Ein verbesserter Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktantien in Wurzelexsudaten
25. März 2022
Hier präsentieren wir ein verbessertes Chemotaxis-Assay-Protokoll. Ziel dieses Protokolls ist es, die Schritte und Kosten herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden zu reduzieren und als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu dienen.
Die Arbeit berichtete über die Identifizierung von Chemoattraktiva von Rhizobakterien in Wurzelexsudaten unter Verwendung eines verbesserten Chemotaxis-Assays. Chemotaxis-Implantatwurzelbetätigungen sind wichtig für die Wurzelbesiedlung für das Pflanzenwachstum, die Förderung von Rhizobienbakterien und für die Bereitstellung der hilfreichen Fraktionen von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. Viele Methoden wurden zur Analyse der bakteriellen Chemotaxis verwendet.
Zum Beispiel Schwimmplattenmethode, Cappilary-ähnliche Methode, mikrofluidisches Slipchip-Gerät. Der Experimentzyklus der Schwimmplattenmethode war lang. Der experimentelle Fehler der Cappilary-ähnlichen Methode wurde gestartet, mikrofluidische Slipchip-Gerät ist teuer zu experimentieren.
Wir haben eine einfache Methode etabliert, um schnell das Chemoattraktivum zu identifizieren, das die chemotaktische Bewegung von rhizosphärenwachstumsfördernden Bakterien mit sterilen Glasobjektträgern ohne komplizierte Schritte induzieren könnte. Die Methode reduzierte den Fehler der Plattenzählung und verkürzte den Experimentzyklus. In Bezug auf die Identifizierung einer chemoattraktiven Substanz könnte die neue Methode 2-3 Tage einsparen und auch die Kosten für experimentelle Materialien senken.
Verteilen Sie zufällig Reissamen in der Anbaukammerkultur entsteht für eine Woche und fügen Sie zweimal steriles Wasser hinzu. Wählen Sie die Reissämlinge ähnlicher Größe aus und pflanzen Sie sie in einem 50 Milliliter Ms flüssiges Medium. Inkubieren Sie für 48 Stunden bei 22 Grad Celsius und septischen Bedingungen.
Reiswurzelexsudate werden in das Ms-Medium freigesetzt. Flüssigkeitschromatographie Massenspektrometrie Die Analyse wurde mit dem UHPLC-System durchgeführt. Bereiten Sie chemoattraktive wässrige Lösung vor, um sicherzustellen, dass sie steril ist.
Filtern Sie die chemoattraktive Lösung mit einem 0,22 Mikrometer Bakterienfilter. Die chemoattraktive wässrige Lösung war die aus den LCMS-Studien erhaltene Einzelsubstanz, die in Wasser gelöst wurde. Als Beispiel wurde die Citrix Acid-Lösung verwendet.
Alle Aktionen müssen an der Seite der Lampe ausgeführt werden. Markieren Sie die mittlere Position des Glasobjektträgers in einem Abstand von 1 Zentimeter. Stellen Sie sicher, dass der Glasobjektträger mehrmals auf der Flamme sterilisiert wird.
An der 30 Mikroliter chemoattraktiven Lösung auf der linken Seite des Glasobjektträgers wird sichergestellt, dass Bakterien bis ins logarithmische Stadium kultiviert wurden. Fügen Sie die 30 Mikroliter-Bakterienlösung auf der rechten Seite des Glasobjektträgers hinzu. Sterilisieren Sie die Impfschleife mehrmals auf der Flamme mit der Impfschleife, um die chemoattraktive wässrige Lösung mit der Bakterienlösung zu verbinden, und halten Sie sie 20 Minuten lang auf einer sauberen Bank bei Raumtemperatur.
Nach 20 Minuten trennen Sie die Verbindungsleitung mit Filterpapier. Stellen Sie sicher, dass das 1,5 Milliliter zentrifugierte Röhrchen steril ist. Sammeln Sie die chemoattraktive wässrige Lösung auf der linken Seite des Glasobjektträgers.
Die Lösung wird in das sterile zentrifugierte Röhrchen mit 1,5 Millilitern überführt. Geben Sie das entsprechende Volumen des Zellfrontfarbstoffs in das zentrifugierte Röhrchen. Sammeln Sie nach 2 Minuten die fehlbaren Flüssigkeiten für die Bakterienzählung und mikroskopische Beobachtung mit einer Blutzählkammer.
Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Mikroorganismen, die angezogen werden, mit einer folgenden Gleichung. Ein höherer RCI weist auf eine starke Reaktion auf das Chemoattraktivum hin. Die Ergebnisse zeigten, dass Zitronensäure und Kaffeesäure die höchsten Chemotaxis-Indizes aufweisen.
Die Ergebnisse der neuen Chemotaxis-Assay-Methode schrieben, dass die bakterielle Dosenkonzentration von Zitronensäure, Kaffeesäure und Galactose-Experimenten signifikant höher war als die der Kontrollgruppe und der Positivkontrolle. Zitronensäure schrieb die stärkste Chemotaxis. Die experimentellen Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen traditioneller Methoden überein.
Dieses Videoprotokoll kann als wertvolle Ressource zur Aufklärung von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen dargestellt werden.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein verbessertes Protokoll für den Chemotaxis-Assay vor, das darauf abzielt, die Effizienz und Kosteneffektivität herkömmlicher Methoden zur bakteriellen Chemotaxis zu erhöhen. Die entwickelte Methode ermöglicht die Identifizierung von Chemoattraktanten aus Rhizobakterien in Wurzelausscheidungen und trägt somit zu unserem Verständnis der Pflanze-Mikrobe-Interaktionen bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Bakterielle Chemotaxis
- Pflanzen-Mikroben-Interaktionen
- Wurzelausscheidungen
Hintergrund
- Herkömmliche Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Chemotaxis sind oft zeitaufwändig und kostspielig.
