Name: Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Lernen Sie die Affinitätsreinigung von Drosophila-TRP-Kanälen aus Fliegenköpfen. Diese Methode nutzt den INAD-Proteinkomplex und Nickelperlen für elektrophysiologische und strukturelle Studien.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) und der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Nr. 2021A1515010796) an W. L. unterstützt. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

1. Reinigung von GST-markierten TRP- und His-markierten NORPA-Fragmenten
<ol><li>Reinigen Sie das TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Tag<ol>
<li>Wandeln Sie das pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 Plasmid 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.</li>
		<li>Nachdem die optische Dichte (OD600) der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.</li>
		<li>Nach Überexpression 1 l kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 × g für 20 min pelletieren und in 40 ml phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) Puffer resuspendieren.</li>
		<li>Laden Sie die resuspendierten Zellen in einen bei 4 °C vorgekühlten Hochdruckhomogenisator. Erhöhen Sie den Homogenisatordruck langsam auf 800 bar. Öffnen Sie den Einlasshahn und lassen Sie die resuspendierten Zellen kreisförmig durch ein Ventil mit sehr schmalen Schlitzen gehen. HINWEIS: Die Zellen werden durch die hohen Scherkräfte, die durch einen großen Druckabfall und Kavitation verursacht werden, homogenisiert.</li>
		<li>Laden Sie 5 ml Glutathionperlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie die Perlen insgesamt dreimal mit 50 ml PBS-Puffer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Den Überstand des zentrifugierten Zelllysats (40 ml) zu den ausgleichenden Glutathionperlen in der Schwerkraftsäule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Glutathionperlen alle 10 Minuten aus.</li>
		<li>Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Verwerfen Sie den Durchflussbruch. Spülen Sie die restlichen Glutathionperlen zweimal mit 50 ml PBS-Puffer ab.</li>
		<li>Fügen Sie 15 ml Elutionspuffer zu den Glutathionperlen hinzu und inkubieren Sie für 30 min. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.</li>
		<li>Nach 30 min Inkubation eluieren Sie das GST-markierte TRP 1261-1275-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr und beladen Sie es in einer Größenausschlusssäule (Präparationsgrad), die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) Puffer ausgeglichen wird.</li>
		<li>Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie die eluierten Proteine mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.</li>
		<li>Konzentrieren Sie das gereinigte TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Kennzeichnung von der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15 ml Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer Kühlzentrifuge auf dem Schreibtisch.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des GST-markierten TRP 1261-1275-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt 1 L Kultur von GST-markiertem TRP 1261-1275 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 1 zu entnehmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung des NORPA 863-1095 Fragments mit seinen Tags<ol>
<li>Wandeln Sie das pETM.3C NORPA 863-1095 Plasmid20 in E. coli BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml LB-Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.</li>
		<li>Nachdem der OD600 der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM IPTG (Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.</li>
		<li>Nach der Überexpression pelletieren Sie 1 L kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 x g für 20 min und resuspendieren Sie in 40 ml Bindungspuffer. Als nächstes werden die resuspendierten Zellen in einem Hochdruckhomogenisator bei 4 °C gelyst, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.</li>
		<li>Laden Sie 5 ml Ni-Perlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml Bindungspuffer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Fügen Sie den Überstand des zentrifugierten Zelllysats zu den gleichgestellten Ni-Beads in der Schwerkraftsäule hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei 4 °C. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.</li>
		<li>Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Entsorgen Sie die Durchflussfraktion und waschen Sie die verbleibenden Ni-Perlen zweimal mit 50 ml Waschpuffer.</li>
		<li>15 ml Elutionspuffer zu den Ni-Beads geben und 30 min inkubieren. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.</li>
		<li>Nach 30 Minuten Inkubation das eluierte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr sammeln und in eine Größenausschlusssäule (Präparationsgrad) laden, die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) ausgeglichen wird.</li>
		<li>Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie das eluierte Protein mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.</li>
		<li>Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.</li>
		<li>Konzentrieren Sie das gereinigte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment aus der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer gekühlten Tischzentrifuge.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt die 1-L-Kultur des His-markierten NORPA 863-1095-Fragments 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 2 zu entnehmen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung von Drosophila-Köpfen
<ol><li>Sammeln Sie erwachsene Fliegen in konischen 50-ml-Zentrifugationsröhrchen mit der CO 2-Anästhesiemethode22,23; sofort in flüssigem Stickstoff für 10 min einfrieren und in einem -80°C Gefrierschrank lagern.</li>
	<li>Nachdem Sie eine ausreichende Anzahl von Fliegen gesammelt haben, schütteln Sie die gefrorenen 50 ml konischen Schläuche von Hand kräftig, um die Beine, Köpfe, Flügel und Körper der Fliegen zu trennen. Die Mischung auf drei nacheinander gestapelte vorgekühlte Edelstahlsiebe (jeweils 20/30/40 Maschen) geben und die Siebe schütteln.</li>
