einer schnellen Bewegung anheben und in genau der gleichen Ausrichtung in die 96-Well-Platte legen. Nachdem eine Platte plattiert wurde, bewegen Sie sich mit einer sanften Bewegung zur Seite, aber immer noch innerhalb des Sterilisationsschirms der Flamme. Lassen Sie die Teller vollständig trocknen, bevor Sie die Deckel aufsetzen, normalerweise drei bis fünf Minuten.Dann inkubieren Sie die Platten für drei Tage bei 30 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platten aus dem Inkubator genommen haben, überprüfen Sie sie visuell. Der Wachstumstest zeigte, dass mit steigender Kupferkonzentration Stämme mit geringerem Spleißen eine verminderte Konfluenz zeigen, bis zu dem Punkt, an dem die Kupferkonzentration tödlich wird.Der Hefehintergrund enthält ein gestörtes ADE2-Gen, was dazu führt, dass die Kolonien unterschiedliche Rottöne haben. Und die reifen Kolonien waren tiefrot gefärbt. Wenn der Replikator während der Beschichtung angehoben wird, während er sich nach links oder rechts bewegt, schräg gebracht wird oder wenn er über der Platte geschüttelt wird, ist es möglich, ovale Kolonien oder Mikrokolonien aus kleinen Tröpfchen der Zelllösung zu erzeugen.Hefe mit dem A3c-Reporter überlebte bis 0,15 Millimolar Kupfer, während die Wildtyp-Reporterzellen bis zum Ende des getesteten Kupferkonzentrationsbereichs lebensfähig blieben. Die Assay-Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Basen an der U6-snRNA-Position 57 einzigartige Auswirkungen auf das Spleißosom in Kombination mit einer 5-Prime- oder Zweigstellenmutation haben. Während U57c eine additive Mutation ist, die die Kupfertoleranz verringert, in Kombination mit A3c- und Zweigstellen-G-Reportern.Im Gegensatz dazu erhöht U57a die Kupfertoleranz, da es die Progression zur zweiten Stufe fördert. Nachdem die Spleißstörung durch ACT1-CUP1 identifiziert wurde, kann die Forschung zu quantitativeren Methoden übergehen, wie der Primerverlängerung und der Identifizierung gestörter molekularer Wechselwirkungen durch EMSAs und enzymatische Sondierung. ACT1-CUP1 war ein grundlegender Assay, der unser Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißsoms vertiefte.Und es erweitert weiterhin unser Verständnis der spleißeosomalen Funktion.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir verfügen über umfassende, unvoreingenommene genomweiten Screens entwickelt, um Gen-Medikament und Gen-Umwelt-Interaktionen zu verstehen. Methoden für das Screening dieser mutierten Sammlungen präsentiert werden.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Hier stellen wir eine kostengünstige Methode zur Definition chemisch-genetischer Interaktionen in knospenden Hefen vor. Der Ansatz baut auf grundlegenden Techniken der Hefemolekularbiologie auf und eignet sich gut für die mechanistische Abfrage kleiner bis mittlerer Ansammlungen von Chemikalien und anderen Medienumgebungen.

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

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Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Purine gehören zu den am häufigsten vorkommenden nicht-kanonischen Nukleotiden während Eukaryotische nukleare DNA-Replikation in das Genom integriert. Wenn nicht richtig entfernt, verursachen Purine DNA-Schäden und Mutagenese. Hier präsentieren wir Ihnen zwei experimentelle Ansätze, die verwendet werden, um die Fülle der Ribonukleotidreduktase Einbindung in DNA und seine mutagenen Wirkungen zu beurteilen.

Studium Ribonukleotidreduktase Aufnahme: Strang-spezifischen Nachweis von Purine Hefegenoms und Messen Ribonukleotidreduktase induzierter Mutagenese

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.

Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Erfahren Sie, wie das ACT1-CUP1-Assay Mutationen im Spleißfaktor in Hefe identifiziert und spezifische Spleißschritte analysiert. Diese Methode nutzt Phänotyp-Wachstum als einfachen Readout.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

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