Name: Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie offene Suchansätze die Identifizierung von O-verknüpften Glykopeptiden in Acinetobacter baumannii ermöglichen. Diese Methode erleichtert die Entdeckung neuer Glykosylierungsereignisse auch für Nicht-Experten.

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N.E.S wird durch ein Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) und ein ARC Discovery Project Grant (DP210100362) unterstützt. Wir danken der Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility des Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute für den Zugang zu MS-Instrumenten.

HINWEIS: Die Vorbereitung und Analyse von bakteriellen Glykopeptidproben kann in vier Abschnitte unterteilt werden (Abbildung 1). Für diese Studie wurde die Glykosylierung von drei sequenzierten A. baumannii-Stämmen untersucht (Tabelle 1). Proteome FASTA-Datenbanken von jedem dieser Stämme sind über Uniprot zugänglich. Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer finden Sie in Tabelle 2. 
1. Aufbereitung von Proteinproben für die Proteomanalyse
<ol><li>Isolierung von Proteomproben von Interesse<ol>
<li>Wenn Sie ganze Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) gewaschen wurden, um potenzielle Proteinverunreinigungen in den Medien zu entfernen. Ganze Zellen nach dem Waschen einfrieren und bei -80 °C lagern, bis sie benötigt werden.</li>
		<li>Wenn fraktionierte Proben verwendet werden (z. B. Membranpräparate), stellen Sie sicher, dass die verwendeten Reagenzien die nachgeschaltete Flüssigkeitschromatographie-MS-Analyse (LC-MS)50 nicht beeinträchtigen.</li>
		<li>Wenn Reinigungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 oder Lauroylsarcosin verwendet wurden, entfernen Sie diese Reinigungsmittel mit Acetonfällung, SP3-Probenvorbereitungsmethoden51 oder kommerziellen proteomischen Reinigungssäulen wie S-Fallen52. Alternativ können Sie inkompatible Reinigungsmittel durch ein MS-kompatibles oder entfernbares Reinigungsmittel wie Natriumdesoxycholat (SDC) oder Octylglucopyranosid ersetzen.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass alle Kunststoffwaren und Glaswaren, die für die Probenvorbereitung verwendet werden sollen, nicht autoklaviert wurden. Autoklavierte Glaswaren und Kunststoffe sind typischerweise stark mit Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht wie Polymeren kontaminiert, die in der MS leicht nachgewiesen werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solubilisierung von Ganzzellproben<ol>
<li>Resuspendieren Sie ~ 10 mg gewaschene, schockgefrorene Zellen in 200 μL frisch zubereitetem Natriumdesoxycholat-Lysepuffer (SDC-Lysepuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5). HINWEIS: Proteasehemmer können dem SDC-Lysepuffer hinzugefügt werden, um den Proteinabbau zu begrenzen.</li>
		<li>Kochen Sie die Proben für 10 min bei 95 °C mit Schütteln (2000 U / min auf einem Thermomixer) und lassen Sie sie dann für 10 min auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um eine effiziente Lyse und Solubilisierung der Proben zu gewährleisten. HINWEIS: Proben können an dieser Stelle langfristig bei -80 °C gelagert werden. Bei Lagerung vor der weiteren Verarbeitung durch Erhitzen auf 95 °C resolubilisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizierung der Probenproteinkonzentrationen mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay53. Lagern Sie Proben auf Eis, während Sie eine Quantifizierung durchführen, um den Proteinabbau zu begrenzen. HINWEIS: Für die Gesamtproteomanalyse sind 20-100 μg Protein mehr als ausreichend für Nano-LC-MS, die typischerweise weniger als 2 μg Proteinaufschluss pro Analyse erfordert. Die Herstellung von überschüssigem Peptid ermöglicht eine Replikationsanalyse oder eine weitere Fraktionierung, wenn eine tiefe proteomische Abdeckung erforderlich ist. Für die auf Glykopeptidanreicherung basierende Analyse mittels hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) werden 100-500 μg Protein benötigt.</li>
	<li>Proben reduzieren und alkylatieren.<ol>
<li>1/10 des Volumensdes 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers (100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid; 400 mM 2-chloracetamid in 1 M Tris, pH 8,5) zu den Proben für eine Endkonzentration von 1x geben und Proben im Dunkeln für 30 min bei 45 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min inkubieren. HINWEIS: Überprüfen Sie den pH-Wert des 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers, um einen pH-Wert von ca. 7,0-8,0 sicherzustellen, bevor Sie den Proben hinzufügen, da ein niedrigerer pH-Wert dazu führt, dass die DEZA ausfällt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drehen Sie die Proben kurz nach unten und fügen Sie die Proteasen Trypsin / Lys-C (~ 10 μL, resuspendiert in 100 mM Tris, pH 8,5) für ein endgültiges Protease: Protein-Verhältnis von 1: 100 hinzu. Inkubieren Sie die Digests über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min (bis zu 18 h). Um eine vollständige Proteinverdauung zu gewährleisten, verwenden Sie ein Trypsin / Lys-C-Protease: Protein-Verhältnis von 1: 50 bis 1: 200.</li>
	<li>Quench Digests durch Zugabe von 1,25 Volumen 100% Isopropanol zu den Proben. Wirbeln Sie die Proben für 1 Minute auf, um sie zu mischen und kurz nach unten zu drehen. HINWEIS: Proben können bei -20 °C gelagert werden, um später weiterverarbeitet zu werden.</li>
	<li>Ansäuern Sie die Proben durch Zugabe von 0,115 Volumina von 10% Trifluoressigsäure (TFA; Endkonzentration von ~ 1% TFA), wirbeln Sie die Proben ein und drehen Sie sie kurz nach unten.</li>
</ol>2. Verarbeitung von Proteomproben
<ol><li>Peptidreinigung von Proteomproben<ol>
<li>Bereiten Sie eine Styrol-Vinylbenzol-Umkehrphasensulfonat (SDB-RPS) Stop-and-Go-Extraktion (Stage) Spitze für jede Probe wie zuvor beschriebenvor 54.<ol>