	<li>Da die Köpfe das 40-Mesh-Sieb nicht passieren können, streichen Sie die Fliegenköpfe mit einer Bürste vom 40-Mesh-Sieb, übertragen Sie sie in konische 50-ml-Rohre und lagern Sie sie bei -80 ° C.</li>
	<li>Sammeln Sie die Fliegen und ihre Köpfe kontinuierlich ein und lagern Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank, bis sie die erforderliche Menge für das Experimentieren (0,5 g) erreichen. Um 0,5 g Köpfe zu sammeln, werden typischerweise 35 ml Fliegen in einem 50 ml konischen Schlauch benötigt. Die benötigten Materialien sind Tabelle 3 zu entnehmen.</li>
</ol>3. Drosophila TRP-Kanalreinigung
<ol><li>Insgesamt 0,5 g Köpfe wiegen und mit einem vorgekühlten Mörserstößel vollständig in flüssigem Stickstoff homogenisieren. Die homogenisierten Köpfe werden in einem 10x V/W-Lysepuffer (5 ml) aufgelöst, in einem Shaker bei 4 °C für 20 min inkubiert und dann bei 20.817 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Sammeln Sie den Spin-down-Überstand ("20817 g S", Abbildung 4) und zentrifugieren Sie ihn bei 100.000 x g für 60 min bei 4 °C. Verwenden Sie den Spin-down-Überstand ("100.000 g S", Abbildung 4) für den folgenden Pulldown-Assay.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml Ni-Perlen in die Schwerkraftsäule und waschen Sie die Perlen mit 10 ml doppelt destilliertem H 2 O (ddH2O) bei 4 ° Cfür insgesamt drei Mal. Die Perlen mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer dreimal bei 4 °C ausgleichen.</li>
	<li>500 μL 600 μM gereinigtes His-markiertes NORPA 863-1095 Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Säule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.</li>
	<li>Öffnen Sie den Säulenauslasshahn, um die Perlen und den Durchflussanteil zu trennen. Nehmen Sie den Durchflussanteil für die SDS-PAGE-Analyse (NORPA F, Abbildung 4). In diesem Abschnitt werden die Köderproteine auf den Ni-Perlen immobilisiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und bewahren Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 1, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und bewahren Sie die Probe für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 2, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die überschüssigen Köderproteine auf den Ni-Perlen entfernt.</li>
	<li>Fügen Sie den Überstand des Drosophila-Kopfhomogenats nach 100.000 x g Zentrifugation in die Ni-Säule bei 4 °C hinzu, wo das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment immobilisiert wurde.</li>
	<li>Den Überstand mit den Ni-Perlen bei 4 °C für 30 min inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf. Öffnen Sie dann den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Drokopflyse F, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die INAD-Proteinkomplexe (INAD/TRP/ePKC) in den Kopfhomogenaten von den immobilisierten NORPA 863-1095-Fragmenten auf den Ni-Perlen eingefangen.</li>
	<li>Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und halten Sie den Überstand aus Schwerkraftniederschlag für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 3, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 4, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die ungebundenen Proteine auf den Ni-Perlen entfernt.</li>
	<li>500 μL 600 μM GST-markiertes TRP 1261-1275-Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Perlen geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.</li>
	<li>Sammeln Sie den eluierten Anteil aus der Schwerkraftsäule (TRP E1, Abbildung 4B), die den endogenen Drosophila TRP-Kanal enthält. Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (TRP E2, Abbildung 4B). In diesem Schritt werden unter Verwendung der GST-getaggten TRP 1261-1275-Fragmente als Konkurrenten die TRP-Kanäle aus den eingefangenen INAD-Proteinkomplexen (INAD/TRP/ePKC) auf den Ni-Perlen eluiert.</li>
	<li>Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Bindungspuffer (10 ml; Tabelle 1) bei 4 °C und sammeln Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 5, Abbildung 4B).</li>
	<li>500 μL Elutionspuffer (Tabelle 1) in die Ni-Beads geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Sammeln Sie den Elutionsanteil aus der Schwerkraftflusssäule (NORPA E1, Abbildung 4B). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (NORPA E2, Abbildung 4B).</li>
	<li>Mit dem Elutionspuffer das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment zusammen mit den INAD/ePKC-Proteinkomplexen eluieren. Als nächstes suspendieren Sie die Ni-Beads in 500 μL Bindungspuffer.</li>
	<li>Nehmen Sie die resuspendierten Ni-Perlen, um die SDS-PAGE (gefärbt durch Coomassie blue R250) auszuführen, um die Effizienz der Elution zu analysieren und zu bewerten, ob der Elutionspuffer funktioniert (Perlen, Abbildung 4B). Die benötigten Materialien sind Tabelle 4 zu entnehmen.</li>
</ol>4. Größenausschlusssäulenreinigung des Drosophila TRP-Kanals
<ol><li>Installieren Sie eine Größenausschlusssäule (analytische Qualität) auf dem Proteinreinigungssystem. Ausgleich der Säule mit dem Säulenpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), der durch einen 0,45 μm Filter gefiltert wird.</li>
	<li>Konzentrieren Sie die TRP E1- und E2-Fraktion aus Schritt 3.14 mit einer 4-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird.</li>
	<li>Spülen Sie die Probenschleife mit dem Spaltenpuffer und laden Sie die Probe in die Probenschleife. Injizieren Sie die Probe in die Größenausschlusssäule und eluieren Sie die Proteine mit einer geeigneten Durchflussrate (0,5 ml/min).</li>
	<li>Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins durch Absorption bei 280 nm und lassen Sie ein SDS-PAGE-Gel laufen, um den gereinigten endogenen Drosophila-TRP-Kanal nachzuweisen (Abbildung 5). Die benötigten Materialien sind Tabelle 5 zu entnehmen.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
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<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
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<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

