Name: Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die bakterielle Expression und Affinitätschromatographie der humanen MMP-3 in E. coli. Diese Methode liefert lösliches, aktives Protein für therapeutische Anwendungen und MMP-Inhibitor-Entwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten Dr. Evette Radisky und Alexandra Hockla von der Mayo Clinic in Jacksonville, Florida, für die Bereitstellung des pET-3a-pro-MMP-3cd-Plasmids als Vorlage für die Klonierung des Hisx6pro-MMP-3cd-Gens und ihre Kommentare sowie Dr. Paul Hartley vom Nevada Genomics Center an der University of Nevada, Reno, für die DNA-Sequenzierung danken. Die Autoren möchten auch Cassandra Hergenrader dafür danken, dass sie bei einem Teil der Proteinexpression geholfen hat. M.R.-S. möchte dem NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience Grant und dem UNR R&D mICRO SEED Grant Award danken.

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die großtechnische Produktion von löslichen, humanen, rekombinanten MMPs bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe. Säugetierzellen können funktionelle MMPs mit hohen Kosten und langen Wartezeiten exprimieren, während E. coli schnell hohe Mengen an MMP-Einschlusskörpern produzieren, die gereinigt und wieder gefaltet werden müssen11,16. R2DP-Zellen erhöhen die Ausbeute von MMP-Einschlusskörpern signifikant und ermöglichen einen kostengünstigeren und produktivere...