<li>Empirisch werden zur Bindung von 50 μg Peptid drei SDB-RPS-Bandscheiben aus einer 47 mm2 SDB-RPS-Membran mit einer stumpfen Nadel (14 G) herausgeschnitten. Für größere Peptidmengen erhöhen Sie die Anzahl der Bandscheiben entsprechend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie vor der Verwendung von SDB-RPS Stage Tips die Spitzen vor, indem Sie nacheinander mindestens zehn Bettvolumen der folgenden Puffer hinzufügen und entweder den Puffer durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) durch die Säule drehen oder indem Sie den Puffer durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze durch die Säule drücken.<ol>
<li>Befeuchten Sie die Spitzen mit 150 μL 100% Acetonitril.</li>
			<li>Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 30% Methanol, 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.</li>
			<li>Equilibrieren Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Proben (mit 50 % Isopropanol, 1 % TFA) werden durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Ausüben von Druck mit einer Spritze auf die SDB-RPS Stage Tips geladen.</li>
		<li>Waschen Sie die SDB-RPS Stage Tips mit den folgenden Puffern durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Druckaufbringen mit einer Spritze. HINWEIS: Zusätzliche Waschungen oder alternative Puffer können verwendet werden, um Nicht-Peptid-Verunreinigungen zu entfernen, wie z. B. die Verwendung von Ethylacetat anstelle von Isopropanol55.<ol>
<li>Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA.</li>
			<li>Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eluieren Sie die Peptide aus den SDB-RPS Stage Tips mit 150 μL 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril durch Zentrifugation oder durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze. Sammeln Sie die Proben in einzelnen Röhrchen. HINWEIS: Bereiten Sie 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril in einem Kunststoffbehälter unmittelbar vor der Verwendung in einem Abzug vor.</li>
		<li>Die eluierten Peptide werden durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C getrocknet. HINWEIS: Bei einer HILIC-Anreicherung können an dieser Stelle 1-10% der Peptideluate entfernt, getrocknet und als Gesamtproteom-Eingangskontrollen verwendet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Anreicherung von Glykopeptidproben<ol>
<li>Vorbereiten von Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips wie zuvor beschrieben54,56.<ol>
<li>Kurz gesagt, entfernen Sie eine C 8-Disc mit einer stumpfen Nadel (14 G) aus einer 47 mm2 C8-Membran und packen Sie die Disc in eine P200-Spitze, um eine Fritte zu erzeugen. Etwa 5 mm ZIC-HILIC-Material, resuspendiert in 50% Acetonitril, 50% 18,2 MΩH2O, auf die Fritte geben, indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bevor Sie ZIC-HILIC Stage Tips verwenden, konditionieren Sie das Harz, indem Sie nacheinander die folgenden Puffer hinzufügen und vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben. HINWEIS: Um die Integrität der Pseudowasserschicht auf der Oberfläche des ZIC-HILIC-Harzes (erforderlich zur Anreicherung von Glykopeptiden) zu gewährleisten, muss das Harz immer nass bleiben. Lassen Sie beim Waschen des Harzes immer ~ 10 μL Lösungsmittel über dem Harz und stellen Sie sicher, dass die Waschungen / Proben direkt in dieses Restlösungsmittel pipettiert werden.<ol>
<li>Das Harz wird mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer (0,1 % TFA in 18,2 MΩ H2O) ausgeglichen.</li>
			<li>Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Zubereitungspuffer (95% Acetonitril in 18,2 MΩ H2O).</li>
			<li>Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (80% Acetonitril, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die getrockneten verdauten Proben (ab Schritt 2.1.6) im ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer auf eine Endkonzentration von 4 μg/μL resuspendieren (z. B. für 200 μg Peptid in 50 μL ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer). Wirbeln Sie kurz für 1 Minute vor, um sicherzustellen, dass die Proben resuspendiert sind, und drehen Sie sie für 1 Minute bei 2.000 × g bei 25 ° C nach unten.</li>
		<li>Laden Sie die resuspendierte Peptidprobe auf eine konditionierte ZIC-HILIC-Säule.<ol>
<li>Dreimal waschen Sie mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (für insgesamt 60 Bettvolumenwäschen), indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.</li>
			<li>Elute Glykopeptide mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer werden durch sanftes Druckanlassen mit einer Spritze in ein 1,5-ml-Röhrchen umgewandelt und anschließend das Eluat durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C trocknen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben
<ol><li>Resuspendieren Sie die Proben in Puffer A* (2% Acetonitril, 0,1% TFA) auf eine Endkonzentration von 1 μg/μL (z. B. für 50 μg Peptid in 50 μL Puffer A*).</li>
	<li>Laden Sie die Proben auf eine HPLC/UPLC, die mit einer MS gekoppelt ist, um die Trennung und Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen. HINWEIS: Die Säulenparameter, einschließlich Innendurchmesser, Länge, Durchflussraten, Art des Chromatographieharzes und erforderliche Peptidinjektionsmengen, sollten für den analytischen Aufbau und die zu verwendende Gradientenlänge optimiert werden. Ein Beispiel für die Optimierung analytischer Setups finden Sie unter57.</li>
	<li>Überwachen Sie die Erfassung der resultierenden MS-Daten, um sicherzustellen, dass die Daten mit den gewünschten Parametern gesammelt werden. HINWEIS: Für die Kompositionsanalyse ist die CID-Fragmentierung ausreichend. Aufgrund der Zugabe von Glykanen zu Glykopeptiden werden Glykopeptidionen typischerweise mit einer höheren m/z und geringerer Ladungsdichte beobachtet als unglykosylierte Peptide. Um sicherzustellen, dass diese Ionen beobachtbar sind, lassen Sie einen MS1-Massenbereich von 400 bis 2.000 m/z zu.</li>
	<li>Fragmentieren Sie ausgewählte Ionen mit CID, um die Sammlung von Fragmentionen mit niedrigem m/z-Gehalt zu gewährleisten, die Oxoniumionen enthalten, die für die Charakterisierung von Glykanen wichtig sind. HINWEIS: Die Fragmentierung von Glykopeptiden unter Verwendung von CID wird sowohl von der Peptid- als auch von der Glykansequenz sowie von der während der Fragmentierung aufgewendeten Energie beeinflusst 25,58,59. Während eine Reihe verschiedener Kollisionsenergien verwendet werden kann, ist eine optimale Strategie zur Fragmentierung von Glykopeptiden die Verwendung von abgestuften Kollisionsenergien, die die Verwendung mehrerer Kollisionsenergien 25,59,60 kombinieren.</li>