INAD, das fünf PDZ-Domänen enthält, ist der Hauptorganisator der Drosophila-Fototransduktionsmaschinerie. Frühere Studien zeigten, dass INAD PDZ3 mit exquisiter Spezifität (KD = 0,3 μM) an den TRP-Kanal C-Terminal Tail bindet18. Das INAD PDZ45 Tandem interagiert mit NORPA 863-1095 Fragment mit extrem hoher Bindungsaffinität (KD = 30 nM). Diese Ergebnisse liefern eine solide biochemische Grundlage für die Entwicklung der Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie,...

Phototransduktion ist ein Prozess, bei dem absorbierte Photonen in elektrische Codes von Neuronen umgewandelt werden. Es leitet ausschließlich Opsine und die folgende G-Protein-gekoppelte Signalkaskade sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen weiter. In Drosophila organisiert das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) unter Verwendung seiner fünf PDZ-Domänen einen supramolekularen Signalkomplex, der aus einem transienten Rezeptorpotential (TRP)-Kanal, Phospholipase Cβ/No-Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA) und einer augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC)1 besteht. Die Bildung dieses supramolekularen Signalkomplexes garantiert die korrekte subzelluläre Lokalisation, hohe Effizienz und Spezifität der Drosophila-Phototransduktionsmaschinerie. In diesem komplexen Komplex wirken lichtempfindliche TRP-Kanäle als nachgeschaltete Effektoren von NORPA und vermitteln den Kalziumeinstrom und die Depolarisation von Photorezeptoren. Frühere Studien zeigten, dass die Öffnung des Drosophila TRP-Kanals durch Protonen, Störung der lokalen Lipidumgebung oder mechanische Kraft 2,3,4 vermittelt wird. Der Drosophila TRP-Kanal interagiert auch mit Calmodulin5 und wird durch Calcium sowohl durch positive als auch durch negative Rückkopplung 6,7,8 moduliert.
Bisher basierten elektrophysiologische Studien über den Gating-Mechanismus von Drosophila TRP und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen auf ausgeschnittenen Membranpflastern, Ganzzellaufzeichnungen von dissoziierten Wildtyp-Drosophila-Photorezeptoren und heteroexprimierten Kanälen in S2-, SF9- oder HEK-Zellen 2,9,10,11,12,13, aber nicht auf gereinigten Kanälen. Die Strukturinformationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge bleiben ebenfalls unklar. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigtem Protein in einer rekonstituierten Membranumgebung zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu gewinnen, ist die Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge der notwendige erste Schritt, ähnlich den Methoden, die in den TRP-Kanalstudien von Säugetieren verwendet werden 14,15,16,17.
Kürzlich wurde auf der Grundlage des Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes18,19,20 erstmals eine Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den TRP-Kanal von Drosophila-Kopfhomogenaten durch Streptavidin-Perlen5 zu reinigen. In Anbetracht der geringen Kapazität und der teuren Kosten von Streptavidin-Perlen wird hier ein verbessertes Reinigungsprotokoll eingeführt, das His-getaggtes Köderprotein und entsprechende kostengünstige Ni-Perlen mit viel höherer Kapazität verwendet. Die vorgeschlagene Methode wird dazu beitragen, den Gating-Mechanismus des TRP-Kanals aus strukturellen Winkeln zu untersuchen und die elektrophysiologischen Eigenschaften des TRP-Kanals mit gereinigten Proteinen zu messen.