Die meisten komplexen eukaryotischen Proteine durchlaufen nach der Expression ausgeklügelte posttranslationale Modifikationen, die eine hochunterstützte Proteinfaltung und Co-Faktoren erfordern, um funktionsfähig zu sein1. Die Herstellung großer Mengen löslichen menschlichen Proteins in einem bakteriellen Wirt bleibt aufgrund der hohen Kosten und des Mangels an robusten Expressions- und Reinigungsmethoden eine erhebliche Herausforderung, selbst für kleinere Laborexperimente2,3. MMPs, humane Endopeptidasen mit großem Molekulargewicht, werden normalerweise als unlösliche Einschlusskörper exprimiert, wenn sie in E. coli exprimiert werden. Die Extraktion von löslichen humanen MMPs führt oft zu einem mühsamen, zeitaufwändigen Solubilisierungs- und Umfaltungsprozess4.
MMPs spielen eine entscheidende Rolle sowohl in physiologischen als auch in pathogenen Prozessen. Humane MMPs sind eine Familie von 23 Zink-Endopeptidasen, kategorisiert nach Struktur- und Substratspezifität und differentiell exprimiert trotz einer hochkonservierten katalytischen Domäne5,6. MMPs werden als inaktive Zymogene sezerniert, reguliert durch posttranslationale Aktivierung und ihre endogenen Inhibitoren, Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs)7,8,9,10. Obwohl MMPs ursprünglich für ihre Rolle beim ECM-Umsatz anerkannt waren, waren sie auch an der Entwicklung, Morphogenese, Gewebereparatur und -umgestaltung beteiligt8. Die Dysregulation von MMPs wurde unter anderem mit Krebs sowie neurodegenerativen, kardiovaskulären und fibrotischen Erkrankungen in Verbindung gebracht5,7.
Die Entwicklung robuster MMP-Produktionsmethoden im großen Maßstab ist entscheidend, um den Erfolg zukünftiger Studien von MMP-Mechanismen durch biochemische und zellbasierte Assays sicherzustellen. Verschiedene MMPs wurden zuvor in Bakterien exprimiert11, einschließlich Hisx6-markierter MMPs, ohne die MMP-Aktivität zu verändern12,13,14,15. Diese Methoden umfassen jedoch mühsame, lange Schritte, die möglicherweise schwer zu replizieren sind.
Säugetierzellen können auch verwendet werden, um viele verschiedene menschliche Proteine zu exprimieren und gleichzeitig die richtigen posttranslationalen Modifikationen zu gewährleisten16. Obwohl das Expressionssystem für Säugetiere eine ideale Wahl ist, um rekombinante menschliche Proteine mit geeigneten posttranslationalen Modifikationen herzustellen, sind die Hauptnachteile dieser Methode anfänglich niedrige Ausbeuten, kostspielige Wachstumsmedien und Reagenzien, lange Zeiträume zum Erreichen stabiler Mimiklinien und das Risiko einer Kontamination mit anderen Spezies wie Pilzen oder Bakterien2,11 . Darüber hinaus führt die MMP-Produktion in Zelllinien von Säugetieren zu Verunreinigungen aus assoziierten zellulären Proteinen wie TIMPs oder Fibronektinen11. Im Gegensatz zu dem langsamen Zellwachstum, das in Säugetierzellen beobachtet wird, bietet das bakterielle Expressionssystem eine groß angelegte Proteinproduktion in kurzer Zeit sowie einfachere Medien- und Wachstumsanforderungen. Aufgrund des Fehlens anderer assoziierter zellulärer Proteine (d. h. TIMPs) in bakteriellen Expressionssystemen unterliegen aktive MMPs in höheren Konzentrationen jedoch dem Abbau durch Autoproteolyse, was zu einer schlechten MMP-Ausbeute führt17.
Dieses Papier beschreibt eine detaillierte Methode zur bakteriellen Expression, Reinigung und Aktivierung von rekombinantem Hisx6-pro-MMP-3cd unter Verwendung von E. coli als Ausdruckshost aufgrund seiner Erschwinglichkeit, Einfachheit und seines Erfolgs bei der Erzeugung höherer Ausbeuten von MMPs2,3,18. Da E. coli nicht über die Proteinfaltungsmaschinerie und die posttranslationale Verarbeitung verfügt, die für rekombinante MMPs und andere komplexe Proteine erforderlich sind, wurden viele E. coli-Stämme entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, was E. coli zu einem geeigneteren Wirt für die Expression von rekombinantem humanem MMP-3cd macht,19,20 . Zum Beispiel verbessert der in dieser Studie verwendete R2DP-Stamm die eukaryotische Expression, indem er ein chloramphenicolresistentes Plasmid liefert, das Codons enthält, die selten in E. coli verwendet werden.