	<li>Verwenden Sie alternative Fragmentierungsmethoden, falls verfügbar, z. B. ETD für die Standortlokalisierung oder IT-CID, um die Bestimmung von Glykanzusammensetzungen zu unterstützen. HINWEIS: Keiner dieser Fragmentierungsansätze ist für die Zusammensetzungsanalyse unerlässlich, kann jedoch gesammelt werden, um eine weitere Abfrage von Glykopeptiden von Interesse zu ermöglichen.</li>
</ol>4. Analyse von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben
<ol><li>Vorfiltern von Datendateien, um die Suche in FragPipe zu ermöglichen<ol>
<li>Wenn ETD- oder IT-CID-Scans innerhalb von Datensätzen erfasst wurden, filtern Sie diese Scanereignisse mit MSConvert61 aus den Datendateien, bevor Sie mit FragPipe suchen. HINWEIS: Für die unten beschriebenen offenen Suchparameter sind nur strahlartige CID-Daten erforderlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Offene Suchen in FragPipe durchführen<ol>
<li>Öffnen Sie FragPipe, und klicken Sie auf die Registerkarte Workflow. Wählen Sie im Pulldown-Menü Workflow die Option Suche öffnen aus, und klicken Sie auf Dateien hinzufügen , um die zu durchsuchenden Datendateien in FragPipe zu importieren (Abbildung 2A).</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Datenbank und starten Sie den Download-Manager, indem Sie auf Herunterladen klicken. Auf diese Weise können Proteomdatenbanken mit einer Uniprot Proteome-ID von Uniprot heruntergeladen werden. Klicken Sie im Download-Manager auf die Option Lockvögel und Verunreinigungen hinzufügen, um Lockvögel und Schadstoffproteine in Datenbanken zu integrieren.</li>
		<li>Für strengere FDR-Schwellenwerte klicken Sie auf die Registerkarte Validierung , und ändern Sie den Filter- und Berichtswert von 0,01 in den erforderlichen FDR. HINWEIS: Die Standardeinstellungen für FragPipe gewährleisten einen FDR von 1% auf Proteinebene.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger . Erhöhen Sie im Feld Peak-Übereinstimmung die Massentoleranz des Vorläufers von den Standardwerten 500 Da auf 2.000 Da, um die Identifizierung großer Modifikationen zu ermöglichen (Abbildung 2A).</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen und definieren Sie die Position der Ausgaben von FragPipe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Suche zu starten.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie unter Verwendung der PSMs, die in Datensätzen identifiziert wurden (die in den psm.tsv-Ausgaben von FragPipe enthalten sind), potenzielle Glykane, indem Sie die Häufigkeit der beobachteten Deltamassen in Datensätzen aufzeichnen (Abbildung 3). Erstellen Sie Delta-Massenplots aus MSfragger-Ausgaben mit den R-Skripten, auf die über den PRIDE-Beitritt PXD027820 zugegriffen werden kann. HINWEIS: Innerhalb dieser Skripte wird nur eine minimale Nachbearbeitung der offenen Suchergebnisse durchgeführt, da der Hauptzweck dieser Skripte darin besteht, die Visualisierung von Delta-Massenprofilen zu unterstützen. Wichtig ist, dass die Beobachtung von reichlich vorhandenen Deltamassen allein kein Beweis dafür ist, dass eine Modifikation ein potenzielles Glykan ist, da die Zuweisung von Deltamassen als Glykane eine weitere Analyse der entsprechenden MS2-Ereignisse erfordert.</li>
	<li>Um die Charakterisierung von Glykopeptiden innerhalb von Proben zu ermöglichen, konzentrieren Sie sich auf Delta-Massenidentifikationen mit hoher Zuverlässigkeit, die Zuweisungen mit hohen Hyperscores entsprechen.<ol>
<li>Um bei der Beurteilung von Glykopeptidspektren zu helfen, verwenden Sie Peptidannotationswerkzeuge wie den Interactive Peptide Spectral Annotator63, der die Zuordnung von peptidassoziierten Ionen innerhalb von Spektren ermöglicht und die manuelle Identifizierung der Glykan-assoziierten Ionen ermöglicht (Abbildung 4). HINWEIS: Innerhalb der hier vorgestellten Datensätze gelten Hyperscores von >30 als High Scoring, da diese Scores innerhalb der oberen 50% aller identifizierten Glykopeptide entsprechen (Abbildung 5).</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie bei hochsicheren Glykopeptiden die häufig beobachteten Glykan-assoziierten Ionen (Abbildung 4), um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern. HINWEIS: Durch die Einbeziehung von Glykan-assoziierten Ionen in Suchanfragen, die als Glykan-fokussierte Suchen bekannt sind, kann die Qualität der Glykopeptid-Zuweisungen verbessert werden.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger von FragPipe, und integrieren Sie die ermittelten Deltamassen der beobachteten Glykane in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets . Fügen Sie diese Massen hinzu, indem Sie Werte in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets eingeben, wobei einzelne Massen durch ein / getrennt sind. Fügen Sie die Glykan-assoziierten Fragmentmassen dieser Glykane in den Glyco/Labile Mods-Abschnitt von MSFragger hinzu. HINWEIS: Abbildung 2B zeigt die wichtigsten Informationen, die für eine glykanfokussierte Suche des A. baumannii-Stammes AB307-0294 erforderlich sind.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden Sie alle MS-Daten, die mit Proteomik-Studien verknüpft sind, in zentralisierte Proteomic-Repositories wie die PRIDE- oder MASSIVE-Repositories hoch. HINWEIS: Alle mit dieser Studie verbundenen Daten wurden im proteomischen PRIDE-Repository hinterlegt und können über den PRIDE-Beitritt abgerufen werden: PXD027820.</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Open Search ist eine effektive und systematische Methode zur Identifizierung unbekannter Modifikationen. Während die Identifizierung unbekannter Glykane in bakteriellen Proteomproben traditionell ein zeitaufwendiges und technisch spezialisiertes Unterfangen war, ermöglichen die jüngsten Entwicklungen von Werkzeugen wie MSfragger 21,41 und Byonic 31,38 nun die schnelle und effektive Identifizierung von Deltamassen zur weiteren Charakterisierung als potenzielle Glykane,<...

