Verwendung von Alizarin-Rotfärbung zum Nachweis von chemisch induziertem Knochenverlust bei Zebrafischlarven
28. Dezember 2021
Hier haben wir die Alizarin-Rot-Färbung verwendet, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat eine Veränderung der Knochenmasse bei Zebrafischlarven verursacht. Diese Färbemethode kann an die Untersuchung des Knochenverlustes bei Zebrafischlarven angepasst werden, der durch andere gefährliche Giftstoffe induziert wird.
Diese Methode kann helfen, die Knochentoxizität zu erkennen, die durch Chemikalien im Zebrafisch induziert wird. Alizarin Red Die Färbung von festem Gewebe erzeugt eine permanente Aufzeichnung von Skelettveränderungen, die den Vergleich mehrerer Proben erleichtern kann. Diese Technik könnte hilfreich sein, um Osteoporose im Zebrafischmodell zu untersuchen, da eines der Merkmale der Osteoporose die Abnahme der Knochenmasse ist.
Entfernen Sie neun Tage nach der Befruchtung zufällig 10 Zebrafischlarven aus jeder Gruppe und fixieren Sie den Fisch in einem Milliliter 2% paraformem Aldehyd und 1X PBS für zwei Stunden. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Zebrafischlarve mit 100 Millimolar Tris HCL mit einem pH-Wert von 7,5 oder 10 Millimolar Magnesiumchlorid. Zum Entfärben dekantieren Sie die Lösung und inkubieren Sie die Larve fünf Minuten lang in einer Reihe von Lösungen, wie im Manuskript beschrieben.
Nach der letzten Inkubation die Lösung dekantieren und das Pigment durch Bleichen mit einer Lösung aus 3% Wasserstoffperoxid und 0,5% Kaliumhydroxid entfernen. Einmal alle 10 Minuten beobachten, bis das Pigment vollständig entfernt ist. Spülen Sie die Zebrafischlarve mehrmals mit 25% Glycerin, 0,1% Kaliumhydroxid für jeweils 10 Minuten, bis keine Blasen mehr vorhanden sind.
Färbung in der Larve durch Einweichen in einem Milliliter von 0,01% Alizarin. Dekantieren Sie die Lösung und fügen Sie einen Milliliter 50% Glycerin oder 0,1% Kaliumhydroxid hinzu, um den Hintergrund zu entfernen. Lagern Sie den Fisch in frischem 50% Glycerin oder 0,1% Kaliumhydroxid für die anschließende Beobachtung.
Übertragen Sie eine Larve nach der anderen auf den Glasobjektträger, wobei die Larve in der Mitte des Flüssigkeitstropfens bleibt. Beobachten Sie die Larve unter einem Stereomikroskop. Schalten Sie die Kamera ein.
Öffnen Sie die Software und behalten Sie die Standardeinstellungen bei. Klicken Sie auf AE und wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit, um das beste Bild zu erhalten. Nehmen Sie alle Bilder unter den gleichen Einstellungen auf.
Speichern Sie die Bilder zur späteren Analyse im Dot-tiff-Format. Doppelklicken Sie auf das imageJ-Symbol. Um die gespeicherten Bilder zu analysieren, klicken Sie auf Datei, dann öffnen, dann auf Bild, dann eingeben und wählen Sie Acht-Bit.
Klicken Sie auf Bearbeiten und kehren Sie um. Klicken Sie auf Analysieren, dann auf Kalibrieren. Wählen Sie in der Popup-Oberfläche Unkalibrierte OD aus.
Überprüfen Sie die globale Kalibrierung unten links auf der unteren Benutzeroberfläche und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Analysieren, Skalierung festlegen und dann Skalierung entfernen. Aktivieren Sie unten Global und klicken Sie auf OK.
Klicken Sie auf Analysieren und legen Sie dann Messungen fest. Wählen Sie den Elementbereich in der Popup-Oberfläche aus. Aktivieren Sie den Grenzwert auf den Schwellenwert unten, um nur den ausgewählten Bereich zu messen, und klicken Sie auf OK.
Klicken Sie auf das Bild, passen Sie den Schwellenwert an und schieben Sie den Schieberegler in die Mitte der Popup-Oberfläche. Um den entsprechenden Schwellenwert auszuwählen, damit alle zu testenden Ziele in einem Bild ausgewählt werden. Und klicken Sie auf Festlegen.
Klicken Sie auf Analysieren, dann messen, speichern Sie die Daten. Alizarin Red Staining ist eine empfindliche und spezifische Methode zur Messung von Veränderungen der Knochenmineralisierung in Zebrafischlarven. Neun Tage nach der Befruchtung sind viele Knochen des Kopfskeletts wie Parasphenoid, operkulär, ceratobranchial und Notochord mineralisiert und daher rot gefärbt.
Im Gegensatz dazu erscheinen nicht-knöcherne Strukturen wie Otolithen braunschwarz. Die digitale Analyse, die zur Quantifizierung der gesamten gefärbten Fläche durchgeführt wurde, zeigte eine signifikante Abnahme der gefärbten Fläche für die 10 und 20 Milligramm pro Liter Bleiacetat-Behandlungsgruppen. Die Veränderungen der Knochenmineralisierung zeigten eine Dosisabhängigkeit.
Für eine bessere Färbungswirkung und Beobachtung ist es wichtig, das ursprüngliche Pigment der Zebrafischlarven zu entfernen und die Blasen nach dem Bleichen zu entfernen.