Wie in diesem Protokoll beschrieben, werden nach Überexpression von relativ reinen Einschlusskörpern aus dem pET-3a-Vektor (Abbildung 1) in R2DP-Zellen Hisx6-pro-MMP-3-Proteine (MMP-3cd) extrahiert und denaturiert4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 wurde mittels Affinitäts-Tag-Chromatographie gereinigt. Nach der Rückfaltung und Dialyse wurde das Pro-MMP-3cd (Zymogen) durch 4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA) aktiviert, und die SDS-PAGE-Analyse wird verwendet, um die Ausbeuten und die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung zu bewerten5,21. Dieses Protokoll beschreibt als Beispiel den Ausdruck, die Reinigung und die Aktivierung von löslichem MMP-3cd. Es kann jedoch auch als Leitfaden für die Expression anderer MMPs und menschlicher Proteasen mit ähnlicher Expression und Aktivierungsmechanismen verwendet werden (Abbildung 2). Für andere Proteine als MMP-3cd wird dem Leser empfohlen, optimale Pufferzusammensetzungen und -methoden für sein Zielprotein zu bestimmen, bevor er dieses Protokoll versucht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> Abbildung 1: Plasmidabbildung des pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmids. Der pET-3a-Vektor enthält ein Ampicillin-Resistenz-Gen. Eine N-terminale Hisx6-Tag-Sequenz wird in den pET-3a-basierten Vektor, einschließlich pro-MMP-3cd, geklont, um das pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Konstrukt unter Kontrolle des T7-Promotors zwischen BamHI- und NdeI-Restriktionssites zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> Abbildung 2: Bakterielle Expression von Pro-MMP-3cd, Reinigung, Rückfaltung und Aktivierung . 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd-Plasmid wurde in BL21(DE3)- oder R2DP-Zellen umgewandelt. 1.2: Die Pro-MMP-3cd-Proteinexpression wurde mittels IPTG induziert. 1.3: Chemische Lyse und Beschallung werden verwendet, um Hisx6-pro-MMP-3cd-Proteine zu extrahieren, die hauptsächlich unlöslich sind und in den Einschlusskörpern vorkommen. Harnstoff wurde verwendet, um Protein aus Einschlusskörpern zu denaturieren und zu lösen. 2.1. Das denaturierte Hisx6-pro-MMP-3cd-Protein wurde durch affinitätschromatographische Reinigung gereinigt. 3. Die eluierte Hisx6-pro-MMP-3cd wurde während der Dialyse durch allmähliche Entfernung von Harnstoff aus dem Puffer langsam wieder gefaltet. 4. Schließlich wurde das gefaltete MMP-3cd-Protein mit APMA aktiviert, indem die N-terminale Pro-Peptid-Domäne entfernt wurde. APMA wird später durch Entsalzen aus der Lösung entfernt. Die Zahlen entsprechen den Protokollabschnitten, die diese Schritte beschreiben. Abkürzungen: MMP-3cd = Matrix-Metalloproteinase-3-katalytische Domäne; APMA = 4-Aminophenylquecksilberacetat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Sterilfilter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLGP033RS</td><td>Wird verwendet, um einige Verunreinigungen aus dem Proteinextrakt vor der Reinigung zu entfernen und zu verhindern, dass die Ni-NTA-Säule verstopft</td></tr><tr><td>1 L Erlenmeyerkolben</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S76106F</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1 L Glasflaschen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td>n/a</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td>n/a</td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 G, 1 Zoll abgeschrägte Nadel</td><td>Amazon</td><td>B07S7VBHM2</td><td>Wird in Kombination mit der Dialysekassette</td></tr><tr><td>verwendet 2 mL Entsalzungssäule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td>Entfernt APMA nach Aktivierung</td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1610422</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Konische Flaschenkissen für 250 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53A</td><td>Stabilisieren Sie konische Flaschen bei der Zentrifugation mit großen Volumina</td></tr><tr><td>250 mL konische Flaschen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-538-53</td><td>n/a</td></tr><tr><td>400 mL Rührzellen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFSC40001</td><td>Konzentriert ein viel größeres Volumen als die Zentrifugalfiltereinheit. Rosetta2(DE3)pLysS-Zellen produzieren große Mengen an Proteinen, die den Grenzwert von 15 ml der Zentrifugalfiltereinheit überschreiten können</td></tr><tr><td>4-Aminophenylquecksilberacetat (APMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9563-5G</td><td>Aktiviert MMP-3 durch Spaltung der Propeptid-5-ml-Spritze</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0829167</td><td>Wird in Kombination mit der Dialysekassette</td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td> <td>verwendetWird zur Lagerung in vielen Aufreinigungsschritten