Die Proteinglykosylierung, der Prozess der Bindung von Kohlenhydraten an Proteinmoleküle, ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) in der Natur 1,2. In allen Bereichen des Lebens hat sich eine Reihe komplexer Maschinen entwickelt, die sich der Erzeugung von Glykoproteinen widmen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen beeinflussen 1,3,4,5. Während die Proteinglykosylierung auf einer Reihe von Aminosäuren6,7 auftritt, sind N-verknüpfte und O-verknüpfte Glykosylierungsereignisse zwei dominante Formen, die in der Natur beobachtet werden. Bei der N-verknüpften Glykosylierung werden Glykane an ein Stickstoffatom von Asparaginresten (Asn) gebunden, während bei der O-verknüpften Glykosylierung Glykane an ein Sauerstoffatom aus Serin (Ser), Threonin (Thr) oder Tyrosin (Tyr) -Rückständengebunden sind 7. Trotz der Ähnlichkeiten in den Rückständen, auf die Glykosylierungssysteme abzielen, führen die Unterschiede innerhalb der an Proteine gebundenen Glykane dazu, dass die Glykosylierung die chemisch vielfältigste Klasse von PTMs ist, die in der Natur vorkommen.
Während eukaryotische Glykosylierungssysteme eine Glykandiversität besitzen, sind diese Systeme typischerweise in der Anzahl der verwendeten einzigartigen Kohlenhydrate begrenzt. Die resultierende Vielfalt ergibt sich aus der Art und Weise, wie diese Kohlenhydrate in Glykanen 8,9,10,11,12 angeordnet sind. Im Gegensatz dazu besitzen bakterielle und archaeale Arten aufgrund der schieren Auswahl an einzigartigen Zuckern, die in diesen Systemen erzeugt werden, eine praktisch unbegrenzte Glykanvielfalt 2,10,13,14,15,16,17. Diese Unterschiede in der Glykandiversität, die über Lebensbereiche hinweg beobachtet werden, stellen eine bedeutende analytische Herausforderung für die Charakterisierung und Identifizierung von Glykosylierungsereignissen dar. Für die eukaryotische Glykosylierung hat die Fähigkeit, Glykanzusammensetzungen zu antizipieren, das wachsende Interesse an der Glykobiologie erleichtert; Gleiches gilt jedoch nicht für die bakterielle Glykosylierung, die immer noch weitgehend auf die Untersuchung durch spezialisierte Labors beschränkt ist. Da die Zugänglichkeit von Instrumenten der Massenspektrometrie (MS) in den Biowissenschaften zugenommen hat, sind MS-basierte Ansätze heute die primäre Methode für die glykoproteomische Analyse.
MS hat sich als das wichtigste Werkzeug für die Charakterisierung der Glykosylierung herausgestellt, wobei sowohl Top-down- als auch Bottom-up-Ansätze heute häufig zur Charakterisierung von Glykoproteinenverwendet werden 6. Während Top-down-Proteomik verwendet wird, um globale Glykosylierungsmuster spezifischer Proteine18,19 zu bewerten, werden Bottom-up-Ansätze verwendet, um die glykanspezifische Charakterisierung von Glykopeptiden zu ermöglichen, selbst aus komplexen Mischungen6,20,21,22,23. Für die Analyse von Glykopeptiden ist die Generierung von informativen Fragmentierungsinformationen für die Charakterisierung von Glykosylierungsereignissenessentiell 24,25. Eine Reihe von Fragmentierungsansätzen ist jetzt routinemäßig auf Instrumenten zugänglich, darunter die auf Resonanzionenfallen basierende kollisionsinduzierte Dissoziation (IT-CID), die kollisionsinduzierte Dissoziation vom Strahltyp (CID) und die Elektronentransferdissoziation (ETD). Jeder Ansatz besitzt unterschiedliche Stärken und Schwächen für die Glykopeptidanalyse 25,26, mit signifikanten Fortschritten in den letzten zehn Jahren bei der Anwendung dieser Fragmentierungsansätze zur Analyse der Glykosylierung 6,20. Für die bakterielle Glykosylierungsanalyse war die entscheidende Einschränkung jedoch nicht die Fähigkeit, Glykopeptide zu fragmentieren, sondern die Unfähigkeit, die potenziellen Glykanzusammensetzungen in Proben vorherzusagen. Innerhalb dieser Systeme schränkt die unbekannte Natur verschiedener bakterieller Glykane die Identifizierung von Glykopeptiden ein, selbst mit Glykosylierungs-fokussierten Suchwerkzeugen, die heute für die Analyse eukaryotischer Glykopeptide wie O-Pair27, GlycopeptideGraphMS 28 und GlycReSoft29 üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, ist eine alternative Suchmethode erforderlich, wobei sich der Einsatz offener Suchwerkzeuge als leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung der bakteriellen Glykosylierungherausstellt 30.
Die offene Suche, auch Blind- oder Wildcard-Suche genannt, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden mit unbekannten oder unerwarteten PTMs 21,30,31,32. Offene Suchen verwenden eine Vielzahl von Berechnungstechniken, einschließlich kuratierter Modifikationssuchen, mehrstufiger Datenbanksuchen oder massentoleranter Suche 33,34,35,36,37. Obwohl die offene Suche ein großes Potenzial hat, wurde ihre Verwendung typischerweise durch die signifikante Zunahme der Analysezeiten und den Verlust der Empfindlichkeit des Nachweises von unmodifizierten Peptiden im Vergleich zu eingeschränkten Suchenbehindert 31,32. Die Abnahme des Nachweises von unmodifizierten Peptid-Spektral-Matches (PSMs) ist ein Ergebnis der erhöhten falsch-positiven PSM-Raten, die mit diesen Techniken verbunden sind, was eine erhöhte strenge Filterung erfordert, um die gewünschten Falscherkennungsraten (FDRs) aufrechtzuerhalten 33,34,35,36,37 . In letzter Zeit sind mehrere Tools verfügbar, die die Zugänglichkeit der offenen Suche erheblich verbessern, darunter Byonic 31,38, Open-pFind 39, ANN-SoLo 40 und MSFragger21,41. Diese Werkzeuge ermöglichen die robuste Identifizierung von Glykosylierungsereignissen, indem sie die Analysezeiten erheblich reduzieren und Ansätze zur Handhabung heterogener Glykanzusammensetzungen implementieren.
Dieser Artikel stellt eine optimierte Methode zur Identifizierung bakterieller Glykopeptide durch offene Suche am Beispiel des gramnegativen nosokomialen Erregers Acinetobacter baumannii vor. A. baumannii besitzt ein konserviertes O-verknüpftes Glykosylierungssystem, das für die Modifikation mehrerer Proteinsubstrate verantwortlich ist, bekannt als das PglL-Proteinglykosylierungssystem42,43,44. Während ähnliche Proteine auf die Glykosylierung zwischen Stämmen abzielen, ist das PglL-Glykosylierungssystem aufgrund der Biosynthese des Glykans, das für die Proteinglykosylierung verwendet wird, sehr variabel, da es vom Kapselort (bekannt als K-Locus) abgeleitet ist44,45,46. Dies führt dazu, dass verschiedene Glykane (auch bekannt als K-Einheit), die aus einzelnen oder begrenzten polymerisierten K-Einheiten abgeleitet sind, zu Proteinsubstraten 30,44,46 hinzugefügt werden. Innerhalb dieser Arbeit wird die Verwendung des offenen Suchwerkzeugs MSfragger innerhalb der Software FragPipe verwendet, um Glykane über A. baumannii-Stämme zu identifizieren. Durch die Kombination von offener Suche und manueller Kuration können "glykanfokussierte Suchen" durchgeführt werden, um die Identifizierung bakterieller Glykopeptide weiter zu verbessern. Zusammen ermöglicht dieser mehrstufige Identifikationsansatz die Identifizierung von Glykopeptiden ohne umfangreiche Erfahrung in der Charakterisierung neuartiger Glykosylierungsereignisse.