<table><tbody><tr><td>Bacterial stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competent Cells</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Proteinüberexpression</td></tr><tr><td>Experimentmodelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 Stamm</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila head Vorbereitung</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 mesh Edelstahlsiebe</td><td>Jiufeng Metallgitter Firma</td><td>GB/T6003.1</td><td>Drosophila head Zubereitung</td></tr><tr><td>30% Acrylamid-N,N&prime;-Methylenbisacrylamid (29:1)</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE Gelvorbereitung</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE Gelpräparation</td></tr><tr><td>Cocktail-Proteasehemmer</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Proteasehemmer</td></tr><tr><td>Coomassie brilliant blue R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE Gelfärbung</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Präparation</td></tr> <tr><td>für GrößenausschlusssäulenpufferEthylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Legierungspufferpräparat mit Größenausschluss</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Glutathion-Sepharose 4 Fast Flow Kügelchen</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Elutionspuffer Vorbereitung für Ni-Säule</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Induktion der Proteinüberexpression</td></tr><tr><td>LB Bouillon Pulver</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. Zellkultur</td></tr><tr><td>L-Glutathion reduziert (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Elutionspuffer Vorbereitung für Glutathionkügelchen</td></tr><tr><td>Ni-Sepharose excel beads</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>N-Dodecyl beta-D-maltosid (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergens für die Proteinreinigung</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE Gelpräparation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Homogenisierungspuffer für E.coli.-</td></tr><tr><td>Zellen PMSF Lablead</td><td></td><td>P0754-25G</td><td>Proteaseinhibitor</td></tr><tr><td>Vorgefärbter Proteinmarker</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Leiter für vorgefärbte Proteinleiter</td></tr><tr><td>Größenausschlusssäule (Präparationsqualität)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 PG-Säule</td></tr><tr><td>Größenausschlusssäule (analytische Qualität)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Erhöhung 10/300 GL Säule</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Puffervorbereitung für Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE Gel/Puffer Vorbereitung</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Vorbereitung für Proteinreinigungspuffer</td></tr><tr><td>Ultrafiltration Spin Säule</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage of Drosophila head</td></tr><tr><td>Tischgekühlte Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge für konische 15-ml- und 50-ml-Zentrifugationsröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge für den Schreibtisch 1,5 mL Zentrifugationsröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Zentrifugation von Drosophila Kopflysat nach der Homogenisierung</td></tr><tr><td>Leere Schwerkraft-Durchflusssäule (Innendurchmesser = 1,0 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>TRP-Proteinreinigung</td></tr><tr><td>Leere Schwerkraft-Durchflusssäule (Innendurchmesser = 2,5 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Aufreinigung von Ködern und Konkurrenzproteinen aus E.coli.</td></tr><tr><td>Gel Dokumentationssystem</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td><td>SDS-PAGE Imaging</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Beckman-Schar</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Zentrifugation von E.coli. Zellen/Zelllysat</td></tr><tr><td>Hochdruck-Homogenisator</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogenisierung von E.coli. Zellen</td></tr><tr><td>Flüssigstickstofftank</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila head-Zubereitung</td></tr><tr><td>Proteinaufreinigungssystem</td><td>Cytiva</td><td>AKTA-Auffrischer</td><td>Proteinaufreinigung</td></tr><tr><td>Kühlschrank (-80 Grad; C)</td><td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Drosophila Kopfpräparation</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 Messung von E.coli. Zellen</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Bestimmung der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Schar</td><td>Optima XPN-100 Ultrazentrifuge</td><td>Ultrazentrifugation</td></tr></tbody></table>