verwendet</td></tr><tr><td>50-ml-Rekonzentrationsröhrchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFC901024D</td><td>Wird zur Rekonzentration von Proteinproben nach der Dialyse oder zur Entfernung von Verunreinigungen verwendet</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td>Pufferbestandteil, der autoklavierte LB-Medien beim Abkühlen verfestigt</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>Antibiotikum, das mit dem pET3a-Vektor verwendet wird; Verwendet bei 100 &Micro; g/ml in LB-Medien</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>Restriktionsenzym zur Verwendung mit dem pET3a-Vektor</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>600-30-23</td><td>Das Calcium-Ion stabilisiert die MMP-Struktur</td></tr><tr><td>Zellspreader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-189-7544</td><td>Kann verwendet werden, um Zellen nach der Transformation</td></tr> <tr><td>über eine Petrischale zu verteilenChloramphenicol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-055-125GM</td><td>Antibiotikum verwendet mit pET3a-Vektor; verwendet bei 34 & Mikro; g/mL in LB-Medien</td></tr><tr><td>Dialysepuffer 1</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &micro; M ZnCl2, 4 M Harnstoff.</td></tr><tr><td>Dialysepuffer 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 &micro; M ZnCl2, 2 M Harnstoff.</td></tr><tr><td>Dialysepuffer 3</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 & micro; M ZnCl2.</td></tr><tr><td>Dialyse-Clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68011</td><td>Wird in Kombination mit Dialyseschläuchen aus Schlangenhaut</td></tr><tr><td>verwendet Dialyseschlauch</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88243</td><td>Alternative Dialysemethode, die viel größere Probenvolumina fasst, aber ein höheres Risiko von Probenverlusten</td></tr> aufweist <tr><td>Aufschlusspuffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>Puffer zur Verdauung des pET3a-Vektors</td></tr><tr><td>Einweg-Küvetten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-200-257</td><td>Zur Messung der Bakterienkultur-OD während des Wachstums und der Expression</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific D107125G</td><td></td><td>Unterstützt die Denaturierung von Proteinen durch Reduzierung von Disulfidbindungen</td></tr><tr><td>DNA-Assemblierungsmischung</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td>Wird verwendet, um das Hisx6-pro-MMP-3cd-PCR-Produkt und den verdauten pET3a-Vektor</td></tr><tr><td>DNase I NEB</td><td></td><td>M0303S</td> <td>zu ligierenEndonuklease zum Abbau ungünstiger DNA-Verunreinigungen, die später die Proteinreinigung beeinträchtigen könnten</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J15694-AE</td><td>Wird bei der Denaturierung verwendet. Verhindert die Oxidation und die anschließende Bildung von Disulfidbindungen</td></tr><tr><td>Gel-Rückgewinnungskit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Isoliert und reinigt DNA aus Agarose-Gelen</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>Wird zur Herstellung von Glycerin-Aktien verwendet, die bei -80 & Grad eingefroren werden; C</td></tr><tr><td>Schwerkraft-Flow-Säule</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>Wird für die Ni-NTA-Aufreinigung von rekombinanten His-markierten Proteinen verwendet</td></tr> Zellen <tr><td>mit hoher Transformationseffizienz</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>Zellen mit hoher Transformationseffizienz mit größerer Erfolgschance bei der Klonierung des N-terminalen His-Tags in das pET3a-pro-MMP-3cd-Konstrukt</td></tr><tr><td>HT-Elutionspuffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M Harnstoff, 250 mM Imidazol. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4</td></tr><tr><td>HT Äquilibrierungspuffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M Harnstoff ein. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4</td></tr><tr><td>HT Regenerationspuffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM MES, 0,1 M NaCl ein. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,0</td></tr><tr><td>HT Wash Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 6 M Harnstoff, 25 mM Imidazol ein. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td> <td>einThermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td>Wird verwendet, um den pH-Wert</td></tr> von <tr><td>Imidazol</td> zu puffern <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA1022122</td><td>Ahmt die Histidin-Seitengruppe nach. Wird verwendet, um unspezifisch bindende Proteine vom his-markierten Zielprotein zu trennen</td></tr><tr><td>Inclusion Body Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0,5 M Harnstoff. pH-Wert auf 8,0 einstellen</td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td>Ein Reagenz, das die Zielgenexpression in pET3a induziert. 0,5 mL 1 M Aliquots herstellen, filtrieren, sterilisieren und bei -20 ° C lagern; C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR media</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Zum Einfüllen in eine 1-Liter-Flasche oder eine 1-Liter-Flasche. Für 1 L 25 g LB Brühe hinzufügen. Durch Autoklavieren sterilisieren. Einmal abgekühlt auf unter 50 °; C, fügen Sie Ampicillin zu 100 & Mikro hinzu; g/mL und Chloramphenicol bis 34 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR Platten</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Zum Abfüllen in sterile Petrischale. Gießen, bis der Deckel der Petrischale vollständig bedeckt ist. 1 L Medium ergibt 40-60 Platten. Für 1 L: 25 g LB Brühe, 16 g Agar. Durch Autoklavieren sterilisieren. Einmal abgekühlt auf unter 50 °; C, fügen Sie Ampicillin zu 100 & Mikro hinzu; g/mL und Chloramphenicol bis 34 &; Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>Vorgemischt mit Trypton, Hefeextrakt und Natriumchlorid</td></tr><tr><td>Lysepuffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,133 g/mL Lysozym, 0,49 % v/v Triton X-100. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0</td></tr><tr><td>ein Lysozyme</td><td>MP Biomedicals</td><td>195303</td><td>Wird bei der Proteinextraktion verwendet. Enzym, das bakterielle Zellwände lysiert</td></tr><tr><td>Miniprep-Kit</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Bei Erfolg extrahiert es das pET3a-pro-MMP-3cd-Konstrukt aus Transformanten</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>NEB</td><td>R0111S</td><td>Restriktionsenzym zur Verwendung mit dem pET3a-Vektor</td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI88221</td><td>Wird verwendet, um rekombinante His-markierte Proteine zu binden. Diese starke Wechselwirkung kann durch höhere Konzentrationen von Imidazol verdrängt werden</td></tr><tr><td>: Nichtionisches Tensid,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI28316</td><td>Storage Detergent, um die MMP-Aggregation zu verhindern. Minimiert Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Rückständen auf der MMP-Oberfläche und Wassermolekülen, ohne die katalytische Aktivität zu stören.</td></tr><tr><td>PCR-Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Ein PCR-Reagenz zum Einfügen eines N-terminalen His-Tags in den pET3a-pro-MMP-3cd-Vektor</td></tr><tr><td>pET-Plasmid</td><td>Addgen</td><td>n/a</td><td>Der pET3a-Vektor bietet Ampicillin-Resistenz, induzierbare Expression eines Zielgens und Sequenzierung mit T7-Primern</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>Wird zur Beschichtung von Transformanten auf LB-Agar-Medien</td></tr><tr><td>verwendet R2DP-Zellen</td><td>Novagen</td><td>714033</td><td>BL21-Derivate mit erhöhter Expression eukaryotischer Proteine. Enthält tRNAs von Codons, die sich in E. coli als selten erwiesen haben</td></tr><tr><td>SOC-Wachstumsmedien</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>Nicht-selektive Wachstumsmedien für schnelles Wachstum während der Transformation</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Wird in Puffern verwendet und hilft bei der Proteinstabilität</td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI89905</td><td>Detergens, das bei der Proteinextraktion verwendet wird. Lyse der Zellwände</td></tr><tr><td>Solubilisierungspuffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Harnstoff. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0</td></tr><tr><td>ein Tris-Base</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Gemeinsamer Puffer, der im physiologischen pH-Bereich verwendet wird. Temperaturempfindliches</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M1122980101</td><td>Reinigungsmittel für die Zelllyse</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ75826A7</td><td>Erstes chaotropes Mittel zur Unterbrechung der Proteinsekundärstruktur</td></tr><tr><td>Zinkchlorid (ZnCl2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAA162810E</td><td>Stabilisiert die MMP-Struktur. Das Zink-Ion befindet sich an der katalytischen Stelle von MMP-3</td></tr></tbody></table>