<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F Hub Point Style 3</td><td>Hamilton company</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloracetamid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (28%)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Reagenz A</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Reagenz B</td><td>Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>Ein alternativer Anbieter für C8-Material ist Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>Ein alternativer Anbieter für SDB-RPS ist Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris 2-Carboxyethylphosphinhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C-Proteasegemisch</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumkonzentrator</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>ZIC-HILIC-Material</td><td>Merck</td><td>1504580001</td><td>Harz für den Einsatz in Einweg-SPE-Säulen kann durch Entleeren einer größeren Formsäule und Verwendung des freien Harzes gewonnen werden</td></tr></tbody></table>

die anwendung offener suchbasierter ansätze zur identifizierung von acinetobacter baumannii o-verknüpften glykopeptiden

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Die Proteinglykosylierung wird zunehmend als häufige Modifikation in bakteriellen Organismen anerkannt, die zur prokaryotischen Physiologie und optimalen Infektiosität pathogener Spezies beiträgt. Aus diesem Grund steigt das Interesse an der Charakterisierung der bakteriellen Glykosylierung und der Bedarf an Hochdurchsatz-Analysewerkzeugen zur Identifizierung dieser Ereignisse. Obwohl die Bottom-up-Proteomik leicht die Generierung reichhaltiger Glykopeptiddaten ermöglicht, machen die Breite und Vielfalt der in prokaryotischen Spezies beobachteten Glykane die Identifizierung bakterieller Glykosylierungsereignisse äußerst schwierig.
Traditionell machte die manuelle Bestimmung von Glykanzusammensetzungen in bakteriellen Proteomdatensätzen dies zu einer weitgehend maßgeschneiderten Analyse, die auf feldspezifische Experten beschränkt war. In jüngster Zeit haben sich offene suchbasierte Ansätze als leistungsfähige Alternative zur Identifizierung unbekannter Modifikationen herauskristallisiert. Durch die Analyse der Häufigkeit einzigartiger Modifikationen, die an Peptidsequenzen beobachtet wurden, ermöglichen offene Suchtechniken die Identifizierung von gewöhnlichen Glykanen, die an Peptide in komplexen Proben gebunden sind. Dieser Artikel stellt einen optimierten Workflow für die Interpretation und Analyse von glykoproteomischen Daten vor und zeigt, wie offene Suchtechniken verwendet werden können, um bakterielle Glykopeptide ohne Vorkenntnisse der Glykanzusammensetzungen zu identifizieren.
Mit diesem Ansatz können Glykopeptide in Proben schnell identifiziert werden, um Glykosylierungsunterschiede zu verstehen. Am Beispiel von Acinetobacter baumannii ermöglichen diese Ansätze den Vergleich von Glykanzusammensetzungen zwischen Stämmen und die Identifizierung neuartiger Glykoproteine. Zusammengenommen demonstriert diese Arbeit die Vielseitigkeit offener Datenbanksuchtechniken zur Identifizierung der bakteriellen Glykosylierung, wodurch die Charakterisierung dieser sehr unterschiedlichen Glykoproteome einfacher als je zuvor ist.

Um den Nutzen der offenen Suche nach bakterieller Glykopeptidanalyse zu veranschaulichen, wurde die chemische Vielfalt von O-verknüpften Glykanen innerhalb von drei Stämmen von A. baumannii-AB307-0294, ACICU und D1279779-bewertet. Die O-verknüpften Glykoproteome sind zwischen den Stämmen von A. baumannii sehr variabel, da die für die Glykosylierung verwendeten Glykane von den hochvariablen Kapselloci44,45,46<sup clas...

Die offene Suche ermöglicht die Identifizierung von Glykopeptiden, die mit bisher unbekannten Glykanzusammensetzungen verziert sind. In diesem Artikel wird ein optimierter Ansatz für die Durchführung einer offenen Suche und anschließende Glykan-fokussierte Glykopeptidsuche für Bakterienproben unter Verwendung von Acinetobacter baumannii als Modell vorgestellt.