reinigung von endogenen drosophila-transientenrezeptor-potentialkanälen

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

Die Drosophila-Phototransduktion ist einer der schnellsten bekannten G-Protein-gekoppelten Signalwege. Um die Spezifität und Effizienz dieser Kaskade zu gewährleisten, bindet der Calcium (Ca2+)-permeable Kationenkanal, das transiente Rezeptorpotential (TRP), fest an das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) und bildet einen großen Signalproteinkomplex mit augenspezifischer Proteinkinase C (ePKC) und Phospholipase Cβ/No Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA). Die biochemischen Eigenschaften des Drosophila TRP-Kanals bleiben jedoch unklar. Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Zuerst wurde das gereinigte Histidin (His)-markierte NORPA 863-1095-Fragment an Ni-Perlen gebunden und als Köder verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzuziehen. Dann wurde den Ni-Perlen ein übermäßig gereinigtes Glutathion-S-Transferase (GST)-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um mit dem TRP-Kanal zu konkurrieren. Schließlich wurde der TRP-Kanal im Überstand durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen TRP 1261-1275-Peptid getrennt. Diese Methode ermöglicht es, den Gating-Mechanismus des Drosophila TRP-Kanals sowohl aus biochemischer als auch aus struktureller Sicht zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten Drosophila TRP-Kanälen können auch in Zukunft gemessen werden.

In diesem Artikel wird eine Proteinreinigungsmethode zur Reinigung des endogenen Drosophila-TRP-Kanals demonstriert (Abbildung 1).
Zuerst werden rekombinante Proteinexpression und -reinigung angewendet, um die Köder- und Konkurrenzproteine zu erhalten. Dann wird ein GST-markiertes TRP 1261-1275-Fragment in E. coli BL21 (DE3)-Zellen in LB-Medium exprimiert und mit Glutathionkügelchen und einer Größenausschlusssäule gereinigt (...

Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.