bakterielle expression und aufreinigung der humanen matrix-metalloproteinase-3 mittels affinitätschromatographie

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) gehören zur Familie der Metzincinproteasen mit zentralen Rollen beim Abbau und Remodeling der extrazellulären Matrix (ECM) sowie bei Wechselwirkungen mit mehreren Wachstumsfaktoren und Zytokinen. Die Überexpression spezifischer MMPs ist für verschiedene Krankheiten wie Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen verantwortlich. MMPs standen in letzter Zeit im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit als Ziele für die Entwicklung von Therapeutika, die Krankheiten behandeln können, die mit MMP-Überexpression korrelieren.
Um den MMP-Mechanismus in Lösung zu untersuchen, sind einfachere und robustere rekombinante Proteinexpressions- und Reinigungsmethoden für die Herstellung von aktiven, löslichen MMPs erforderlich. Der katalytische Bereich der meisten MMPs kann jedoch in Escherichia coli (E. coli) aufgrund fehlender posttranslationaler Mechanismen nicht in löslicher Form exprimiert werden, während Expressionssysteme für Säugetiere in der Regel teuer sind und geringere Erträge aufweisen. MMP-Einschlussgremien müssen den langwierigen und mühsamen Prozess der umfangreichen Reinigung und Wiederfaltung durchlaufen, wodurch die Ausbeute an MMPs in der nativen Konformation erheblich reduziert wird. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das Rosetta2 (DE3) pLysS-Zellen (im Folgenden als R2DP bezeichnet) verwendet, um eine katalytische Matrix-Metalloproteinase-3-Domäne (MMP-3cd) zu erzeugen, die einen N-terminalen His-Tag gefolgt von einer Pro-Domäne (Hisx6-pro-MMP-3cd) für die Verwendung in der Affinitätsreinigung enthält. R2DP-Zellen verstärken die Expression eukaryotischer Proteine durch ein Chloramphenicol-resistentes Plasmid, das Codons enthält, die normalerweise in bakteriellen Expressionssystemen selten sind. Im Vergleich zur traditionellen Zelllinie der Wahl für die rekombinante Proteinexpression, BL21(DE3), verbesserte die Aufreinigung mit diesem neuen Stamm die Ausbeute an gereinigtem Hisx6-pro-MMP-3cd. Nach der Aktivierung und Entsalzung wird die Pro-Domäne zusammen mit dem N-terminalen His-Tag gespalten, wodurch aktives MMP-3cd für den sofortigen Einsatz in unzähligen In-vitro-Anwendungen bereitgestellt wird. Diese Methode erfordert keine teure Ausrüstung oder komplexe Fusionsproteine und beschreibt die schnelle Produktion von rekombinanten menschlichen MMPs in Bakterien.