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Dieses Protokoll rationalisiert die Identifizierung von bakteriellen Glykop%eptiden, so dass Forscher neue Glykosylierungsereignisse sowie die Unterschiede in den Glykanen, die für die Glykosylierung zwischen Stämmen verwendet werden, identifizieren können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es Nicht-Glykosylierungsexperten ermöglicht, potenzielle Glykosylierungsereignisse in bakteriellen Proteomproben zu identifizieren. Die offene Suche ist ein allgemein anwendbarer Ansatz, der zur Identifizierung einer Reihe von Modifikationen, nicht nur der Glykosylierung, verwendet werden kann und auf jede Proteomprobe angewendet werden kann.Um STB-RPS-Stop-and-Go-Extraktionsspitzen vorzubereiten, verwenden Sie eine stumpfe 14-Gauge-Nadel, um drei STB-RPS-Scheiben aus einer 47-Quadratmillimeter-STB-RPS-Membran zu entfernen, um 50 Mikrogramm Peptid zu binden. Für größere Peptidmengen erhöhen Sie die Anzahl der Bandscheiben entsprechend. Bevor Sie die SDB-RPS-Tischspitzen verwenden, waschen Sie die Spitzen, indem Sie 150 Mikroliter 100% Acetonitril zugeben und den Puffer durch Zentrifugation oder sanften Druck mit einer Spritze drehen.Als nächstes waschen Sie die Spitzen mit 150 Mikrolitern 30% Methanol mit 1% TFA und gleichen dann die Spitzen mit 150 Mikrolitern 90% Isopropanol mit 1% TFA aus. Nach dem Äquilibrieren laden Sie die Proteomproben durch Zentrifugation oder mit einer Spritze auf die STB-RPS-Tischspitzen. Dann waschen Sie die Spitzen mit 150 Mikrolitern 90% Isopropanol, das 1% TFA enthält, gefolgt von 150 Mikrolitern 1% TFA.Um die Peptide aus den STB-RPS-Stufenspitzen zu eluieren, verwenden Sie 150 Mikroliter 5% Ammoniumhydroxid und 80% Acetonitril, die zu einer einzigen Spitze hinzugefügt werden, und sammeln Sie die eluierten Proben in einzelnen Röhrchen durch sanften Druck mit einer Spritze. Alternativ, wenn Sie durch Zentrifugation eluieren, verwenden Sie 150 Mikroliter bei 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril, das zu allen Stufenspitzen hinzugefügt wird, und sammeln Sie es in einer sauberen Platte. Trocknen Sie die eluierten Peptide durch Vakuumzentrifugation bei 25 Grad Celsius.Als nächstes, um die Glykopeptidproben anzureichern, bereiten Sie eine zwitterionische hydrophile Wechselwirkungsflüssigkeitschromatographie oder ZIC-HILIC, Stufenspitzen vor. Entfernen Sie eine C8-Disc aus einer 470-Quadratmillimeter-C8-Membran mit einer stumpfen 14-Gauge-Nadel und packen Sie die Disc in eine P-200-Spitze, um eine Fritte zu erzeugen. Fügen Sie dann etwa fünf Millimeter ZIC-HILIC-Material, das in 50% Acetonitril resuspendiert ist, auf die Fritte auf, indem Sie mit einer Spritze vorsichtig Druck ausüben.Bevor Sie die Spitzen verwenden, gleichen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Elutionspuffer aus, wobei 10 Mikroliter Volumen über dem Harz verbleiben, um sicherzustellen, dass das Harz nicht austrocknet. Waschen Sie dann das Harz nacheinander mit 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Vorbereitungspuffer, gefolgt von 20 Bettvolumen ZIC-HILIC-Lade- oder Waschpuffer. Als nächstes resuspendieren Sie die verdauten und getrockneten Peptide im ZIC-HILIC-Ladepuffer auf eine Endkonzentration von vier Mikrogramm pro Mikroliter.Wirbeln Sie kurz für eine Minute, um sicherzustellen, dass die Proben wieder suspendiert sind, und drehen Sie sie dann für eine Minute bei 2000 mal G und 25 Grad Celsius. Nach dem Spinnen die resuspendierte Peptidprobe auf die konditionierte ZIC-HILIC-Säule laden und dann die Säule dreimal mit 20 Bettvolumina des ZIC-HILIC-Ladepuffers waschen, indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben. Zum Schluss die Glykopeptide mit 20 Bettvolumina des ZIC-HILIC-Elutionspuffers in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen elutieren, indem man vorsichtig Druck mit einer Spritze ausübt, und dann das Elutionsmittel durch Vakuumzentrifugation bei 25 Grad Celsius trocknen.Für die LC-MS-Analyse resuspendieren Sie die Proben in Puffer A* auf eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter und laden Sie die Proben dann auf einen HPLC-UPLC, der mit einem MS gekoppelt ist, um die Trennung und Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen. Überwachen Sie die resultierende MS-Datensammlung und stellen Sie sicher, dass die Daten mit den gewünschten Parametern gesammelt werden. Um die Proteom- und Glykopeptid-angereicherten Proben zu analysieren, öffnen Sie FragPipe und klicken Sie auf die Registerkarte Workflow.Wählen Sie im Pulldown-Menü Workflow die Option Suche öffnen aus, und klicken Sie auf Dateien hinzufügen, um die zu durchsuchenden Datendateien in FragPipe zu importieren. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Datenbank und anschließend auf Download, um den Download-Manager zum Herunterladen von Proteomdatenbanken von UniProt mit einer UniProt-Zugangsnummer zu starten. Klicken Sie im Download-Manager auf die Option Lockvögel und Verunreinigungen hinzufügen, um Lockvögel und kontaminierende Proteine in diese Datenbank zu integrieren.Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte MSFragger, und erhöhen Sie dann im Feld Spitzenabgleich die Massentoleranz des Vorläufers von 500 Dalton auf 2.000 Dalton, um große Änderungen zu identifizieren. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen, um den Speicherort der Ausgaben von FragPipe zu definieren, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen, um die Suche zu starten. Identifizieren Sie mit hochsicheren Glykopeptiden die häufig beobachteten Glykan-assoziierten Ionen, um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern.Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte MSFragger, und fügen Sie die ermittelten Deltamassen der beobachteten Glykane den Abschnitten Variable modifications und Mass Offsets hinzu, wobei einzelne Massen durch einen Schrägstrich getrennt sind. Dann fügen Sie die Glykan-assoziierten Fragmentmassen dieser Glykane in den Glyco / Labile Mods-Abschnitt von MSFragger hinzu. Laden Sie schließlich alle MS-Daten, die mit proteomischen Studien verknüpft sind, in zentralisierte proteomische Repositories hoch, z. B. die PRIDE- oder MassIVE-Repositories.Die offene Suche nach dem Acinetobacter baumannii-Stamm AB307-0294 ergab zwei dominante Deltamassen, die 648,25 und 692,28 Dalton entsprechen. Es ist bekannt, dass die ACICU-Kapsel aus einer Tetrasaccharid-K-Einheit besteht, die einer vorhergesagten Masse von 843,31 Dalton entspricht. Diese Kapselstruktur stimmt mit der am häufigsten beobachteten Deltamasse innerhalb der ACICU überein.Die offene Suchanalyse des Stammes D1279779 ergab das Vorhandensein mehrerer Deltamassen, die mit 203,08, 794,31 und 1588,62 Dalton übereinstimmen. Mit dem interaktiven Peptid-Spektralannotator wurden Glykopeptide, die in drei A.baumannii-Stämmen identifiziert wurden, bewertet, wobei potenzielle Glykan-assoziierte Ionen aufgedeckt wurden. Glykan-fokussierte Suchen führten zu einem bemerkenswerten Anstieg der Gesamtzahl der Glykopeptid/Peptid-Spektralübereinstimmungen, die über alle drei A.baumannii-Stämme identifiziert wurden, was einem Anstieg von 37% bei ACICU, einem Anstieg von 117% bei AB307-0294 und einem Anstieg von 363% bei D1279779 entspricht.Bei einzelnen MS-Ereignissen erhöht die Einbeziehung von glykanspezifischen Informationen typischerweise den beobachteten Hyperscore, obwohl dieser Anstieg stark glykanabhängig ist. Stellen Sie bei der ZIC-HILIC-Anreicherung sicher, dass das Harz immer nass bleibt, da der Verlust von Lösungsmitteln die Isolierung von Glykopeptiden beeinträchtigen kann. Daten über Unterschiede in der Glykosylierung können verwendet werden, um Mutagenesestudien zu informieren oder Genklassen zu identifizieren, die für die Glykanbiosynthese verantwortlich sind.Mit der offenen Datenbanksuche haben wir begonnen, die Glykanvielfalt über Bakteriengattungen hinweg zu charakterisieren. Dies hat gezeigt, dass die bakterielle Glykosylierung sowohl häufiger als auch weitaus vielfältiger ist, als wir einst dachten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Wir haben vor kurzem einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von fluorogenen DNAzym Sonden, die angewendet zur Einrichtung eine einfache, "Mix-and-read" Fluoreszenz-Assay für die bakterielle Nachweis kann berichtet werden. Diese speziellen DNA-Sonden katalysieren die Spaltung eines Chromophors-modifizierten DNA-RNA-chimären Substrat in Gegenwart von rohem extrazellulären Mischung (CEM) von einem bestimmten Bakteriums fort, wodurch Nachweis von Bakterien in Fluoreszenz-Erzeugungseinheit erzeugt...