Reinigung von endogenen Drosophila-Transientenrezeptor-Potentialkanälen

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

In diesem Protokoll demonstrieren wir den Reinigungsprozess zur Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge, was der notwendige erste Schritt ist, um elektrophysiologische Eigenschaften zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu erhalten. Basierend auf dem Probenahmemechanismus des INAD-Proteinkomplexes und unter Verwendung kostengünstiger Nickelkügelchen mit viel höherer Kapazität kann eine ausreichende Menge an TRP-Kanälen aus Fliegenköpfen gereinigt werden. Yuyang Liu, ein Techniker aus unserem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.Wandeln Sie zunächst das pGEX 4T-1 TRP 1261-1265-Plasmid in E.coli BL21-Zellen um, indem Sie die Calciumchlorid-Hitzeschock-Transformationsmethode verwenden. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 Milliliter Luria Bertani Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Die 10 Milliliter Aussaatkultur in einen Liter Luria Bertani Medium geben und bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nachdem die optische Dichte der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 Grad Celsius ab und fügen Sie 0,1 millimolar Isopropyl-beta-D-1-thiogalactopyranosid hinzu. Nach der Überexpression einen Liter kultivierte Zellen durch Zentrifugation pelletieren und in 40 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendieren. Laden Sie die resuspendierten Zellen in einen auf vier Grad Celsius vorgekühlten Hochdruckhomogenisator.Erhöhen Sie den Homogenisatordruck langsam auf 800 bar. Öffnen Sie die Einlasslasche und lassen Sie die resuspendierten Zellen kreisförmig durch ein Ventil mit schmalen Schlitzen gehen. Laden Sie fünf Milliliter Glutathionperlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie die Perlen mit 50 Millilitern phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer insgesamt dreimal.Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48, 384 mal G zentrifugieren.Etwa 40 Milliliter des Überstands des zentrifugierten Zelllysats zu den ausgleichenden Glutathionperlen in der Schwerkraftsäule geben und 30 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Suspendieren Sie die Glutathionperlen alle 10 Minuten. Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation die Säulenauslassregisterkarte, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen.Verwerfen Sie die Durchflussfraktion und spülen Sie die verbleibenden Glutathionperlen zweimal mit 50 Millilitern phosphatgepuffertem Kochsalzpuffer ab. Fügen Sie 15 Milliliter Elutionspuffer zu den Glutathionperlen hinzu und suspendieren Sie die Perlen alle 10 Minuten. Eluieren Sie das GST-getaggte TRP 1261-1275-Fragment in ein konisches 50-ml-Rohr und laden Sie es in eine Größenausschlusssäule.Sammeln Sie fünf Milliliter der eluierten Proteine pro Röhrchen und konzentrieren Sie die gereinigten Fragmente durch Zentrifugation in einer Ultrafiltrationsspinsäule in einer gekühlten Zentrifuge auf einen Milliliter. Um das mit His gekennzeichnete NORPA 863-1095-Fragment zu reinigen, befolgen Sie das zuvor demonstrierte Verfahren mit Nickelperlen. Sammeln Sie erwachsene Fliegen in konischen 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie 10 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein.Schütteln Sie die gefrorenen Röhrchen kräftig von Hand und geben Sie die Mischung auf drei nacheinander gestapelte, vorgekühlte Edelstahlsiebe. Schütteln Sie die Siebe und fegen Sie die Fliegenköpfe mit einer Bürste vom 40-Mesh-Sieb. Überführen Sie sie in fünf Milliliter konische Röhrchen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Homogenisieren Sie 0,5 Gramm Köpfe in flüssigem Stickstoff mit einem vorgekühlten Mörser und Stößel. Lösen Sie die homogenisierten Köpfe in fünf Milliliter 10-fachen Lysepuffers auf, gefolgt von einer Zentrifugation bei 20, 817 mal G bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Der Spin-Down-Überstand wird 60 Minuten lang 100.000 mal G bei vier Grad Celsius weiter zentrifugiert.Fügen Sie einen Milliliter Nickelperlen in die Schwerkraftflusssäule hinzu und waschen Sie die Perlen dreimal mit 10 Millilitern doppelt destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius. Gleichen Sie die Perlen mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer aus, dreimal bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 500 Mikroliter 600 mikromolar gereinigtes His-markiertes NORPA 863-1095-Protein in die Nickelsäule hinzu und inkubieren Sie die Säule.Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten aus. Öffnen Sie den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen, und waschen Sie die Nickelperlen mit 10 Millilitern kaltem Lysepuffer. Dann fügen Sie einen kalten Überstand des Drosophila-Kopfhomogenats in die Nickelsäule hinzu.Nach der Inkubation waschen Sie die Perlen mit 10 Milliliter Lysepuffer und fügen Sie 500 Mikroliter 600 mikromolar GST-markiertes TRP 1261-1275-Protein in die Perlen hinzu. Sammeln Sie den eluierten Anteil aus der Schwerkraftsäule. Waschen Sie die Nickelperlen mit 10 Millilitern Bindepuffer.Fügen Sie dann einen Elutionspuffer hinzu und sammeln Sie den Elutionsanteil aus der Schwerkraftflusssäule. Konzentrieren Sie die aus der Drosophila TRP-Kanalreinigung eluierten Fraktionen mit einer Vier-Milliliter-Ultrafiltrationsspinsäule. Injizieren Sie die Probe in die Größenausschlussspalte und eluieren Sie die Proteine mit einer angemessenen Durchflussrate.Das mit GST gekennzeichnete TRP 1261-1275-Fragment wurde in E.coli-Zellen exprimiert und mit Glutathionperlen und einer Größenausschlusssäule gereinigt. In ähnlicher Weise wurde das mit His markierte NORPA 863-1095-Fragment mit Nickelperlen und Größenausschlusssäule exprimiert und gereinigt. Der eluierte TRP-Kanal ist durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen GST-markierten TRP 1261-1275-Peptid getrennt.Als Nebenprodukt werden die INAD-, ePKC- und NORPA 863-1095-Komplexe nach TRP 1261-1275-Peptidkonkurrenz erhalten. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist, die Fliegenköpfe in flüssigem Stickstoff zu homogenisieren und das Homogenat in einem Puffer aufzulösen, der ein Reinigungsmittel namens DDM enthält. Nach diesem Verfahren können wir auch den gesamten INAD-Proteinkomplex reinigen, mit dem seine Montage- und Regulationsmechanismen untersucht werden können.Eine mögliche zukünftige Anwendung dieser Methode wird darin bestehen, die Strukturinformation des endogenen Drosophila-TRP-Kanals unter Verwendung von Kryo-EM-Techniken zu untersuchen. Darüber hinaus ist auch die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten endogenen Drosophila TRP-Kanälen in künstlicher Doppelschichtlipidmembran möglich.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Bei diesem Verfahren wird ein blaues Licht aktiviert Algen Kanal-und Zell-spezifische genetische Expression Tools zur synaptischen Potentiale mit Lichtimpulsen evozieren an der neuromuskulären Synapse (NMJ)...

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