Wenn Proben auf SDS-PAGE ausgeführt werden, da das Protein in Form von unlöslichen Einschlusskörpern exprimiert wird, sollten die lysierten und beschallten Fraktionen wenig bis gar keinen Hisx6-pro-MMP-3cd-Extrakt enthalten, da das Protein noch nicht in Harnstoff resobilisiert wurde. Abbildung 3 vergleicht die His-tag-Reinigungselutionsfraktionen von Hisx6-pro-MMP-3cd aus BL21(DE3)-Zellen und R2DP-Zellen. Elution-Fraktionen wurden vor der Dialyse sowohl für BL21(DE3)- als auch für R2DP-Zelle...

His-Tag-Reinigung, Dialyse und Aktivierung werden eingesetzt, um die Ausbeute an löslicher, aktiver Matrix-Metalloproteinase-3-katalytischer Domänenproteinexpression in Bakterien zu erhöhen. Proteinfraktionen werden über SDS-PAGE-Gele analysiert.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

Dieses detaillierte Protokoll beschreibt eine hocheffiziente und kostengünstige Methode der bakteriellen Expression für die rekombinante MMP-3-katalytische Domäne in E.Coli, die auf andere MMP-therapeutische Ziele angewendet werden kann. E.coli fehlt ein komplexes Proteinfaltungs- und posttranslationales Verarbeitungssystem. Diese Methode verwendet den R2DP-Zellstamm, um die eukaryotische Proteinexpression in E.coli zu verbessern.Die Überproduktion spezifischer MMPs führt zu verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen. Aktiv lösliche MMPs werden für die Entwicklung von MMP-hemmenden Therapeutika benötigt. Beimpfen Sie eine einzelne isolierte Kolonie von pET His-tag pro MMP-3 katalytischen Domänentransformanten aus einer LB-Ampicillin-chloramphenicol-resistenten Platte in fünf Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistenten Medien bei 37 Grad Celsius.Speichern Sie Aliquots aus jeder Kultur und bereiten Sie 40% Glycerinvorräte vor. Beimpfen Sie einen Ein-Liter-Kolben mit 500 Millilitern LB-Ampicillin-Chloramphenicol-resistentem Medium auf eine optische Dichte von 0,05 bis 0,1 bei 600 Nanometern mit der Übernachtkultur. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern zu mehreren Zeitpunkten, typischerweise für drei bis vier Stunden, bis sie zwischen 0,4 und 0,6 fällt.Induzieren Sie die Kulturen mit einem molaren IPTG-Stamm zu einer Endkonzentration von einem Millimolaren. Im 37-Grad-Shaker weitere drei bis vier Stunden inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen in 250-Milliliter-konischen Flaschen bei 13.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten und wiederholen Sie sie, bis die Kulturen vollständig pelletiert sind.Fügen Sie drei Milliliter Lysepuffer pro Gramm Pellet hinzu und suspendieren Sie das Pellet durch Vortexen oder Pipettieren. Fügen Sie 1,25 Milliliter 10% Volumengewicht Natriumdesoxycholat pro Liter Kultur hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter DNase I pro Liter Kultur hinzu.Bei Raumtemperatur 30 Minuten bei 150 U/min schütteln. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Überstand.Resuspendiert das Pellet in 100 Milliliter pro Liter Kultur des Einschlusskörperpuffers durch Pipettieren nach oben und unten. Bewahren Sie die Proben während der Beschallung auf Eis auf, um eine Überhitzung zu vermeiden. Beschallen Sie jede Probe für sechs Zyklen von 15 Sekunden, eine Ausgabe von fünf und einen Puls von 50%.Die Proben werden 10 Minuten lang bei 13.000 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Überprüfen Sie das Pellet. Wenn das Pellet kompakt ist, entsorgen Sie den Überstand.Resuspendiert jedes Pellet aus einer Ein-Liter-Kultur und fünf Milliliter Solubilisierungspuffer. Inkubieren Sie mindestens 30 Minuten auf Eis, damit die Proteine auflösen können. Zentrifen Sie die Zellen für 10 Minuten bei 13.000 mal G bei vier Grad Celsius.Wenn sich das Pellet nach der Zentrifugation bildet, gießen Sie den Überstand in ein separates konisches 50-Milliliter-Rohr. Resuspendiert das Pellet in weiteren fünf Millilitern Solubilisierungspuffer pro Liter Kultur durch Pipettieren auf und ab. Zentrifuge für 10 Minuten bei 13.000 g und vier Grad Celsius.Als nächstes ziehen Sie die Überstände. Entsorgen Sie das Pellet oder lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für zusätzliche Beschallung. Gegen HT-Waschpuffer leeren und den A280 der ersten Waschfraktion aufzeichnen.Wiederholen Sie dies mit anderen Brüchen, bis sich A280 dem Ausgangswert nähert. Sofort His-markierte Proteine durch Zugabe von fünf Millilitern HT-Elutionspuffer eluieren. Sammeln Sie den Durchfluss bei 0,5 bis einem Milliliter Fraktionen in Mikrofugenröhrchen, die mit HT-Elution gekennzeichnet sind.Messen Sie den A280 der Elutionsfraktion. Wenn der A280 größer als 0,3 Milligramm pro Milliliter ist, verdünnen Sie die Fraktion mit HT-Gleichgewichtspuffer. Tauchen Sie die eluierten MMP-Fraktionen in Dialyseschläuche in einen Liter Dialysepuffer ein und rühren Sie den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius.Auf einen Liter Dialysepuffer zwei geben und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Als nächstes auf einen Liter Dialysepuffer drei übertragen und den Schlauch und seinen Inhalt auf einer magnetischen Rührung für nicht weniger als acht Stunden bei vier Grad Celsius rühren. Geben Sie die Probe in einen geeigneten Behälter und kennzeichnen Sie sie als gewähltes MMP.Untersuchen Sie das Rohr auf Niederschlag. Fügen Sie pro Milliliter Aliquot von einem Milligramm pro Milliliter MMP 50 Mikroliter 20 millimolar APMA hinzu, um eine endgültige APMA-Konzentration von einem Millimolar zu erreichen. Wenn sich ein Niederschlag bildet, zentrifugieren Sie ihn mit maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Lagern Sie den Überstand in einem 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das mit aktiviertem MMP gekennzeichnet ist. Entsorgen Sie den Niederschlag in einen für APMA-Abfälle gekennzeichneten Behälter. SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die His-Tag-Reinigungselutionsfraktionen der katalytischen Domäne His-tag pro MMP-3 von BL21 DE3-Zellen in R2DP-Zellen zu vergleichen.Die ersten acht Elutionsfraktionen der His-markierten MMP-Katalytikdomäne und BL21 DE3-Zellen zeigten weniger Protein als die in der His-markierten MMP-Katalytikdomäne in R2DP-Zellen. Es werden die induzierten, gefalteten, konzentrierten, aktivierten und entsalzten Fraktionen von MMP3-CD- und R2DP-Zellen gezeigt. Bei der Aktivierung beträgt das Molekulargewicht des aktivierten MMP-3-CD-Bandes etwa 20 Kilodalton, im Gegensatz zum His-markierten Zymogen, das bei etwa 30 Kilodalton verbleibt.Beim Zentrifugieren von Zelllysaten sind Pellets möglicherweise nicht kompakt. Wenn das passiert, beschallen Sie mehr und zentrifen Sie länger. Bei der Rekonzentration des Proteins kann es zu Ausfällungen kommen.Lösen Sie es in einem Lösungsvermittlerpuffer auf und wiederholen Sie den Vorgang. Das hier beschriebene Verfahren bietet eine detaillierte Methode zur löslichen Expression aktiver menschlicher MMPs, die schließlich verwendet werden kann, um den molekularen Mechanismus der enzymatischen Aktivität von MMP zu verstehen. Alternative Proteinreinigungsmethoden wie FPLC können an gereinigten MMP-Proteinen durchgeführt werden.