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Wir beschreiben einen elektrochemischen Sensor Testverfahren zum schnellen Nachweis von Bakterien und Identifikation. Der Test umfasst eine Sensoranordnung mit DNA-Oligonukleotid-Capture-Sonden für die ribosomale RNA (rRNA) artspezifische Sequenzen funktionalisiert. Sandwich-Hybridisierung der Ziel-rRNA mit dem Capture-Sonde und einem Meerrettichperoxidase-linked DNA-Oligonukleotid Detektorsonde erzeugt eine messbare amperometrischen Strom.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

IDBac ist eine Open-Source-Pipeline für Massenspektrometrie, die Daten sowohl aus intakten Proteinen als auch aus spezialisierten Metabolitenspektren integriert, die auf Zellmaterial gesammelt werden, das aus Bakterienkolonien abgekratzt wurde. Die Pipeline ermöglicht es Forschern, schnell Hunderte bis Tausende von Bakterienkolonien in vermeintliche taxonomische Gruppen zu organisieren und sie auf der Grundlage der spezialisierten Metabolitenproduktion weiter zu differenzieren.

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

Dieses Protokoll umfasst eine detaillierte Analyse der Peptidoglykanzusammensetzung mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie in Verbindung mit fortschrittlicher Merkmalsextraktion und bioinformatischer Analysesoftware.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Um den schnellen und präzisen Nachweis von Acinetobacter baumannii zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) in Verbindung mit der LbaCas12a-Endonuklease zur Identifizierung von A. baumannii-Infektionen verwendet.

Schneller und spezifischer Nachweis von Acinetobacter baumannii-Infektionen mit einem Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-/Cas12a-basierten System

Wir schlagen ein Protokoll vor, um Fettsäuren zu identifizieren, ohne sie reinigen zu müssen. Es kombiniert Informationen über die Retentionszeiten mit den Massenspektren von drei Arten von Fettsäurederivaten: Fettsäuremethylester (FAMEs), 4,4-Dimethyloxazolinderivate (DMOX) und 3-Pyridylcarbinylester (Picolinyl).

Identifizierung von Fettsäuren in<em&gt; Bacillus cereus</em

Erfahren Sie, wie offene Suchansätze die Identifizierung von O-verknüpften Glykopeptiden in Acinetobacter baumannii ermöglichen. Diese Methode erleichtert die Entdeckung neuer Glykosylierungsereignisse auch für Nicht-Experten.

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

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