- Diese Studie konzentriert sich darauf, diese Methoden zu verbessern, um praktische Anwendungen zu erweitern.
- Die Identifizierung der Rolle von Chemoattraktanten in Rhizosphären-Interaktionen ist entscheidend für das Pflanzenwachstum.
Verwendete Methoden
- Ein vereinfachtes Protokoll unter Verwendung steriler Objektträger
- Untersuchung bakterieller Reaktionen auf verschiedene Chemoattraktanten
- Anwendung der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie zur Analyse
Hauptergebnisse
- Zitronensäure und Caffeinsäure wurden als die wirksamsten Chemotaktika zur Förderung der bakteriellen Chemotaxis identifiziert.
- Die neue Methode verringerte die Fehlerquoten und die experimentelle Zeitspanne erheblich.
- Die gegenüber traditionellen Methoden validierten Ergebnisse zeigten Konsistenz und Zuverlässigkeit.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt eine wertvolle Ressource für das Verständnis und die Verbesserung von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen bereit.
- Dieses verbesserte Assay-Protokoll könnte weitere Forschungen in der agrarischen Biotechnologie erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Bedeutung für die Industrie
Dieser verbesserte Chemotaxis-Assay ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Identifizierung bioaktiver Verbindungen in Wurzelexsudaten, die förderliche Pflanze-Mikrobe-Interaktionen hervorrufen. Durch die Verkürzung der Versuchsdauer und die Minimierung von Zählfehlern unterstützt das Verfahren die frühe Validierung von Zielstrukturen in biotechnologischen Agrar-Pipelines. Es bietet einen skalierbaren und reproduzierbaren Ansatz zur Risikominderung bei der Identifizierung von Signalmolekülen rhizobakterieller Bakterien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von rhizobakteriellen Chemoattraktanten als bioaktive Signalstoffe in der Pflanze-Mikrobe-Kommunikation.
- Operativer Wert: Verringert die Dauer des Assays von Tagen auf Stunden und beschleunigt so die Untersuchung von Wurzelausscheidungsfraktionen auf chemotaktische Aktivität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Chemotaxis-Index-(RCI-)Messungen, um die Wirksamkeit von Verbindungen in einem standardisierten Format einzustufen.
- Operativer Wert: Verwendet sterile Glasobjektträger und tropfenweise Inokulation für eine kostengünstige, hochdurchsatzfähige Untersuchung wässriger Chemoattraktantlösungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet identifizierte Chemoattraktanten (z. B. Zitronensäure, Kaffeesäure) mit mikrobiellen Kolonisationsphänotypen, die für die Leistung unter Feldbedingungen relevant sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht eine schnelle Iteration in den Optimierungszyklen, indem die Dauer des Assays im Vergleich zu platten- oder kapillarbasierten Methoden um 2–3 Tage verkürzt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen Metaboliten aus Wurzelexudaten auf mikrobielle Signalaktivität untersucht werden, bevor die Optimierung von Leitsubstanzen und die Formulierungsentwicklung erfolgen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der metabolitgetriebenen Chemotaxis als Mechanismus für die Rhizosphärenbesiedlung und Wachstumsförderung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte (Bakterienzahlen mittels Hämozytometer) zum Vergleich der Chemoattraktant-Wirksamkeit unter verschiedenen Bedingungen.
- Analytik: Erzeugt Daten zum relativen Chemotaxis-Index (RCI), die eine Rangfolge der Verbindungswirksamkeit zur Priorisierung ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Identifizierung von Metaboliten mit funktionellen Ergebnissen und unterstützt damit eine biomarkerähnliche Validierung von Exsudatbestandteilen in der Pflanze-Mikrobe-Signalübertragung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Plattform kann mit minimaler Neubewertung über verschiedene Bakterienstämme und Pflanzensysteme hinweg wiederverwendet werden und fördert die Standardisierung über Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielstrukturauswahl, indem falsch-positive Ergebnisse aufgrund von Zählvariabilität und Methodenbias reduziert werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Beurteilung von Chemotaxis über verschiedene Labore hinweg mittels eines sterilen Objektträger-Protokolls und minimiert so die Variabilität zwischen verschiedenen Anwendern.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen bezüglich mikrobieller Inokulanz-Kandidaten, indem die mechanistische Risikominimierung von Wirt-Mikrobe-Signalwegen beschleunigt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung führender Metabolite oder mikrobieller Stämme basierend auf validierten Daten zur chemotaktischen Reaktion.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt eine aseptische Technik zur Sterilisation von Objektträgern und Lösungen, um Kontaminationen zu vermeiden.
- Hängt von dem Zugang zu Flüssigkeitsmanipulationsgeräten (Pipetten, Inokulationshaken) und Mikroskopie (Blutkörperchenzähler) zur Bestimmung der lebensfähigen Zellanzahl ab.
- Erfordert die Standardisierung der Bakterienkultur-Dichte (OD600 = 0,5) und der Inkubationszeit (20 min, Raumtemperatur) für reproduzierbare Ergebnisse.
- Die Anpassung an nicht-rhizobakterielle Stämme kann eine Optimierung der Löslichkeit von Chemoattraktanten und der Beweglichkeitsbedingungen der Bakterien erfordern.
- Praktische Einschränkung: Am besten geeignet für wasserlösliche Chemoattraktanten mit niedrigem Molekulargewicht; unlösliche oder hochmolekulare Verbindungen können eine alternative Applikationsmethode benötigen.