bacterial-expression-purification-human-matrix-metalloproteinase-3

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Mama ist eine einzigartige Magnetosom assoziierten Protein, das nachweislich in Magnetosomen Aktivierung beteiligt sein sollte. Hier präsentieren wir die Aufreinigungsprotokolls von Mama Deletionsmutante (MamAΔ41)...

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Quelle: Becker, B., et al. Ein einfacher, fluoreszenzbasierter Reporter-Assay zur Identifizierung zellulärer Bestandteile, die für den Transport von Ricintoxin A-Kette (RTA) in Hefe benötigt werden. J. Vis. Exp. (2017).Dieses Video demonstriert die Reinigung eines polyhistidin-markierten rekombinanten Proteins mittels nickelbasierter Affinitätschromatographie. Es beschreibt wichtige Schritte, darunter bakterielle Lyse durch Sonikation, Klärung und Filtration des Lysats sowie selektive Bindung...

 Eine Affinitätschromatographietechnik zur Reinigung eines rekombinanten bakteriellen Proteins

Dieses Video zeigt eine Technik zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern aus dem Kulturüberstand, der aus einer Antikörper-produzierenden Zellkultur gewonnen wurde. Bei diesem Verfahren wird eine Matrix aus vernetzten Agarosekügelchen mit konjugiertem Protein A verwendet, das die Antikörper im Überstand auf den Kügelchen immobilisiert und so eine effektive Trennung von Verunreinigungen ermöglicht. Durch die Anwendung eines Elutionspuffers mit niedrigem pH-Wert wird die...

Eine Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Anreicherung von EZM-Proteinen aus Geweben oder Tumoren und zur Deglykosylierung und Verdauung der mit EZM angereicherten Präparate zu Peptiden, um ihre Proteinzusammensetzung durch Massenspektrometrie zu analysieren.

Anreicherung von extrazellulären Matrixproteinen aus Gewebe und Verdauung in Peptide für Massenspektrometrie-Analyse

Dies ist ein schnelles, kosteneffizientes Protokoll für die Herstellung von sekretierten, glykosylierten Säugetierproteinen und die anschließende einstufige Aufreinigung mit ausreichenden Ausbeuten an homogenem Protein für die Röntgenkristallographie und andere biophysikalische Studien.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl– Kanäle aktiviert.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Tischplatte immobilisiert Metall Affinität Chromatographie Reinigung und anschließende Wiederherstellung der ein Polyhistidine markiert, nicht-Häm-Eisen bindende Dioxygenase für grundständige Lehre Labor geeignet.

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur rekombinanten Herstellung des humanen Myosin-7a-Holoenzyms unter Verwendung des MultiBac-Baculovirus-Systems und zur Untersuchung seiner Motilität unter Verwendung eines maßgeschneiderten In-vitro-Filament-Gliding-Assays.

MultiBac-Systembasierte Aufreinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanem Myosin-7a

Erfahren Sie die bakterielle Expression und Affinitätschromatographie der humanen MMP-3 in E. coli. Diese Methode liefert lösliches, aktives Protein für therapeutische Anwendungen und MMP-Inhibitor-Entwicklung.

Bakterielle Expression und Aufreinigung der humanen Matrix-Metalloproteinase-3 mittels Affinitätschromatographie

Weitere Videos entdecken