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Übersicht
Diese Studie nutzt die Alizarinfärbung, um zu zeigen, dass die Exposition gegenüber Bleiacetat zu Veränderungen der Knochenmasse bei Zebrafischembryonen führt. Die Methode eignet sich zur Untersuchung von Knochenverlust, der durch verschiedene schädliche Toxine verursacht wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Toxikologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Die Alizarinrot-Färbung ist eine Methode zur Visualisierung von Skelettstrukturen.
- Zebrafische sind ein Modellorganismus zur Untersuchung der Knochenentwicklung und Toxizität.
- Essigsäureblei ist dafür bekannt, toxische Wirkungen auf biologische Systeme auszuüben.
- Osteoporose zeichnet sich durch eine verminderte Knochenmasse aus, was sich bei Zebrafischen modellieren lässt.
Zweck der Studie
- Beurteilung der Auswirkungen von Bleiacetat auf die Knochenmasse bei Zebrafischlarven.
- Entwicklung einer Methode zum Nachweis von knöcherner Toxizität, die durch Chemikalien hervorgerufen wird.
- Ermöglichung des Vergleichs von Skelettveränderungen zwischen verschiedenen Proben.
Verwendete Methoden
- Alizarinrot-Färbung von fixiertem Zebrafischgewebe.
- Fixierung von Zebrafischembryonen in Paraformaldehyd und PBS.
- Waschen der Embryonen mit Tris-HCl oder Magnesiumchlorid.
- Entfärbungsverfahren, wie im Manuskript beschrieben.
Hauptergebnisse
- Die Exposition gegenüber Bleiacetat führte zu beobachtbaren Veränderungen der Knochenmasse.
- Die Färbemethode lieferte eine dauerhafte Dokumentation skelettaler Veränderungen.
- Die Ergebnisse stützen die Verwendung von Zebrafischen als Modell zur Untersuchung von Osteoporose.
- Die Methodik ermöglicht die Untersuchung weiterer gefährlicher Toxine.
Schlussfolgerungen
- Die Alizarinrot-Färbung eignet sich zur Beurteilung der Knochentoxizität bei Zebrafischen.
- Die Studie unterstreicht das Potenzial des Zebrafisches in der toxikologischen Forschung.
- Zukünftige Untersuchungen können die Wirkungen verschiedener Toxikantien auf die Knochengesundheit weiter vertiefen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht den frühen Nachweis chemisch induzierter Knochenverluste bei Zebrafischembryonen und unterstützt die mechanistische Risikominderung in der Toxikologie sowie die Zielvalidierung für Signalwege der Skelettgesundheit. Durch die Quantifizierung von Veränderungen im mineralisierten Gewebe mittels Alizarinrot-Färbung liefert sie einen reproduzierbaren, dosisabhängigen Endpunkt zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die Knochenmineralisierung. Der Ansatz trägt zur prädiktiven Sicherheit bei der Leitstruktur-Optimierung und der präklinischen Sicherheitsprüfung von knochenwirksamen Verbindungen bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen im Zusammenhang mit der Knochenmineralisierung und der Integrität des Skeletts.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem er eine dauerhafte, quantifizierbare Aufzeichnung skelettaler Veränderungen über verschiedene Proben hinweg bereitstellt.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem er bereits früh im Entdeckungsprozess Verbindungen mit dosisabhängigen Effekten auf die Knochenmasse identifiziert.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative, schwellenbasierte Messungen des angefärbten Bereichs für einen objektiven Vergleich zwischen Behandlungsgruppen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung und Bildgebungsprotokolle, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Mehrfach-Well-Formaten sicherzustellen.
- Eignung für Assays: Erzeugt digitale Ausgaben, die mit der ImageJ-Analyse kompatibel sind, und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening von Knochentoxizitätsphänotypen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Modelliert für den Menschen relevante skelettale Reaktionen auf Toxikantien und unterstützt die translationale Abstimmung von Biomarkern für Knochenschwund.
- Operativer Wert: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Arbeitsabläufe, indem es einen konservierten, auf Wirbeltieren basierenden Test für die Knochenmineralisierung bereitstellt.
- Risikominderung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem es Signale für Knochenschwund vor Studien an Säugetieren erfasst.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Sicherheitsbewertung, insbesondere für Verbindungen mit potenziellen Off-Target-Effekten auf das Skelettsystem.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der Wirkung chemischer Substanzen auf die Knochenentwicklung und Mineralisierungspfade in einem Wirbeltiermodell.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung von Assays und quantitative Auswertungen zur Detektion dosisabhängiger Veränderungen der angefärbten Fläche.
- Analytik: Bietet kalibrierte, schwellenwertbasierte Flächenmessungen, die einen statistischen Vergleich der Knochenmineralisierung unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Forschung, indem konservierte Skelettreaktionen auf Toxikantien in Zebrafischarven modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zum Screening diverser chemischer Bibliotheken hinsichtlich ihrer Knochentoxizitätsgefährdung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in knochenbezogenen Signalwegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Fixierungs-, Färbungs- und digitale Quantifizierungsschritte.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, quantitative Hinweise auf Knochenverlust-Risiken bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem skelettale Toxizitätsrisiken vor erheblichen Investitionen identifiziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, in Histologie sowie in fluoreszenz- und farbmetrischer Bildgebung.
- Benötigt eine standardisierte Quantifizierung mittels Stereomikroskopie und Bildanalyse-Software (z. B. ImageJ).
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei Färbeprotokollen und Schwellenwerten voraus, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere Modellsysteme oder chemische Substanzklassen übertragen wird, die über Bleiacetat hinausgehen.
- Ist durch den notwendigen Pigmententfernungsschritt und die Hintergrundaufhellung begrenzt, um eine genaue Signalerfassung sicherzustellen.
